安徽省銅陵地區(qū)195 例宮頸癌患者宮頸癌組織15種高危人乳頭瘤病毒基因檢測分析

康敏，邢益祥，查風華，趙鐵

安徽省銅陵市人民醫(yī)院病理科，安徽銅陵 244000

宮頸癌（CC）是全球女性第二大最常見的癌癥，僅次于乳腺癌，也是婦女癌癥死亡的第四大原因［1］。近年來，安徽省內(nèi)的CC發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢，年齡呈年輕化趨勢［2］。2020 年11 月17 日，全世界在加速消除CC全球戰(zhàn)略下，首次承諾共同努力消除CC［3］。CC 最常見的病理類型為宮頸鱗狀細胞癌（SCC），其次是宮頸腺癌（ACC）、宮頸未分化癌（UCC）等，是目前惟一一種病因明確的腫瘤，即人乳頭狀瘤病毒（HPV）［4-5］。HPV 分高危和低危，其中高危HPV（HR-HPV）的持續(xù)感染是導致CC 發(fā)生發(fā)展的主要原因［6］。然而研究［7］表明，不同區(qū)域、檢測方法對于不同年齡階段及生活習慣的CC 患者HPV 感染陽性率、亞型及感染模式存在較大差異。本研究采用磁珠法提取安徽省銅陵地區(qū)195 例CC 患者癌組織的石蠟切片中的DNA，用基因擴增芯片技術(shù)對其進行15 種HR-HPV 基因分型的檢測，并分析感染HR-HPV的亞型、模式及年齡分布。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2020年2月—2022年12月在銅陵市人民醫(yī)院就診并經(jīng)病理科診斷的195 例CC 患者癌組織的石蠟標本，均來自安徽省銅陵市所有市縣。所有病理切片均經(jīng)2 位高年資病理醫(yī)生按照第5 版WHO（2020 年）子宮頸腫瘤診斷標準獨立閱片確認。195 例CC 患者中，年齡25～85（53.67 ±11.22）歲，其中25～30 歲2 例、31～35 歲5 例、36～40 歲14 例、41～45 歲19 例、46～50 歲41 例、51～55歲49 例、56～60 歲20 例、61～65 歲12 例、65 歲以上33例；病理類型為SCC 164例，ACC 24例，UCC 7例；全部病例均符合納入標準，即術(shù)前未進行放療、化療，標本蠟塊保存完整，大小合適且含有足量的病變組織。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審批通過，患者對本次研究知情并簽署同意書。

1.2 主要儀器與試劑 石蠟切片DNA 提取試劑盒（磁珠法）購自碩士生物科技股份有限公司，HRHPV 基因分型檢測試劑盒購自上海之江生物科技股份有限公司，全自動核酸提取儀9600A 型號購自江蘇碩士生物科技股份有限公司生產(chǎn)，基因擴增儀SLAN965型號購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3 195 例CC 患者癌組織的石蠟切片HR-HPV 檢測 DNA 的提?。翰捎么胖榉āＪ中g(shù)刀去除多余的石蠟，切取一片10 μm 厚的切片，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管；加入160 μL 蠟劑，激烈渦旋樣本管10 s，56 ℃溫浴3 min；然后加入180 μL 緩沖液AL 和20 μL 百酶K 至樣品中，渦旋重懸樣品，低速瞬時離心；56 ℃水浴60 min直到樣品完全消化，90 ℃水浴60 min，低速瞬時離心；將消化液全部加入到試劑板AT 的第1列中，將加入樣本的試劑板AT 放置在核酸提取儀中，試劑板AT的缺口朝外；最后插入八聯(lián)磁棒套，關(guān)上試驗倉，按下設(shè)置核酸提取程序，并選擇運行；PCR 擴增及HPV 分型檢測嚴格按照說明書進行檢測操作，可檢出15 種HR-HPV，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82。分析入選對象感染模式，感染模式分為單一感染和混合感染（兩種及以上的HR-HPV 感染）。另分析感染HR-HPV患者的年齡分布。

2 結(jié)果

2.1 CC 患者感染HR-HPV 模式 195 例CC 患者中，感染HR-HPV 186 例（陽性率95.38%），其中單一感染率為41.40%、混合感染率為58.60%；164 例SCC 患者中，單一感染率和混合感染率分別為43.40%、56.60%；24 例ACC 患者中，單一感染率和混合感染率分別為27.27%、77.27%；7 例UCC 患者中，單一感染率和混合感染率分別為40.00%、60.00%。

2.2 CC 患者感染HR-HPV 亞型 186 例感染HR-HPV 的CC 患者中，感染亞型位于前四位的分別是HPV16、HPV18、HPV66、HPV39，單一感染率分別為34.94%、9.30%、2.78%、5.88%，混合感染率分別為65.06%、90.70%、97.22%、94.12%。

2.3 CC 患者感染HR-HPV 年齡分布 CC 患者年齡均>25 歲，三個年齡高峰分布分別為46～50 歲、51～55 歲、>65 歲，感染率分別為97.56%、91.84%、100%，其中單一感染率分別為47.50%、37.78%和36.36%，混合感染率分別為52.50%、62.22% 和63.64%。

