• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海菜花轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學分析

    2024-01-26 03:58:16李健玲蔣日紅梁圣華黃耀恒韋廣綏
    湖南農(nóng)業(yè)科學 2023年12期
    關鍵詞:亞類菜花核苷酸

    李健玲,秦 波,黃 欣,蔣日紅,孫 苗,梁圣華,黃耀恒,韋廣綏

    (1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院,廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室,廣西 南寧530002;2.北京林業(yè)大學,國家花卉工程技術研究中心,北京 100083;3.廣西國有高峰林場,廣西 南寧 530025)

    海菜花(Ottelia acuminata)屬水鱉科水車前屬多年生沉水植物,為中國特有種,國家二級保護植物。該植物對水質(zhì)要求較高,是一種環(huán)境指示性植物,主要分布區(qū)域為廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等地[1]。海菜花是一種典型的高鉀低鈉型蔬菜,含有鈣、鐵、蛋白質(zhì)、抗壞血酸、酚類等豐富的營養(yǎng)物質(zhì),具有較高的食用價值;其中酚類物質(zhì)是天然的抗氧化劑,對DNA 損傷有良好的修復作用。另一方面,海菜花還能富集重金屬元素鉛,具有一定的生態(tài)修復價值[2-3]。目前,關于海菜花的研究多集中在栽培[4-5]、進化和遺傳學分析[6-7]、化學成分分析[3]等方面,其分子水平的研究僅有葉綠體基因組的報道[8]。

    分子生物學技術在植物領域尤其是農(nóng)作物方面應用的較早且深入,但是在水生植物及藥用植物上的研究報道仍然有限。高通量轉(zhuǎn)錄組作為初步掌握代謝通路和生物合成基因信息的一個手段,在許多物種中已經(jīng)得到了廣泛的應用。為了彌補海菜花轉(zhuǎn)錄組上的空白,研究對海菜花葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序,挖掘其重要基因和調(diào)控信息,以期為海菜花功能基因和遺傳多樣性分析及分子育種奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    采集新鮮的海菜花葉片,并立即投入液氮中保存。

    1.2 海菜花cDNA 文庫構建及測序

    使用Trizol 法對海菜花的RNA 進行提取。利用Illumina TruSeqTM RNA sample prep Kit(Illumina,美國)方法構建海菜花的RNA 文庫,首先使用帶有Oligo(dT)的磁珠對帶有polyA 尾巴的mRNA 進行富集,并用超聲波將mRNA 進行片段化打斷。加入隨機寡核苷酸為引物,在M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶體系下反轉(zhuǎn)合成第一條鏈的cDNA,之后用RNaseH 清除反應中的RNA,在DNA polymerase I 體系下,以dNTPs 為原料進行cDNA 第二條鏈的合成。對合成后的雙鏈cDNA 進行純化、末端修復、加A 尾以及連接測序接頭,利用AMPure XP beads 對處理過的雙鏈cDNA 進行篩選,挑出200 bp 左右的片段進行擴增,之后對得到的PCR 產(chǎn)物進行純化,最終產(chǎn)物即為文庫。

    利用瓊脂糖凝膠電泳、NanoPhotometer spectrophotometer、Qubit2.0 Fluorometer、Agilent 2100 bioanalyzer 對RNA 的質(zhì)量進行檢驗,樣品合格后進行測序。在測序的flow cell 中加入不同標記的4 種dNTP 以及DNA 聚合酶和接頭引物,當測序鏈在延伸互補的時候,每個dNTP 會發(fā)出相應的熒光,從而被測序儀捕捉獲得序列信息。

    海菜花的RNA 提取、文庫構建及測序均由上海凌恩生物科技有限公司完成。

    1.3 轉(zhuǎn)錄組組裝及分析

    使用Trimmomatic 對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控,Trinity 進行轉(zhuǎn)錄組拼接,并使用Salmon 進行拼接數(shù)據(jù)的比對,之后使用Diamond 對測序數(shù)據(jù)進行NR數(shù)據(jù)庫、KEGG 數(shù)據(jù)庫、Swiss-Port 數(shù)據(jù)庫的注釋,利用eggNOG-mapper 進行eggNOG 數(shù)據(jù)庫和GO 數(shù)據(jù)庫的注釋。

