HPLC法定量鹽堿地紅白忍冬和金銀花不同器官中5種活性物質(zhì)

胡玉濤 李天雪 茍瓊心

摘要 [目的]建立同時(shí)測定鹽堿地種植的紅白忍冬和金銀花中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的HPLC方法，并比較不同植物器官中5種成分的含量。[方法]色譜柱為Inertsil ODS-SP C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃。[結(jié)果]新綠原酸、綠原酸在1.0～500.0 μg/mL，咖啡酸在0.2～100.0 μg/mL，木犀草苷、木犀草素在0.1～50.0 μg/mL具有良好的線性關(guān)系；5種成分的日內(nèi)和日間精密度RSD值均≤4.2%，且在36 h 內(nèi)穩(wěn)定，平均回收率為95.60%～97.35%。紅白忍冬和金銀花藥材樣品中5種化合物的含量差異較顯著，在各器官中金銀花5種化合物均比紅白忍冬高，但紅白忍冬中5種化合物的含量亦有較高水平。[結(jié)論]該方法簡單便捷，適合于紅白忍冬中生物活性化合物的定量測定研究，能為該藥材的質(zhì)量控制制定提供科學(xué)、可靠的分析技術(shù)。

關(guān)鍵詞 紅白忍冬；金銀花；新綠原酸；綠原酸；咖啡酸；木犀草苷；木犀草素；高效液相色譜；定量分析

中圖分類號 R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0126-02

Abstract [Objective] The research aimed to establish HPLC method for simultaneous determination of neochlorogenic acid，chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and luteolin in L.japonica var.and L.japonica Thunb.cultivated in saline soil，and compare the contents of five components in different plant organs.[Method]The chromatographic column was Inertsil ODSSP C18 column （250 mm × 4.6 mm，5 μm）； the mobile phase was 0.1% formic acid aqueous solutionacetonitrile；volume flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 327 nm； column temperature was 30 ℃.[Result]Neochlorogenic acid and chlorogenic acid in 1.0 -500.0 μg/mL，caffeic acid in 0.2 - 100.0 μg/mL，luteoloside and luteolin in 0.1 - 50.0 μg/mL had a good linear relationship；The RSD values of the inter- and intra- precisions were less than 4.2%.The stability was accepted within 36 h.The average recovery rate were 95.60% -97.35%.The contents of five compounds in L.japonica Thunb.were higher than those in L.japonica var.，but the contents of five compounds in L.japonica var.was enough.[Conclusion]The method is simple and convenient，and is suitable for the quantitative determination of biologically active compounds in Lonicera japonica var..It can provide scientific and reliable analytical techniques for the quality control of the medicinal materials.

Key words Lonicera japonica var.；Lonicera japonica Thunb.； Neochlorogenic acid； Chlorogenic acid； Cafferic acid；Luteoloside；Luteolin； HPLC；Quantification

紅白忍冬[Lonicera japonica var.chinensis （Wats.） Bak.]為忍冬科忍冬屬，半常綠纏繞木質(zhì)藤木，是忍冬科植物忍冬的一個(gè)變種[1]，其枝蔓呈紅色、葉淡紫色，花隨花期不同，呈紅色、白色、黃色等顏色，香味濃，集藥用、觀賞于一體，已在全國大面積推廣種植。紅白忍冬能更為快速地響應(yīng)鹽脅迫，通過提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)耐鹽性，維持正常的生長發(fā)育[2]?！吨袊幍洹?015年版及相關(guān)文獻(xiàn)對紅白忍冬或金銀花的質(zhì)量控制主要為采用HPLC測定綠原酸和木犀草苷的含量[3-4]，藥理研究表明新綠原酸和異綠原酸同綠原酸均具有抗菌、抗病毒活性[5]。該研究選擇紅白忍冬為試驗(yàn)材料，以金銀花為對照，對2種植物在鹽堿地栽培環(huán)境下不同器官中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素這5種生物活性物質(zhì)的含量進(jìn)行評價(jià)，以期為應(yīng)用紅白忍冬進(jìn)行鹽堿地資源開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。紅白忍冬和金銀花均產(chǎn)自青口農(nóng)場鹽堿地金銀花種植園（連云港），經(jīng)胡玉濤副教授鑒定為Lonicera japonica var.chinensis （Wats.） Bak.和Lonicera japonica Thunb.。經(jīng)檢測采收期種植基地土壤pH為 8.16，含鹽量為0.33%。

1.1.2 試劑。新綠原酸（批號20160728）、綠原酸（批號20160625）、咖啡酸（批號20161009）、木犀草苷（批號20160322）和木犀草素（批號20160201）均由南京澤朗生物科技有限公司提供，5種對照品經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上。甲醇、乙腈為色譜純（Merk公司）；超純水經(jīng)過Milli-Q系統(tǒng)純化制備；其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)。

1.1.3 儀器。日本島津LC-2010A HT高效液相色譜儀，配有四元低壓梯度泵和LC solution色譜工作站；十萬分之一電子分析天平（Mettler Toledo AB135-S 型）。

