人參皂苷Rg3對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響

張 可,李 莉

1.河南省許昌市鄢陵縣中醫(yī)院眼科，許昌 461200；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，鄭州 450000

年齡相關(guān)性白內(nèi)障是一種以晶狀體進(jìn)行性渾濁為特征的致盲性眼病。晶狀體上皮細(xì)胞是晶狀體的一道生物屏障，研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激造成晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致白內(nèi)障的主要機(jī)制之一［1］。人參皂苷Rg3可緩解過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，抑制腎小球系膜細(xì)胞凋亡［2］。人參皂苷Rg3可增強(qiáng)糖尿病腎病大鼠血清中抗氧化酶的活性，抑制腎臟細(xì)胞凋亡［3］。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）信號(hào)通路與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，苦參水提取物通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［4］。柚皮素通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路增強(qiáng)糖尿病小鼠抗氧化反應(yīng)，可降低心肌炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡［5］。本研究通過(guò)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)建立晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討人參皂苷Rg3 對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的緩解作用及其機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；電泳儀（美國(guó)BD 公司）。

1.2 試藥

人參皂苷Rg3（成都曼思特生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；噻唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；AnnexinV-FITC/PI 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Nrf2、Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch like epichlorohydrin related protein 1，Keap1）和HO-1 抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；過(guò)氧化氫（美國(guó)Sigma 公司）。

1.3 細(xì)胞

人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測(cè)人參皂苷Rg3 對(duì)細(xì)胞存活率的影響

將復(fù)蘇后的SRA01/04 細(xì)胞培養(yǎng)于含100 g·L-1胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化傳代，取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，密度為5×104個(gè)·mL-1，接種于96 孔板，每孔200 μL，用質(zhì)量濃度分別為0、10、20、40、80 μg·mL-1的人參皂苷Rg3處理細(xì)胞6 h，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，棄掉培養(yǎng)基，用200 μmol·mL-1過(guò)氧化氫處理12 h，每孔加入MTT 溶液（5 g·L-1） 20 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 溶液200 μL，振蕩混勻，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 處的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，密度為5×104個(gè)·mL-1，接種于96 孔板，每孔200 μL，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將細(xì)胞隨機(jī)分為正常組（培養(yǎng)基中加入DMSO）、氧化損傷組（培養(yǎng)基中加入過(guò)氧化氫200 μmol ·mL-1處理12 h）、人參皂苷Rg3低劑量組（培養(yǎng)基中先加入人參皂苷Rg340 μg·mL-1處理6 h，更換培養(yǎng)基后加入過(guò)氧化氫200 μmol·mL-1處理12 h）和人參皂苷Rg3高劑量組（培養(yǎng)基中先加入人參皂苷Rg380 μg·mL-1處理6 h，更換培養(yǎng)基后加入過(guò)氧化氫200 μmol·mL-1處理12 h），每組設(shè)定3 個(gè)復(fù)孔。按照2.1 項(xiàng)下方法測(cè)定細(xì)胞存活率。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行分組處理，預(yù)冷PBS 清洗3 次，離心后，加入結(jié)合緩沖液500 μL 將細(xì)胞重懸，再加入 Annexin V-FITC和 PI 各5 μL，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.4 氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的檢測(cè)

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行分組處理，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD、MDA 和GSH-Px 含量。

2.5 蛋白印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況

取第3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行分組處理，預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞3 次，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃以12 000 r min-1離心10 min，收集上清液，用二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度，加入5 倍量上樣緩沖液，煮沸變性。每孔加入蛋白樣品20 μL，用SDS-PAGE 電泳凝膠，設(shè)定恒壓120 V電泳1.5 h，設(shè)定恒流0.3 A 進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，用TBST 洗膜3 次，室溫封閉1 h，加入Nrf2、Keap1、HO-1 和GAPDH 一抗（1∶1 000），在4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3 次，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，滴加發(fā)光液顯色，用Image J 分析條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg3對(duì)細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率隨人參皂苷Rg3質(zhì)量濃度的增加而升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度人參皂苷Rg3對(duì)細(xì)胞存活率的影響 （±s，n=3）Tab.1 Effects of different concentrations of ginsenoside Rg3 on cell survival rate （±s，n=3）