    2 結果與分析

    2.1 海菜花轉(zhuǎn)錄組測序及組裝

    對海菜花的葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序,共檢測到26 658 026 條reads,共計3 998 703 900 個堿基。對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控進一步去除reads 中的接頭序列、質(zhì)量較低的堿基以及短序列后,得到clean data 的reads 有 26 497 174 條,共計3 961 376 102 個堿基,其中Q20%高達98.90%,Q30%高達96.19%,GC含量占比為50.57%,表明海菜花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,可以開展后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

    由于海菜花沒有參考基因組,因此利用Trinity(2.8.6)對clean data 進行從頭組裝,得到組裝后的unigene 有27 040 條,長度為27 761 688 bp,最長的unigene 有12 094 bp,N50 為1 340 bp,平均unigene 為1 026.69 bp,其中N50 高于平均長度說明組裝效果較好。同時,將測序獲得的高質(zhì)量序列與拼接序列進行比對,比對率達到86.89%,也表明拼接效果較好。在得到的unigene 中,401~600 bp 的序列長度占比最大,達到7 134 條(26.38%),序列長度分布見圖1。

    圖1 海菜花unigene 長度分布

    2.2 海菜花轉(zhuǎn)錄組注釋

    將獲得的27 040 條unigene 分別與不同數(shù)據(jù)庫進行比對,結果如圖2 所示。有18 910 條unigene分別被NR、GO、COG、KEGG、SWISS 這5 大數(shù)據(jù)庫注釋到,占unigene 總數(shù)的69.93%。其中,NR數(shù)據(jù)庫比對到的unigene 最多,有18 874 條,占總數(shù)的69.80%;其次是SWISS 數(shù)據(jù)庫,比對到14 020條unigene,占總數(shù)的51.85%;第三是COG 數(shù)據(jù)庫,比對到13 531 條unigene,占總數(shù)的50.04%;KEGG 數(shù)據(jù)庫比對到的unigene 數(shù)量最少,為7 552條,占總數(shù)的27.93%;在所有數(shù)據(jù)庫中均比對到的unigene 有4 819 條,占總數(shù)的17.82%,推測為新基因。

    圖2 海菜花unigene 在各數(shù)據(jù)庫的注釋結果

    2.3 NR 數(shù)據(jù)庫注釋

    NR數(shù)據(jù)庫的功能注釋能夠了解海菜花轉(zhuǎn)錄組中序列與哪些物種有同源分布。由圖3 可知,海菜花與搖蚊(Clunio marinus)比對到的同源序列最多,為2 622 條,占所有比對到序列的13.89%;其次是油棕(Elaeis guineensis),達到2 062 條,占10.93%;海棗(Phoenix dactylifera)中比對到1 646條,占8.72%;另外,芋(Colocasia esculenta)、大葉藻(Zostera marina)、蓮(Nelumbo nucifera)、鳳梨(Ananas comosus)、小果野蕉(Musa acuminatasubsp.malaccensis)、沉水樟變型(Cinnamomum micranthumf.kanehirae)、石刁柏(Asparagus officinalis)中 分 別 比 對 到1 435、947、750、637、570、570、544 條,分別占比7.60%、5.02%、3.97%、3.38%、3.02%、3.02%、2.88%;而其他物種中比對到的序列數(shù)均低于500 條,總數(shù)達7 091 條,占比為37.57%。

    圖3 海菜花unigene 在NR 數(shù)據(jù)庫中比對到的同源序列排名前10 的物種

    2.4 COG 數(shù)據(jù)庫注釋

    由圖4 可知,海菜花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在COG 數(shù)據(jù)庫中共比對到unigene 13 531 條,但功能未知的基因占多數(shù),排在KOG 預測的第1 位,表明海菜花中有許多序列還未得到有效的驗證和研究;其中,轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白(O:Posttranscriptional modification,protein turnover,chaperones),信號傳導機制(T:Signal transduction mechanisms),翻譯、核糖體結構與生物發(fā)生(J:Translation,ribosome structure and biogenesis),RNA轉(zhuǎn)錄和修飾(A:RNA processing and modification)分別排在KOG 預測的第2~5 位,代表了海菜花生長發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導中基本過程活動比較活躍。

    圖4 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組COG 功能注釋

    2.5 GO 注釋

    在GO 注釋中,海菜花共注釋到10 505 條unigene,分為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3 個大類和43 個功能亞類(圖5)。生物過程注釋到的unigene 最多,亞類中細胞進程和代謝過程中unigene 數(shù)量最多,而碳利用和生物礦化所占比例最少。在分子功能中,催化活性和結合比對到的unigene 數(shù)量最多,蛋白標簽、運貨受體活性、養(yǎng)分庫活性和小分子傳感器活性比對到的數(shù)量較少。在細胞組分中包括了4 個亞類,最高的為細胞解刨學實體,最少的為其他器官部分。

