響應(yīng)曲面優(yōu)化茶樹花飲料發(fā)酵工藝

周 潔,劉忠英,范靜怡,周倩倩,崔繼來*

(1. 信陽(yáng)師范大學(xué)a. 生命科學(xué)學(xué)院b. 河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 信陽(yáng) 464000;2. 貴州省茶葉研究所, 貴州 貴陽(yáng) 550000)

0 引言

茶樹花是茶樹生長(zhǎng)過程中重要的副產(chǎn)物,長(zhǎng)久以來被認(rèn)為是茶葉生產(chǎn)過程中的“廢料”。茶樹花年產(chǎn)量約為3000～12 000 kg/hm2,因此我國(guó)每年能收獲超過40 億kg的茶樹花,并且去除茶樹花能提高第二年茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)茶樹花不僅具有令人愉悅的揮發(fā)性物質(zhì)[2-3],且所含揮發(fā)性物質(zhì)的種類多于茶葉[4]。梅鑫等[5]從白色茶樹花和紫色茶樹花中共鑒定出152種揮發(fā)性代謝物。陳麗華等[6]從秋季茶樹花中鑒定出45種香氣組分。茶樹花中有些揮發(fā)性物質(zhì)的含量高于茶葉,如1-苯基乙醇在茶樹花中富集,而在茶葉中微量存在[4]。茶樹花中還含有很多與茶葉相似的生物活性成分,如茶多酚[7-8]、茶多糖[9-10]、氨基酸[1, 11-12]等。茶樹花中含有和茶葉中含量相當(dāng)?shù)牟瓒喾覽11, 13],但不同品種茶樹花之間差異較大[14]。研究者還發(fā)現(xiàn)水解單寧[15]、茶皂苷[16]、茶多糖[17]、有機(jī)酸和氨基酸[18]等生物活性成分在茶樹花中的含量高于茶葉。如茶樹花中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量豐富,是茶葉中含量的數(shù)倍[19]。茶樹花中甜味氨基酸含量比例最高,鮮味氨基酸含量隨著開花程度而逐漸升高,苦味氨基酸含量則以花蕾期為最高,開花期最低[20]。這些物質(zhì)具有保護(hù)腸胃[21]、降血糖[22]、降血脂[23]、抗氧化[24]、抗炎[25]、抗癌[26-28]等功效。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)還表明,茶樹花提取物對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性[29]。因此,茶樹花具有作為茶樹第二資源開發(fā)利用的潛力。2013年衛(wèi)生部批準(zhǔn)茶樹花為新資源食品,2014年中國(guó)國(guó)際茶樹花研發(fā)中心在浙江大學(xué)成立。目前,關(guān)于茶樹花開發(fā)利用的研究已有不少,分布在食品[30-33]、醫(yī)藥[34-35]、保健品以及日化品[36]等相關(guān)行業(yè)。

2007年日本率先研發(fā)出茶樹花飲料[37]。截止2020年12月,在中國(guó)知網(wǎng)上查詢關(guān)于茶樹花的專利共有152項(xiàng),其中涉及茶樹花飲料的有25項(xiàng),但未見有單獨(dú)研究茶樹花飲料的。本文在已有研究的基礎(chǔ)上,僅以茶樹花作為研究對(duì)象,參照其他果樹植物的發(fā)酵工藝[38-42],從酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌中尋找最優(yōu)菌種,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),再通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,獲得風(fēng)味最佳的茶樹花發(fā)酵飲料。通過分析發(fā)酵飲料中主要生化成分的含量及抗氧化能力,對(duì)茶樹花發(fā)酵飲料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹花,2018年冬季采摘于貴州省湄潭縣京貴茶樹花產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司的茶園基地,烘干待用;白砂糖,市售;安琪高活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;川秀乳酸菌、川秀雙歧桿菌,北京川秀科技有限公司。

甲醇、乙腈(色譜級(jí)),美國(guó)TEDIA試劑公司;冰乙酸(色譜級(jí)),天津市大茂化學(xué)試劑廠;沒食子酸(Gallate,GA)標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素(Catechin,C)標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素(Epicatechin,EC)標(biāo)準(zhǔn)品、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallic acid ester,ECG)標(biāo)準(zhǔn)品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG) 標(biāo)準(zhǔn)品、茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品,中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH),福州飛凈生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VIS-7220型可見分光光度計(jì),北京瑞利分析儀器有限公司;安捷倫1260型高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫科技公司;LMQ C-50E型高壓滅菌鍋,山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;LK-69SNJ型酸奶機(jī),河南綠科電器科技有限公司;KQ-1000KDE型高功率數(shù)控超聲清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

