輻照植物性中藥材熱釋光鑒定方法研究

馬雙,李樂,王芳,郗存顯

(1.重慶化工職業(yè)學院,重慶 400112;2.重慶海關(guān)技術(shù)中心,重慶 400020)

1 概述

通過電離輻射(一般指60Coγ射線、加速器產(chǎn)生的電子束或X射線)對食物、中藥材等進行輻照處理,通過電離輻射可消滅產(chǎn)品中的細菌和寄生蟲,起到保鮮防腐、殺菌、殺蟲、延緩成熟、抑制發(fā)芽和提高衛(wèi)生質(zhì)量的目的。輻照滅菌的原理類似于利用太陽光殺菌,是一種高效、安全的殺菌技術(shù)[1-3]。目前,世界上沒有發(fā)生因食用輻射食物引起的人類健康問題的情況報道。用輻照技術(shù)滅菌的中藥材主要是在保存過程中易產(chǎn)生霉變的中藥,由于輻照具有很好的滅菌效果,而且滅菌時間短,因此反復(fù)輻照、超劑量輻照的現(xiàn)象時常發(fā)生。按照GMP標準,藥材在生產(chǎn)過程需要嚴格進行質(zhì)量控制,再用合適的滅菌方法進行處理。但是,由于中藥的品種很多,藥材生產(chǎn)過程難以實現(xiàn)規(guī)?；僮?有些生產(chǎn)單位為了節(jié)約成本,放松了對生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制,導(dǎo)致產(chǎn)品微生物超標嚴重,這時候他們往往會采取大劑量輻照來殺滅微生物,致使輻照劑量遠遠大于安全劑量,有的甚至會使部分中藥材中的有效或功效成分含量降低,較少或失去部分藥用價值,給消費者的切身利益造成了嚴重的影響,甚至會危害到消費者的健康。

《鈷60輻照中藥滅菌劑量標準》(內(nèi)部試行)的通知(衛(wèi)藥發(fā)〔1997〕38號),明確規(guī)定鈷60輻照僅僅作為中藥滅菌的輔助手段,通知還對不同中藥材生產(chǎn)過程中輻照劑量作了進一步明確規(guī)定,防止輻照滅菌濫用。198種中藥材、70種中成藥允許進行輻照滅菌, 5種中藥材品種允許使用低劑量(3 kGy)輻照滅菌, 2種中藥材品種不允許輻照滅菌?！稑藴省分羞€明確規(guī)定,未列明在《通知》中的中藥品種是原則上不允許使用輻照進行滅菌。

目前我國現(xiàn)行標準中熱釋光法鑒定輻照產(chǎn)品的方法現(xiàn)有農(nóng)業(yè)部的兩個行業(yè)標準,分別是NY/T 1390—2007《輻照新鮮水果、蔬菜熱釋光鑒定方法》和NY/T 1207—2006《輻照香辛料及脫水蔬菜熱釋光鑒定方法》,缺少對中藥材是否經(jīng)過輻照的鑒定方法。為了滿足中藥材質(zhì)量檢驗監(jiān)管需要,建立適用中藥材輻照的鑒定方法非常有必要和緊迫。

2 輻照鑒定技術(shù)研究進展

目前輻照鑒定的方法主要化學法、物理法、發(fā)光法和電子自旋法等,但由于檢測原理不同,具有各自的特點和局限性。

2.1 化學法

1)2-烷基-環(huán)丁酮法:經(jīng)過不同劑量伽馬射線輻照的脂質(zhì)樣品會生成不同量的2-烷基-環(huán)丁酮,該物質(zhì)可以作為輻照的指標。這種方法適用于脂肪含量較高的脂肪、黃油、油和堅果等樣品[4-5]。

2)鄰酪氨酸法:經(jīng)過輻照的樣品蛋白質(zhì)的側(cè)鏈會發(fā)生變化,產(chǎn)物之一就是與鄰酪氨酸類似的結(jié)構(gòu)。通過測定樣品中鄰酪氨酸類似結(jié)構(gòu)的含量的變化情況,可以判斷樣品是否經(jīng)過輻照。該方法適用于含有豐富蛋白質(zhì)的肉類、魚類、豆類等樣品。

3)DNA法:經(jīng)過輻照的樣品中,DNA的堿基會受到損傷而導(dǎo)致鏈斷裂。通過測定樣品中DNA鏈斷裂的量,可以判斷樣品是否經(jīng)過輻照。該方法適用于含有豐富DNA的肉類、魚類、蔬菜等樣品[6]。

4)過氧化物法:經(jīng)過輻照的樣品會產(chǎn)生過氧化物。通過測定樣品中過氧化物的含量的變化情況,可以判斷樣品是否經(jīng)過輻照。該方法適用于含有豐富脂肪和油脂的堅果、植物種子等樣品。