    圖5 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組GO 注釋結果

    2.6 KEGG 通路分析

    為了研究基因具體的功能,對海菜花轉(zhuǎn)錄組中的unigene 進行KEGG 通路分析,共分為5 大類和20 個亞類(圖6)。第1 大類代謝過程中比對到的unigene 數(shù)量最多,包括11 個亞類,全局和概述圖譜比對到的數(shù)量最多,達4 678 條unigene,其次是碳水化合物代謝,比對上1 047 條unigene,氨基酸代謝、能量代謝、酯類代謝分別比對到587、498、486 條,表明在細胞過程中關于代謝的基因較多。第2 大類是遺傳信息處理,包括5 個亞類,翻譯過程中比對到的unigene 最多,達到784 條,其次是折疊、分類和降解,比對到662 條,病毒信息中比對到的數(shù)量最少,為46 條。第3 大類為環(huán)境信息處理,包括2 個亞類,分別為信號轉(zhuǎn)導(比對到309條)和膜轉(zhuǎn)運(比對到25 條)。第4 大類為細胞過程,包括2 個亞類,為運輸和分解代謝(比對到427 條)和細胞運動(比對到84 條)。最后1 類為有機系統(tǒng),僅包含1 個亞類,為環(huán)境適應,比對到200 條unigene。

    圖6 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組KEGG 注釋分類統(tǒng)計

    2.7 SSR 分析

    在海菜花轉(zhuǎn)錄組中共檢索到4 217 個SSR 位點,包含了6 種核苷酸重復類型,具體情況如圖7 所示。單核苷酸重復數(shù)量最多,為1 518 個,占比為36.00%,A/T 重復比例最高;其次為三核苷酸重復,有1 437 個,占比為34.08%,且類型較多;雙核苷酸重復為1 214 個,占比為28.79%,以AG/CT 類型比例最高;四核苷酸位點重復有34 個,占比為0.81%;六核苷酸位點重復有9 個,占比為0.21%;五核苷酸位點重復數(shù)最少,僅5 個,占比0.11%。

    圖7 海菜花葉片轉(zhuǎn)錄組SSR 分布情況

    3 討 論

    海菜花在景觀營造、食用和藥用方面有很高的開發(fā)利用價值。目前,對水生植物轉(zhuǎn)錄組的研究種類較少,包括圓海鏈藻(Thalassiosira rotula)[9]、蓮(Nelumbo nucifera)[10-11]、齒葉睡蓮(Nymphaea lotus)[12]、東方澤瀉(Alisma orientale)[13]、芡實(Euryale feroxSalisb.ex Konig et Sims)[14]等,通過轉(zhuǎn)錄組測序技術對其次生代謝物的合成、花開放規(guī)律、脅迫響應和遺傳標記等進行了深入研究。海菜花在生態(tài)適應性上對環(huán)境的要求較高,且有不同的生態(tài)適應類群,次生代謝物豐富,對其進行分子層面的深入研究具有重要意義。

    該研究在高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術的支持下,對海菜花葉片的轉(zhuǎn)錄組信息進行解讀,共檢測到unigene 27 040 條,其中有18 910 條unigene 在數(shù)據(jù)庫中比對上了,獲得了海菜花中大量的基因信息。在NR 數(shù)據(jù)庫得到了最多的基因注釋,共18 874 個,與植物同源基因比對最多的是油棕,另外包括芋、大葉藻、蓮和鳳梨等,這些植物類型均屬于濕生環(huán)境,表明海菜花可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和生態(tài)適應方面與濕生植物有相似的基因調(diào)控類型。在KOG 數(shù)據(jù)庫中,海菜花與已知基因比對上最多的基因涉及轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白等方面。對基因通路進行KEGG 分析,共比對到7 552 個unigene,以細胞過程比對到的unigene 最多,且與代謝途徑密切相關;另外,在GO注釋中,生物過程注釋到的unigene最多,表明在海菜花葉片中新陳代謝活動較為旺盛。SSR分析中單核苷酸、雙核苷酸和三核苷酸重復是主要類型,占比達98.87%,這些位點的發(fā)現(xiàn)對海菜花的分子標記開發(fā)和利用具有重要價值,能為植物鑒定、遺傳育種和藥理研究提供直接的證據(jù)。