茶花→粉碎→浸提→抽濾→調(diào)味→殺菌→接種→發(fā)酵→發(fā)酵飲料。

粉碎:植物粉碎機(jī)粉碎,過篩;浸提:100 ℃超聲浸提10 min;抽濾:趁熱真空抽濾得到濾液并定容;調(diào)味:浸提液冷卻后,加入白砂糖,調(diào)節(jié)味道;殺菌:脫脂棉封口,置于高壓滅菌鍋內(nèi),120 ℃滅菌30 min;接種:浸提液滅菌后冷卻,加入0.5 g酵母粉,接種量0.25%;發(fā)酵:將接種后的浸提液封口,放入發(fā)酵箱中恒溫發(fā)酵。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

菌種的選擇:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),料液比1/50 g·mL-1,加糖量6%,分別加入0.25%酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌,在40 ℃下發(fā)酵40 h,感官評(píng)價(jià)獲得最優(yōu)菌種。

料液比的選擇:調(diào)整料液比分別為1/30、1/40、1/50、1/60、1/70 g·mL-1,加糖量6%,加入0.25%的乳酸菌,在40 ℃下發(fā)酵40 h,感官評(píng)價(jià)獲得最優(yōu)料液比。

加糖量的選擇:料液比1/60 g·mL-1,調(diào)整加糖量分別為4%、5%、6%、7%、8%,加入0.25%的乳酸菌,在40 ℃下發(fā)酵40 h,感官評(píng)價(jià)獲得最優(yōu)加糖量。

發(fā)酵溫度的選擇:料液比1/60 g·mL-1,加糖量6%,加入0.25%的乳酸菌,調(diào)整發(fā)酵溫度分別為30、35、40、45、50 ℃,發(fā)酵40 h,感官評(píng)價(jià)獲得最優(yōu)發(fā)酵溫度。

發(fā)酵時(shí)間的選擇:料液比1/60 g·mL-1,加糖量6%,加入0.25%的乳酸菌,發(fā)酵溫度35 ℃,調(diào)整發(fā)酵時(shí)間分別為20、30、40、50、60 h,感官評(píng)價(jià)獲得最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3 響應(yīng)曲面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果上,以料液比(A,g·mL-1)、加糖量(B,%)、發(fā)酵溫度(C,℃)、發(fā)酵時(shí)間(D,h)為自變量,以審評(píng)得分為響應(yīng)值,根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design,CCD),采用Design-Expert 12軟件進(jìn)行4因素5水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)水平編碼見表1。

表1 中心組合試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 成分分析

按照《GB/T 8313—2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》進(jìn)行茶多酚、兒茶素、咖啡堿測(cè)定。(1)茶多酚的測(cè)定:吸取發(fā)酵液1 mL,加入5.0 mL 10%福林酚試劑搖勻,反應(yīng)5 min,然后加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,室溫下放置60 min,于765 nm處測(cè)得吸光度,同時(shí)建立基于沒食子酸的茶多酚定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算茶樣中茶多酚含量。(2)兒茶素、咖啡堿的測(cè)定:吸取飲料成品過0.45 μm無機(jī)濾膜,采用高效液相色譜分析兒茶素和咖啡堿含量。

采用《GB/T 8314—2013 茶游離氨基酸總量的測(cè)定方法》進(jìn)行游離氨基酸測(cè)定。吸取發(fā)酵液1 mL注入25 mL比色管,加入0.5 mL pH8.0磷酸緩沖溶液和0.5 mL 2%茚三酮溶液,在沸水浴中加熱15 min,冷卻后加水定容至25 mL。放置10 min后于570 nm處測(cè)得吸光度,以空白試劑為參比測(cè)定吸光度后,對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線得出茶葉中游離氨基酸的含量。

自由基清除率(R)測(cè)定,用無水乙醇配置0.2 mmol/L的DPPH溶液,將發(fā)酵液稀釋2倍作為供試液。吸取供試液5 mL,加入0.2 mmol/L的DPPH溶液5 mL,搖勻后,于黑暗處放置30 min,在517 nm處測(cè)得A樣品吸光值(xA樣品);吸取供試液5 mL,加入無水乙醇5 mL,在517 nm處測(cè)得A空白吸光值(xA空白);吸取0.2 mmol/L的DPPH溶液5 mL,加入無水乙醇5 mL,在517 nm處測(cè)得A對(duì)照吸光值(xA對(duì)照)。