表1 不同質(zhì)量濃度人參皂苷Rg3對(duì)細(xì)胞存活率的影響 （±s，n=3）Tab.1 Effects of different concentrations of ginsenoside Rg3 on cell survival rate （±s，n=3）

注：與0 μg·mL-1 比較，aP＜0.05；與10 μg·mL-1 比較，bP＜0.05；與20 μg·mL-1 比較，cP＜0.05；與40 μg·mL-1 比較，dP＜0.05。

人參皂苷Rg3質(zhì)量濃度/（μg·mL-1）0 10 20 40 80 FP細(xì)胞存活率30.22%±3.39%53.69%±5.16%a 67.51%±3.67%ab 78.79%±2.61%abc 91.09%±3.78%abcd 114.118＜0.001

3.2 MTT 法檢測(cè)的結(jié)果

細(xì)胞存活率組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組的細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組的細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞存活率的比較 （±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell survival rate in each group （±s，n=3）

表2 各組細(xì)胞存活率的比較 （±s，n=3）Tab.2 Comparison of cell survival rate in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項(xiàng)目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP細(xì)胞存活率97.46%±2.03%58.14%±4.04%a 75.84%±4.12%ab 84.41%±4.51%abc 56.454＜0.001

3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果

細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。 見(jiàn)表3、圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況Fig.1 The cell apoptosis detected by flow cytometry

表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較 （±s，n=3）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rate in each group （±s，n=3）

表3 各組細(xì)胞凋亡率的比較 （±s，n=3）Tab.3 Comparison of cell apoptosis rate in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項(xiàng)目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP細(xì)胞凋亡率2.31%±0.31%12.63%±1.10%a 8.67%±0.59%ab 5.25%±0.39%abc 131.450＜0.001

3.4 氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

SOD、MDA 和GSH-Px 含量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組MDA 含量升高，SOD 和GSH-Px 含量降低（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組MDA 含量降低，SOD 和GSH-Px 含量升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組MDA 含量降低，SOD 和GSH-Px 含量升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞中SOD、MDA 和GSH-Px 含量的比較 （±s，n=3）Tab.4 Comparison of the contents of SOD, MDA and GSH-Px in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項(xiàng)目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP SOD/（U·mL-1）84.50±7.79 31.23±7.66a 49.59±5.23ab 67.51±5.12abc 36.544＜0.001 MDA/（nmol·L-1）53.03±6.78 113.10±6.16a 88.35±4.12ab 69.66±2.96abc 72.790＜0.001 GSH-Px/（U·mL-1）171.23±13.23 73.74±6.88a 115.99±9.68ab 145.54±9.51abc 51.731＜0.001

3.5 Western blotting 檢測(cè)的結(jié)果

Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，氧化損傷組Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與氧化損傷組比較，人參皂苷Rg3低劑量和人參皂苷Rg3高劑量組Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，人參皂苷Rg3高劑量組Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。 見(jiàn)表5、圖2。

圖2 細(xì)胞中各蛋白表達(dá)Western blotting 圖Fig.2 The Western blotting of the expression level of proteins in cells

表5 各組細(xì)胞中Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s，n=3）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of Nrf2, Keap1 and HO-1 proteins in each group （±s，n=3）

表5 各組細(xì)胞中Nrf2、Keap1 和HO-1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s，n=3）Tab.5 Comparison of the relative expression levels of Nrf2, Keap1 and HO-1 proteins in each group （±s，n=3）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與氧化損傷組比較，bP＜0.05；與人參皂苷Rg3低劑量組比較，cP＜0.05。

項(xiàng)目正常組氧化損傷組人參皂苷Rg3低劑量組人參皂苷Rg3高劑量組FP Nrf2 0.98±0.05 0.16±0.02a 0.29±0.02ab 0.44±0.02abc 421.054＜0.001 Keap1 0.95±0.03 0.11±0.02a 0.21±0.03ab 0.34±0.02abc 655.808＜0.001 HO-1 0.97±0.02 0.13±0.02a 0.31±0.02ab 0.41±0.02abc 984.750＜0.001