2.2 物理法

1)黏度法:食品經(jīng)過輻照后一些高分子物質(zhì)會發(fā)生降解,從而導(dǎo)致黏度降低。通過測定食品的黏度變化情況,可以判斷食品是否經(jīng)過輻照。該方法適用于含有豐富高分子物質(zhì)的淀粉、果醬、果汁等樣品。

2)電阻抗法:這是一種基于物理性質(zhì)的檢測方法。樣品經(jīng)過輻照會失去部分水分從而導(dǎo)致電阻抗發(fā)生變化。通過測定樣品的電阻抗,可以判斷樣品是否經(jīng)過輻照。該方法適用于含有豐富水分的肉類、魚類、蔬菜等樣品。

2.3 發(fā)光法

1)熱釋光法:含有硅酸鹽物質(zhì)的樣品經(jīng)過電離輻照,硅酸鹽物質(zhì)中的晶格缺陷會俘獲自由電子并儲存能量。加熱后,會從晶格缺陷中逸出,釋放出能量并發(fā)出熱釋光。通過對比熱釋光的比值大小,可以判斷食品是否經(jīng)過輻照[7]。

2)化學發(fā)光法:樣品經(jīng)過輻照后會產(chǎn)生某些化學反應(yīng),并生成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物。當這些產(chǎn)物回到基態(tài)時,會釋放出光子。通過測量釋放出的光子數(shù)量,可以判斷食品是否經(jīng)過輻照。

2.4 電子自旋共振法(ESR法)

樣品經(jīng)過輻照后,硬組織中的自由基會形成長壽命的自由基,這些自由基可以通過ESR技術(shù)進行檢測。通過檢測自由基的數(shù)量,可以判斷食品是否經(jīng)過輻照。該方法適用于含有豐富硬組織的骨頭、硬果殼等樣品[8]。

目前,熱釋光(TLD)法可應(yīng)用于所有能分離出硅酸鹽礦物質(zhì)的樣品,應(yīng)用范圍最為廣泛,目前筆者未見國內(nèi)(外)文獻報道輻照中藥材的熱釋光鑒定方法。

3 材料與方法

3.1 材料與試劑

多鎢酸鈉溶液(2 g/mL):將250 g多鎢酸鈉溶于150 mL水中(美國GEO LIQUIDS,INC.);鹽酸:1 mol/L;氨水:1+11(體積比);丙酮,分析純;尼龍布。

3.2 儀器與設(shè)備

熱釋光分析儀(HARSHAW 3500 TLD,美國Thermofisher Scientific公司) ;超聲波清洗器(AS20500BDT,天津奧特賽恩斯儀器有限公司);離心機(sigma 3-30K,德國sigma公司);不銹鋼樣品盤,直徑1 cm,高0.4 cm(使用前在水中超聲清洗,再使用丙酮中超聲清洗兩到三次,烘干后儲藏在無塵的環(huán)境);旋渦振蕩器(XH-B,江蘇姜堰市康健醫(yī)療用品有限公司);烘箱(FD115,德國Binder公司)。

3.3 測定步驟

3.3.1 提取硅酸鹽

稱取20～50 g樣品到燒杯中,加入100～200 mL水,超聲提取5 min。用250 μm的尼龍濾布過濾至燒杯中,用水沖洗濾布,棄去殘渣。靜置5 min,傾去最上層,剩余部分轉(zhuǎn)移到150 mL離心管中,3 000 r/min離心1 min。傾去水層,再加入水清洗,離心,至水溶液澄清,最后用少量的水將沉淀物轉(zhuǎn)移到10 mL的離心管中,加水至10 mL,渦旋振蕩后,3 000 r/min離心2 min,棄去水層,加入5 mL多鎢酸鈉溶液,超聲5 min,將最上層的有機物和中間的多鎢酸鈉溶液去除。如果仍有有機物殘留,重復(fù)上述過程。在離心管中加水3 000 r/min離心2 min,傾去水層,重復(fù)一次。

加入1 mol/L鹽酸1～2 mL清洗沉淀,振搖均勻后靜置10 min。加入與鹽酸等量的氨水溶液中和至中性,加水至滿后靜置。傾去上層后水清洗殘留的礦物質(zhì)兩次。再加入3 mL丙酮,振搖使其充分混合。如果丙酮混濁,再用丙酮進行清洗直至澄清。

將清洗干凈的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)移至不銹鋼盤上,置于50 ℃左右的烘箱中烘干過夜。