1.2 方法

1.2.1 色譜分析條件。色譜柱為Inertsil ODS-SP C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈。梯度洗脫：0～6 min，10%乙腈；6～15 min，10%～30%乙腈；15～30 min，30%～60%乙腈；30～40 min，60%～100%乙腈。體積流量1.0 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 混合對照品溶液的制備。分別精密稱取對照品各10 mg，單獨(dú)以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.0 mg/mL的對照品儲備液；分別精密量取適量儲備液混合置容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，制得系列混合對照品溶液（新綠原酸、綠原酸：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、100.0、500.0 μg/mL；咖啡酸：0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL；木犀草苷、木犀草素：0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00 μg/mL），避光保存。

1.2.3 供試品溶液的制備。新采摘的紅白忍冬和金銀花的花蕾、已開放的花、嫩莖和新葉單獨(dú)烘干粉碎過篩，精密稱定20 g，精密加入85%乙醇220 mL，55 ℃水浴回流40 min，重復(fù)2次，2次提取液合并濾過，旋蒸濃縮至100 mL，避光保存，臨用前10 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性和專屬性考察。分別精密量取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL，按照“1.2.1”色譜條件操作，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2 線性關(guān)系考察。分別精密量取系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積積分值（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。取混合對照品儲備液不斷稀釋后進(jìn)樣分析，以10 倍信噪比確定最低定量限。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)。精密吸取最低、中間和最高質(zhì)量濃度的對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“1.2.1”色譜條件測定峰面積值，求得日內(nèi)精密度RSD；連續(xù)分析3 d，每天進(jìn)樣2 次，求得日間精密度RSD。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份供試品溶液（No.01系列），分別于制備后0、4、8、12、24、36 h 注入液相色譜儀，測定組分的量。

1.2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品6 份，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析測定含量。

1.2.4.6 回收率試驗(yàn)。取已定量的紅白忍冬和金銀花的花蕾、嫩莖和新葉各6 份，每份20 g，精密稱定，每份中分別精密加入含綠原酸（1.0 mg/mL）和木犀草素（0.1 mg/mL）的混合對照品溶液10 mL，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算平均回收率。

1.2.5 樣品的含量測定。分別精密吸取供試品溶液10 μL，按“1.2.1”色譜條件測定，記錄新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察。由圖1可知，供試品中5種待測成分色譜峰的分離度均大于1.5，其他雜質(zhì)峰及空白對照溶液對待測成分均無干擾，方法專屬性良好。

2.1.2 線性關(guān)系考察。按照“1.2.4.2”操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素這5種化合物在濃度范圍內(nèi)線性良好，各化合物相關(guān)系數(shù)r≥0.998；各化合物的最低定量限均低于0.1 μg/mL，表明該方法適合于微量定量分析。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按照“1.2.4.3”操作，結(jié)果測得5種化合物的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于4.2%（表1），數(shù)值在合格范圍內(nèi)，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.4.4”操作，結(jié)果得出新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的峰面積RSD分別為1.85%、2.15%、0.73%、2.85%、1.66%，表明供試品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.4.5”操作，結(jié)果得出紅白忍冬中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的平均質(zhì)量的RSD分別為1.02%、1.77%、2.18%、3.35%、1.42%；金銀花中5種化合物的平均質(zhì)量的RSD小于2.05%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 回收率試驗(yàn)。按照“1.2.4.6”操作，計(jì)算得出紅白忍冬中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素的平均回收率分別為97.60%、97.35%、95.60%、96.32%和96.67%，RSD分別為0.84%、1.69%、2.02%、1.55%、0.96%；金銀花中5種成分的平均回收率為96.68%～97.21%，RSD均小于2.25%。表明該方法具有良好的回收率。

2.2 含量測定 從表2可以看出，相同器官中，各化合物的含量在紅白忍冬中均低于金銀花。紅白忍冬中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸這3種化合物在花蕾中含量較高，與金銀花中這3種成分在不同器官中分布一致，均表現(xiàn)為花蕾>葉>花>莖；而木犀草苷和木犀草素在葉和莖的含量高于花和花蕾。

3 結(jié)論與討論

以85%乙醇回流提取40 min為主要提取條件，以乙腈-甲酸水構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)各成分的提取與分離效果均較好，各色譜峰的分離度和理論塔板數(shù)符合要求。中藥材藥理作用的發(fā)揮通常是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，應(yīng)用HPLC能同時(shí)測定紅白忍冬與金銀花不同產(chǎn)品器官中新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和木犀草素這5種化合物的含量，該方法便捷實(shí)用科學(xué)合理。在一定程度的鹽脅迫情況下，紅白忍冬和金銀花等植物體內(nèi)的鹽離子、脯氨酸等含量以及生理機(jī)能將發(fā)生變化以增強(qiáng)耐鹽性[6-7]。而綠原酸、木犀草苷等有效成分的積累是否會(huì)受到影響，還需要進(jìn)一步的研究。鹽堿地栽培紅白忍冬與金銀花均能獲得含有一定有效成分的產(chǎn)品器官，可以作為今后灘涂鹽堿地綠化或者開發(fā)的植物資源。

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