3 討論

CC雖然嚴重威脅著女性健康和生存率，然而卻是惟一一個可以明確病因的惡性腫瘤［4］。已有研究表明，90%以上的CC 都伴隨著HPV 感染，70%的浸潤性宮頸癌與HPV16、18 等HR-HPV 的持續(xù)感染相關(guān)，因此CC 被認為是感染性疾?。?-6］。然而我國地域遼闊，不同地區(qū)CC 的HPV 感染亞型不盡相同，且同一地區(qū)不同的檢測方法、不同的研究對象也會導致研究結(jié)果不盡相同［7］。研究［8］表明，中國CC 患者最常見的感染亞型是HPV16型、HPV18型及HPV31型。而我國華東地區(qū)宮頸鱗狀細胞癌感染亞型主要是HPV58，其次是HPV16、HPV18［9］；西部地區(qū)CC 患者主要感染亞型是HPV16、HPV18［10］。本研究對象CC 患者均來自銅陵地區(qū)所有市縣，而我院是本市最大地級市綜合三甲醫(yī)院，婦科腫瘤的主要收治單位，故能較客觀、真實、全面反應(yīng)銅陵市CC 患者HPV 感染情況。本研究表明，195 例CC 患者中SCC 患者有164 例，占比84.10%，HR-HPV 總感染率95.38%，其中混合感染率占58.60%，感染的HR-HPV 亞型前四位是HPV16、HPV18、HPV66、HPV39，其單一感染率分別為34.94%、9.30%、2.78%、5.88%，混合感染率分別為65.06%、90.70%、97.22%、94.12%。以往研究［11］表明，安徽地區(qū)健康體檢女性HPV 感染主要亞型分別為HPV52、HPV16、HPV53 和HPV18，而CC患者HPV 感染以HPV16、18、58型為主［12］，銅陵地區(qū)健康女性體檢HPV 感染亞型分別為HPV16、HPV52、HPV58［13］。本研究結(jié)果與過往研究結(jié)果有些不同，可能與地域的差異、研究對象及研究方法的不同有關(guān)。目前全世界范圍內(nèi)上市的三種HPV 疫苗分別為二價HPV 疫苗（含HPV16、18）、四價HPV疫苗（含HPV16、18、11、6）和九價HPV 疫苗（含HPV16、18、6、11、31、33、45、52、58），三種疫苗均不包括本地區(qū)CC 患者最常見感染亞型的HPV66、39，后期科研者可針對本地區(qū)特殊HR-HPV 感染亞型制定特定地區(qū)第二代預防性疫苗及研發(fā)治療性疫苗。

本研究還發(fā)現(xiàn)，銅陵地區(qū)CC患者年齡分布高峰分別為46～50 歲、51～55 歲和>65 歲，HPV 感染率分別為97.56%、91.84%和100%，其中單一感染率分別為47.50%、37.78%和36.36%，混合感染率分別為52.50%、62.22%和63.64%，由此可見，CC 年齡分布主要集中在圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后老年婦女（>65 歲），且以混合感染為主。與以往研究［14］的宮頸上皮內(nèi)病變及CC 患者年齡分布高峰主要在40～44歲和55～59 歲基本相符。原因可能是圍絕經(jīng)期女性性激素不穩(wěn)定導致其生理功能紊亂，免疫功能低下有關(guān)［15］，>65 歲的老年女性身體機能退化，退休后生活閑適，性生活活躍，導致HPV 持續(xù)感染或者再次活躍。本銅陵地區(qū)CC 患者感染HR-HPV 的模式以混合感染為主，以往的研究［16-18］亦表明，多重HR-HPV 感染導致宮頸病變加重的風險高于單型別HPV 感染，增加了CC 前病變的發(fā)生及癌變風險，原因可能是多重感染有利于HPV 整合宿主細胞，并推測多重HPV 感染有望成為以HPV 為基礎(chǔ)的CC 篩查的風險識別因素，筆者推測多重HPV 感染更易導致CC可能與免疫抑制有關(guān)，此推測有待后期進一步研究證實。由于我國推薦接種HPV 疫苗年齡為9～45歲，根據(jù)本研究結(jié)果，相關(guān)部門應(yīng)重視圍絕經(jīng)婦女（>45 歲）及老年婦女（>65 歲）CC 篩查的力度，對于混合感染者應(yīng)給予特別關(guān)注。

總之，銅陵地區(qū)CC患者HR-HPV 感染模式為混合感染，以HPV16、HPV18、HPV66、HPV39 亞型為主，好發(fā)年齡階段為46～50 歲、51～55 歲、>65 歲。建議本區(qū)加強對圍絕經(jīng)期婦女及>65 歲老年女性的CC 篩查，臨床醫(yī)生對于此類人群多重HR-HPV 感染的部分應(yīng)加強關(guān)注，防止進一步發(fā)展為CC，同時針對本研究結(jié)果，有關(guān)部門可考慮針對此類人群及感染HR-HPV 亞型，研發(fā)針對性的特定地區(qū)第二代預防性疫苗，或者是治療疫苗。