    通過對海菜花葉片進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序,獲得了大量的基因序列信息和注釋信息,為海菜花的功能基因和遺傳多樣性分析及分子育種奠定了基礎,也為海菜花的生態(tài)適應性、食用和藥用價值的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

    猜你喜歡
    亞類菜花核苷酸
    菜花黑腐病如何防治
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關性研究進展
    徐長風:核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    基于草原綜合順序分類法的中國山地草地亞類分類研究
    菜花寶典
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    又見家鄉(xiāng)菜花黃
    當代音樂(2018年4期)2018-05-14 06:47:13
    免疫球蛋白G亞型檢測在小兒反復呼吸道感染中的應用
    海菜花戀歌(獨唱)
    民族音樂(2017年6期)2017-04-19 02:18:21
    Evaluation of antidepressant polypharmacy and other interventions for treatment-resistant depression
    男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产精品999在线| 97碰自拍视频| 亚洲激情在线av| 日本免费a在线| 日韩有码中文字幕| 窝窝影院91人妻| 看十八女毛片水多多多| 久久这里只有精品中国| 最近视频中文字幕2019在线8| 在现免费观看毛片| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 免费观看人在逋| 亚洲人成电影免费在线| 看免费av毛片| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲av免费在线观看| 毛片一级片免费看久久久久 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产在视频线在精品| 黄色一级大片看看| 日本 av在线| 51午夜福利影视在线观看| 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲七黄色美女视频| 久久99热6这里只有精品| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 免费av不卡在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 最近最新免费中文字幕在线| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲av二区三区四区| 精品久久久久久久久亚洲 | 国产单亲对白刺激| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美午夜高清在线| 99riav亚洲国产免费| 直男gayav资源| 白带黄色成豆腐渣| 宅男免费午夜| 精品一区二区三区视频在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲真实伦在线观看| 午夜福利免费观看在线| 桃色一区二区三区在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| av中文乱码字幕在线| 我要看日韩黄色一级片| 中出人妻视频一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品女同一区二区软件 | 国产伦精品一区二区三区四那| 日本一本二区三区精品| 在线国产一区二区在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久国产乱子免费精品| 国产精品三级大全| 欧美3d第一页| .国产精品久久| 久久这里只有精品中国| 欧美乱妇无乱码| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜福利高清视频| 超碰av人人做人人爽久久| 三级毛片av免费| 美女被艹到高潮喷水动态| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品一及| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品一区二区性色av| АⅤ资源中文在线天堂| 国产亚洲欧美98| 成人永久免费在线观看视频| 久久这里只有精品中国| 免费观看的影片在线观看| 观看免费一级毛片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 床上黄色一级片| 欧美日韩福利视频一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲精品一区av在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 99久久精品国产亚洲精品| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品在线观看二区| 精品一区二区免费观看| 国产三级中文精品| 九九在线视频观看精品| 亚洲最大成人中文| 中文资源天堂在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精华霜和精华液先用哪个| 变态另类丝袜制服| 毛片一级片免费看久久久久 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 制服丝袜大香蕉在线| 午夜福利视频1000在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 哪里可以看免费的av片| 国产高清有码在线观看视频| 好男人在线观看高清免费视频| 中文字幕久久专区| 久久精品人妻少妇| 日本免费a在线| 亚洲人成网站在线播| 亚洲欧美日韩东京热| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99久国产av精品| 国产免费男女视频| 久久精品国产清高在天天线| 美女 人体艺术 gogo| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品一区二区免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| a级一级毛片免费在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 久久6这里有精品| 精品午夜福利视频在线观看一区| 小说图片视频综合网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久精品大字幕| 国产三级在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 日本一本二区三区精品| 久久精品人妻少妇| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 男女那种视频在线观看| av中文乱码字幕在线| 69av精品久久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 男女那种视频在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费搜索国产男女视频| 可以在线观看毛片的网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 51午夜福利影视在线观看| 国产在视频线在精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久伊人香网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 床上黄色一级片| 国产69精品久久久久777片| 网址你懂的国产日韩在线| 深夜精品福利| 国产中年淑女户外野战色| 内射极品少妇av片p| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久久色成人| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久99热这里只有精品18| 亚洲成av人片免费观看| 国产免费男女视频| 少妇的逼好多水| 国产单亲对白刺激| 国产高潮美女av| 性色av乱码一区二区三区2| 国产在视频线在精品| 中文字幕av成人在线电影| 两个人视频免费观看高清| 一本精品99久久精品77| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲欧美精品综合久久99| 九九在线视频观看精品| 国产伦人伦偷精品视频| 