1.3.5 色譜條件

采用安捷倫C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×50 mm),流速保持1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm,進(jìn)樣量為10 μL,流動(dòng)相A(乙腈90 mL+10 mg/mL EDTA-2Na 2 mL+冰乙酸20 mL定容至1000 mL);流動(dòng)相B(乙腈800 mL+10 mg/mL EDTA-2Na 2 mL+冰乙酸20 mL定容至1000 mL)。洗脫梯度:100% A相保持18 min,至25 min期間勻速降低至68%,保持10 min,結(jié)束。

1.3.6 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

參照茶葉審評(píng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),邀請(qǐng)5位感官審評(píng)人,根據(jù)表2對(duì)茶樹花發(fā)酵飲料的色澤、香氣、滋味、質(zhì)地進(jìn)行感官審評(píng),色澤2.5分、香氣2.5分、滋味3分、質(zhì)地2分,總分10分,最后取平均分。

表2 感官審評(píng)打分表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 菌種的選擇

設(shè)定料液比1/50 g·mL-1、加糖量6%,滅菌后,分別加入0.25%酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌,40 ℃下發(fā)酵40 h,進(jìn)行感官審評(píng)。

由表3可知,酵母菌組色澤黃亮澄清,有明顯酒精味,入口酸苦、辛辣,質(zhì)地均勻,口感不好,與研究團(tuán)隊(duì)另一組研究結(jié)果相吻合[40],綜合得分3.8分。乳酸菌組花香中帶甜香,且有明顯茶香,滋味較濃、尚醇,有回甘,質(zhì)地均勻,綜合得分7.4分。雙歧桿菌組花香中帶甜香,茶香淡薄,滋味淡、苦澀味重,質(zhì)地均勻,綜合得分6.7分。不同菌種對(duì)茶樹花發(fā)酵液影響為乳酸菌>雙歧桿菌>酵母菌,乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品色澤紅亮、香氣較好、滋味濃、尚醇、質(zhì)地均勻,綜合得分最高。因此選取乳酸菌作為最佳發(fā)酵菌種。

表3 不同菌種對(duì)感官評(píng)價(jià)得分的影響

2.1.2 料液比的選擇

不同料液比組合實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵液色澤均為紅亮帶棕,料液比為1/60 、1/70 g·mL-1時(shí),色澤更加透亮。料液比1/30 、1/40 g·mL-1時(shí),香氣過于濃郁,讓人不適,滋味較苦澀;料液比1/50 g·mL-1時(shí)香氣適宜,滋味略苦澀;料液比1/60 g·mL-1時(shí)香氣適宜,滋味微甜適中,口感最好,綜合得分最高;料液比1/70 g·mL-1時(shí)香氣、滋味較淡薄。因此選取料液比1/60 g·mL-1作為最佳料液比(圖1)。

圖1 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品感官審評(píng)得分的影響

2.1.3 加糖量的選擇

不同加糖量的發(fā)酵液顏色均為紅棕色透亮,隨著加糖量的增加,香氣和滋味中的甜味逐漸增強(qiáng),在8%時(shí)呈現(xiàn)過甜偏膩。加糖量為6%時(shí),香氣為甜花香帶茶香,滋味尚醇、濃厚度適中,口感最佳。因此選取6%作為最佳加糖量(圖1)。

2.1.4 發(fā)酵溫度的選擇

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液色澤沒有明顯影響。發(fā)酵溫度較低,發(fā)酵液香氣為甜花香,澀味較重;發(fā)酵溫度偏高,甜香、花香均有所減弱,滋味淡薄。在發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí),發(fā)酵液色澤紅棕透亮,甜花香帶茶香,滋味尚醇、甜度適中,口感最佳,綜合得分最高。因此選取35 ℃作為最佳發(fā)酵溫度(圖1)。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間的選擇

發(fā)酵時(shí)間較短時(shí),甜香明顯,花香淡,發(fā)酵液澀味重,滋味協(xié)調(diào)度差;延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間能改善香氣、滋味;發(fā)酵60 h時(shí),香氣變淡,滋味尚好。在發(fā)酵40 h和50 h時(shí)能得到較好的發(fā)酵飲料,發(fā)酵40 h綜合得分最高。因此選取40 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間(圖1)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)最佳條件,以料液比1/60 g·mL-1、加糖量6%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間40 h為中心點(diǎn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表4所示。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