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，晶狀體上皮細(xì)胞可保護(hù)晶狀體免受外界刺激，但是當(dāng)其在某些刺激因子作用下發(fā)生過(guò)度凋亡時(shí)，上皮細(xì)胞的數(shù)量減少，滲透性增加，晶狀體纖維將無(wú)法保持透明狀態(tài)，從而發(fā)生渾濁，并進(jìn)展為白內(nèi)障［6-7］，而氧化應(yīng)激引起的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是發(fā)生白內(nèi)障的機(jī)制之一［8-9］。LU B 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-211 表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)晶狀體上皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。外源性過(guò)氧化氫可產(chǎn)生大量自由基，造成細(xì)胞氧化損傷，因此本研究通過(guò)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)建立晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討人參皂苷Rg3對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷的作用及其機(jī)制。

人參皂苷Rg3是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥人參中提取的活性成分，具有廣泛的藥用價(jià)值，研究報(bào)道，人參皂苷Rg3可抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲［11］。HUANG W C 等［12］研究表明，人參皂苷Rg3可降低卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘癥小鼠呼吸道炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，其可能是一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑。人參皂苷Rg3可改善對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷，其主要是通過(guò)降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平、抑制肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用［13］。正常生理狀況下，機(jī)體抗自由基損傷的酶如SOD 和GSH-Px 可有效清除活性氧和自由基，在維持自由基產(chǎn)生與清除平衡方面發(fā)揮重要作用，因此SOD 和GSH-Px 是評(píng)估氧化反應(yīng)的常用指標(biāo)［14-15］。外源性過(guò)氧化氫可產(chǎn)生大量自由基，氧自由基引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，進(jìn)一步生成MDA，因此MDA水平直接反映了氧自由基的代謝情況和細(xì)胞受自由基損傷的程度［16］。本研究結(jié)果顯示，氧化損傷組細(xì)胞MDA 水平高于正常組，而SOD 和GSH-Px 水平低于正常組，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組MDA 水平低于氧化損傷組，而SOD 和GSH-Px 水平高于氧化損傷組，結(jié)果表明，人參皂苷Rg3可降低過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。研究表明，UHRF1 過(guò)表達(dá)可升高過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞中SOD 和GSH-Px 水平，同時(shí)逆轉(zhuǎn)由氧化應(yīng)激引起的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，因此UHRF1 可能成為治療白內(nèi)障的潛在治療靶點(diǎn)［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化損傷組的細(xì)胞存活率低于正常組，而細(xì)胞凋亡率高于正常組，人參皂苷Rg3低劑量組和人參皂苷Rg3高劑量組的細(xì)胞存活率高于氧化損傷組，而細(xì)胞凋亡率低于氧化損傷組。結(jié)果表明，人參皂苷Rg3可抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，提高其增殖活性。

Nrf2 是一種與抗氧化應(yīng)激密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，一般情況下，Nrf2 存在于細(xì)胞質(zhì)中，其被錨定于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上，與其阻遏蛋白Keap1 耦聯(lián)，可被泛素化蛋白酶體降解，僅有少部分Nrf2 與Keap1解離，并轉(zhuǎn)至細(xì)胞核發(fā)揮作用，Nrf2/Keap 信號(hào)通路在氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用［18］。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，一旦受到氧自由基的作用，Nrf2 從Keap1介導(dǎo)的泛素化降解途徑分離出來(lái)，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游多種抗氧化蛋白類基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)多種抗氧化酶表達(dá)，如HO-1、SOD 以及GST 等，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用［19］。研究表明，葛根素通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路降低MDA 水平，增強(qiáng)SOD 活性，可防止糖尿病大鼠白內(nèi)障的發(fā)生與進(jìn)展［20］。本研究結(jié)果顯示，氧化損傷組Nfr2、Keap1 和HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于正常組，而人參皂苷Rg3低劑量組和高劑量組Nfr2、Keap1 和HO-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于氧化損傷組。結(jié)果表明，人參皂苷Rg3可激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路。

綜上所述，人參皂苷Rg3可抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，提高其增殖活性，可能是通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用的，可為臨床治療白內(nèi)障提供理論依據(jù)。