99热精品在线国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品人妻熟女av久视频| 国产毛片a区久久久久| 久久久久久久久久黄片| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产午夜福利久久久久久| 舔av片在线| 亚洲自拍偷在线| 午夜亚洲福利在线播放| 久久九九热精品免费| 综合色av麻豆| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久久久久久中文| 午夜福利高清视频| 舔av片在线| 国产成人av教育| 9191精品国产免费久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 一个人免费在线观看的高清视频| bbb黄色大片| 18+在线观看网站| 日韩免费av在线播放| 久久久久久久久久黄片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 内地一区二区视频在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲国产色片| 免费观看精品视频网站| 99视频精品全部免费 在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩 亚洲 欧美在线| 99热精品在线国产| 91久久精品电影网| 天天躁日日操中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 宅男免费午夜| 亚洲avbb在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩欧美精品免费久久 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 99久久精品一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 97超视频在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月| xxxwww97欧美| 99热精品在线国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 五月玫瑰六月丁香| 俺也久久电影网| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产私拍福利视频在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲色图av天堂| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲avbb在线观看| 美女大奶头视频| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 天堂影院成人在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产高清激情床上av| 精品人妻熟女av久视频| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成人一区二区视频在线观看| 精品人妻1区二区| 欧美zozozo另类| 欧美色视频一区免费| 欧美黑人巨大hd| 精品午夜福利视频在线观看一区| 搡老熟女国产l中国老女人| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美成人性av电影在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 在线观看66精品国产| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美成人性av电影在线观看| 日本在线视频免费播放| 99视频精品全部免费 在线| 美女黄网站色视频| 性色avwww在线观看| 在线看三级毛片| 欧美一级a爱片免费观看看| 悠悠久久av| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 91九色精品人成在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产成人影院久久av| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 天天躁日日操中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 看十八女毛片水多多多| 97超视频在线观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美+日韩+精品| 久久99热这里只有精品18| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 免费av不卡在线播放| 天美传媒精品一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 黄片小视频在线播放| 欧美极品一区二区三区四区| 久久国产乱子免费精品| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 日韩欧美 国产精品| 一本久久中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久久久精品吃奶| 免费看光身美女| 淫秽高清视频在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 在线观看一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| ponron亚洲| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲av二区三区四区| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄色丝袜av网址大全| www日本黄色视频网| 99热6这里只有精品| 亚洲一区二区三区色噜噜| 中国美女看黄片| 少妇高潮的动态图| 一夜夜www| 在线播放无遮挡| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲人成网站高清观看| 黄片小视频在线播放| 黄色丝袜av网址大全| 一区福利在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 深夜a级毛片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 嫁个100分男人电影在线观看| .国产精品久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产精品99久久久久久久久| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩国内少妇激情av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 91狼人影院| 亚洲最大成人av| 国产在线男女| 淫秽高清视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 免费人成在线观看视频色| 五月玫瑰六月丁香| 国产色爽女视频免费观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日本在线视频免费播放| 香蕉av资源在线| 久久精品国产亚洲av天美| 在线观看一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲美女视频黄频| 国产精品永久免费网站| 精品国产三级普通话版| 99久久成人亚洲精品观看| 久久这里只有精品中国| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久午夜福利片| 看十八女毛片水多多多| 成人无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品日韩av在线免费观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 欧美一级a爱片免费观看看| 黄片小视频在线播放| 天堂影院成人在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 免费在线观看日本一区| 国产精品三级大全| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成人av教育| 日韩精品中文字幕看吧| 国产欧美日韩一区二区三| 好男人在线观看高清免费视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| а√天堂www在线а√下载| 99久久成人亚洲精品观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品久久视频播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久99久视频精品免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 