將表4的結(jié)果通過Design-Expert 12軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到審評(píng)得分(Y)的二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y=-66.002 9+0.494 6A+3.635 4B+

1.674 2C+0.426 7D+0.003 1AB-

0.003 8AC-0.000 3AD-0.021 3BC-

0.006 3BD-0.000 0CD-0.003 6A2-

0.109 9B2-0.017 1C2-0.004 0D2。

表5是方差分析表。從表5可知,該回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1257>0.05)。該二次模型多元相關(guān)系數(shù)R2=0.972 0,調(diào)整決定系數(shù)R2=0.944 0,預(yù)測(cè)R2=0.841 2,說明該模型擬合度較好,能較好地反映試驗(yàn)結(jié)果。A、B、D、AC、BC、A2、B2、C2、D2的P值小于0.01,表明料液比、加糖量、發(fā)酵時(shí)間、料液比與發(fā)酵溫度、加糖量與發(fā)酵溫度之間的交互作用對(duì)審評(píng)得分的影響極顯著。BD的P值小于0.05,表明加糖量和發(fā)酵時(shí)間之間的交互作用對(duì)審評(píng)得分的影響顯著。根據(jù)F值,單因素對(duì)茶樹花飲料發(fā)酵的審評(píng)得分影響次序?yàn)锳>B>D>C。

表5 回歸模型方差分析

圖2分別是四因素兩兩交互作用對(duì)茶樹花發(fā)酵液審評(píng)得分的三維響應(yīng)面圖,直觀反映了各因素間的相互作用。

注：a)料液比與加糖量;b)料液比與溫度;c)料液比與時(shí)間;d)加糖量與溫度;e)加糖量與時(shí)間;f)溫度與時(shí)間

以感官評(píng)價(jià)得分為響應(yīng)值,在優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,利用Design-Expert軟件得到的最佳組合條件為料液比1/53.7 g·mL-1、加糖量6.4%、發(fā)酵溫度35.1 ℃、發(fā)酵時(shí)間41.4 h。在此基礎(chǔ)上的理論感官評(píng)價(jià)得分可達(dá)到8.7分。根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為料液比1/54 g·mL-1、加糖量6.5%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間41.5 h。

注：**為差異極顯著,P<0.01;*為差異顯著,P<0.05。

2.3 優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證

2.3.1 感官評(píng)價(jià)得分結(jié)果分析

對(duì)最佳優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,得到的三組發(fā)酵飲料感官評(píng)價(jià)得分分別是8.7、8.7、8.6分,平均審評(píng)得分為8.7分,與預(yù)測(cè)值8.7吻合,說明得到的回歸模型和實(shí)際情況擬合度較好。

2.3.2 成分測(cè)定結(jié)果分析

采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中茶樹相關(guān)成分的檢測(cè)方法,對(duì)茶樹花發(fā)酵液發(fā)酵前后的幾種主要成分進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)游離氨基酸含量由1.91%上升到2.15%,咖啡堿含量由0.59%下降到0.52%,茶多酚含量由5.85%下降到5.06%,兒茶素總量由1.46%下降到1.26%,DPPH自由基清除率由發(fā)酵前的91.89%下降到85.47%。

3 結(jié)束語

茶樹花中含有與茶葉相同的化合物,與直接飲茶相比,茶樹花發(fā)酵飲料有明顯的茶香、花香和甜香。茶樹花中天然含有的多酚類物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì),為研究茶樹花飲料提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),是提升茶樹花附加值的一個(gè)先天優(yōu)勢(shì)。

本研究以茶樹花作為原料,通過相應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵工藝,得到最佳發(fā)酵工藝為料液比1/54 g·mL-1、加糖量6.5%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間41.5 h。在此工藝條件下,茶樹花飲料感官品質(zhì)最佳。通過對(duì)比茶樹花發(fā)酵液發(fā)酵前與發(fā)酵后幾種主要有效成分含量,發(fā)現(xiàn)游離氨基酸含量略有升高,咖啡堿含量略微下降,茶多酚、兒茶素總量在發(fā)酵前后均有下降,與DPPH抗氧化測(cè)定結(jié)果一致。這些變化表明在茶樹花發(fā)酵液保持原有功能活性的基礎(chǔ)上,發(fā)酵工藝對(duì)茶樹花飲料的滋味有改善作用,但是變化的機(jī)制以及新形成的產(chǎn)物需要進(jìn)一步研究。綜上,本研究?jī)?yōu)化了茶樹花發(fā)酵工藝,為茶樹花的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定理論依據(jù)。