3.3.2 熱釋光的測量

3.3.2.1 儀器升溫條件

起始溫度:70 ℃;升溫速率:6 ℃/s;最終溫度:400 ℃。

3.3.2.2 熱釋光曲線1的測量

將附有硅酸鹽礦物質(zhì)的不銹鋼盤放入熱釋光儀中,按上述條件進行測量?？傻玫綗後尮馇€,通過計算得到熱釋光曲線面積積分值,用G1表示。

3.3.2.3 熱釋光曲線2的測量

將上述測量過的附有硅酸鹽礦物質(zhì)的鋼盤用1 kGy劑量的γ輻射源輻照,置于50 ℃烘箱中過夜,于熱釋光儀按上述條件再次進行測量?？傻脽後尮馇€,通過計算得到熱釋光曲線面積積分值,用G2表示。

4 結(jié)果與分析

4.1 樣品的熱釋光檢測分析

參照國內(nèi)外中草藥輻照的實際使用劑量,根據(jù)檢測儀器的準確度,設(shè)定凡是輻照劑量在0.10 kGy以上(包括0.10 kGy)的中草藥,判定為輻照過的中草藥;如果接受輻照劑量小于0.10 kGy,則判定該樣品未經(jīng)輻照。所以,當樣品中提取的礦物質(zhì)接受輻照劑量1 kGy后,如果其發(fā)光曲線的峰面積積分值之比G1/G2<0.10,則判定中草藥未經(jīng)輻照,而且比值越小,接受劑量的可能性就越小;G1/G2如果≥0.1,則判定為經(jīng)輻照樣品,輻照劑量越大則比值越大。國內(nèi)外大量的實驗結(jié)果表明該方法判別正確率在95%以上。本實驗室已對上百個樣品進行檢測判斷,準確率為100%。

4.2 試驗條件的優(yōu)化

4.2.1 樣品的制備

該檢測方法需要提取附著于樣品表面的泥土和灰塵,因此基本無需對樣品進行粉碎或切割,除非樣品整體體積過大,難以放入合適的容器中時,可進行簡單的切割,但不能粉碎。如根類樣品夾帶的礦物質(zhì)會多,取樣量20 g就能夠滿足鑒定要求。如果是莖或花,取樣量就要增加到50 g或者更多。

4.2.2 硅酸鹽的提取、凈化

首先水洗超聲的將植物性中藥材表面附著的礦物質(zhì)洗下,通過的濾網(wǎng)或濾布將清洗好的藥材去除,濾網(wǎng)或濾布的孔徑控制在250 μm以上,否則容易將礦物質(zhì)過濾掉。通過反復(fù)的水清洗、離心,去除大部分有機物,但有很少的有機物無法去除,需要采用多鎢酸鈉溶液溶解混勻后離心,離心后樣品分為三層,其中有機物密度最輕,在溶液最上層,需要全部去除干凈;中間為多鎢酸鈉層;最下層為硅酸鹽礦物質(zhì),當有機物不能一次去除完全時,可以再次加入多鎢酸鈉溶液進行離心分離。此時的礦物質(zhì)經(jīng)過水洗后還可能含有一部分碳酸鹽與礦物黏附牢固的有機物,通過加入鹽酸溶液反應(yīng)可去除,再使用丙酮進一步去除殘留的有機物。

4.2.3 熱釋光測定

首次測得硅酸鹽的發(fā)光曲線,得到發(fā)光曲線G1。然后用已知劑量的輻射源(1 kGy)再次照射得到的硅酸鹽,再次讀出發(fā)光曲線,得到發(fā)光曲線G2,通過這兩條曲線面積的積分比值來判斷樣品是否經(jīng)過輻照。對于f=G1/G2的判斷閾值,依據(jù)EN 1788—2001和其他標準普遍認可的f≥0.1作為樣品經(jīng)過輻照的判斷閾值,如果f<0.1,則認為樣品未經(jīng)輻照。

5 樣品的鑒定

根據(jù)植物性中草藥的根、葉、花、果實藥用部分選取人參、甘草、蘇葉、菊花和山楂樣品各分成3份,1份直接按照本文建立的方法進行6個平行的處理分析,另兩份送上海輻照中心接受60Coγ輻照源1.0 kGy劑量和2.0 kGy劑量的輻射后再進行6個平行的處理分析,結(jié)果見表1,人參樣品的熱釋光譜圖見圖1。

由于輻照技術(shù)在實際應(yīng)用過程中,對于消毒殺菌的輻射劑量為1～10 kGy,完全殺菌的輻照劑量更大,為25～50 kGy,因此本方法的驗證最低劑量為1.0 kGy。

表1 實驗室內(nèi)驗證數(shù)據(jù)結(jié)果

圖1 人參樣品的熱釋光譜圖

6 結(jié)論

建立了輻照根、葉、花、果實類中藥材的熱釋光鑒定方法,方法靈敏度高、樣品制備簡單、檢測時間短、準確率高,且不需用參照物?？捎糜谳椪罩兴幉牡亩ㄐ澡b別和藥材市場的有效監(jiān)控。