变态另类丝袜制服| 精品久久久久久成人av| 亚洲 国产 在线| 在线观看午夜福利视频| 一本综合久久免费| 亚洲18禁久久av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜福利高清视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产av在哪里看| 免费在线观看亚洲国产| 精品人妻视频免费看| 精品日产1卡2卡| 午夜福利欧美成人| 久久久久国内视频| 国产老妇女一区| www.www免费av| 国产极品精品免费视频能看的| 桃红色精品国产亚洲av| 1000部很黄的大片| 久99久视频精品免费| 中文字幕av成人在线电影| 国产麻豆成人av免费视频| 国产av在哪里看| 亚洲精品456在线播放app | 嫩草影院精品99| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕熟女人妻在线| 18+在线观看网站| 亚洲av一区综合| 99国产精品一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 精品福利观看| 国产亚洲精品久久久com| 日本黄大片高清| bbb黄色大片| 午夜影院日韩av| 国产精品久久久久久久久免 | 国内精品久久久久久久电影| 日韩欧美精品v在线| 国产单亲对白刺激| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲不卡免费看| 精品一区二区免费观看| 久久久精品大字幕| 乱人视频在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 久久午夜福利片| 999久久久精品免费观看国产| 国产成人aa在线观看| 男人舔奶头视频| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲国产精品999在线| 亚洲精品456在线播放app | 99久久无色码亚洲精品果冻| 又紧又爽又黄一区二区| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久热精品热| 欧美3d第一页| 国产高清激情床上av| 国产色爽女视频免费观看| 国产三级黄色录像| 欧美乱色亚洲激情| 欧美色视频一区免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人av在线播放网站| 午夜免费成人在线视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av美国av| 午夜视频国产福利| 男女之事视频高清在线观看| 九九在线视频观看精品| 午夜激情欧美在线| av国产免费在线观看| av黄色大香蕉| 精品久久久久久久久av| 国产伦在线观看视频一区| 色播亚洲综合网| 永久网站在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 一区福利在线观看| 免费观看精品视频网站| 一个人免费在线观看电影| av天堂中文字幕网| 可以在线观看的亚洲视频| 深夜a级毛片| 国产在视频线在精品| 色哟哟·www| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美一区二区精品小视频在线| 国产亚洲欧美98| 婷婷六月久久综合丁香| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本免费a在线| 小说图片视频综合网站| 国产成人av教育| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲人与动物交配视频| av国产免费在线观看| av在线老鸭窝| 我要看日韩黄色一级片| 久久国产精品影院| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产一区二区在线观看日韩| 国内精品久久久久精免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 波野结衣二区三区在线| 一进一出抽搐动态| 一a级毛片在线观看| 天堂网av新在线| 免费大片18禁| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人av教育| av欧美777| 精品一区二区三区av网在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 色综合站精品国产| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜精品在线福利| 深夜a级毛片| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 麻豆国产av国片精品| 色在线成人网| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 精品不卡国产一区二区三区| 很黄的视频免费| 久久这里只有精品中国| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲黑人精品在线| 1000部很黄的大片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 黄色配什么色好看| 999久久久精品免费观看国产| 无人区码免费观看不卡| 国产高清激情床上av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久久久久精品吃奶| 老熟妇仑乱视频hdxx| 中出人妻视频一区二区| 天堂√8在线中文| 亚洲成av人片在线播放无| 久久6这里有精品| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲欧美精品综合久久99| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久精品国产亚洲av涩爱 | h日本视频在线播放| 成人av在线播放网站| 成人三级黄色视频| 老女人水多毛片| 淫秽高清视频在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 美女 人体艺术 gogo| 色综合亚洲欧美另类图片| 窝窝影院91人妻| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久久久久九九精品二区国产| 色av中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 国产黄片美女视频| 国产中年淑女户外野战色| 丰满的人妻完整版| 国产熟女xx| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品久久久久久久电影| 青草久久国产| 欧美日韩黄片免| 久久午夜亚洲精品久久| 免费在线观看影片大全网站| 精品一区二区三区视频在线| 国产一区二区三区视频了| 精品欧美国产一区二区三| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 很黄的视频免费| 亚洲美女黄片视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品国产三级普通话版| 国产av一区在线观看免费| 97超视频在线观看视频| 亚洲在线观看片| 色综合站精品国产| 久久久久久久久久成人| 欧美成人a在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久九九热精品免费| 国产精品综合久久久久久久免费| 一级黄片播放器| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品永久免费网站| 精品乱码久久久久久99久播| 99久久精品一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 婷婷亚洲欧美| 一本久久中文字幕| 成人三级黄色视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 成人无遮挡网站| 深夜a级毛片| 国产伦精品一区二区三区四那| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产乱人伦免费视频| 亚洲av美国av| 欧美激情久久久久久爽电影| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲av美国av| 成年版毛片免费区| 亚洲欧美激情综合另类| www.999成人在线观看| 国产黄片美女视频| 色视频www国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| .国产精品久久| 性欧美人与动物交配| 变态另类丝袜制服| 日本成人三级电影网站| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品三级大全| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲人成网站在线播|