蒲公英總黃酮的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評價*

劉思琳，高 原，武曉藝，徐 笛，陳子欣

（哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，黑龍江省預防與治療老年性疾病的藥物研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.Mazz.），菊科蒲公英屬的多年生草本植物，為黑龍江省道地藥材。蒲公英全草可入藥，藥用價值高且分布廣泛，易采摘收集。蒲公英具有清熱解毒、消腫止痛、利膽利尿、輕瀉健胃、消炎抑菌和預防癌癥等功效[1-3]。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，蒲公英具有多種藥理活性，應用廣泛，關于蒲公英及其活性成分開發(fā)及深加工也受到了人們的關注。蒲公英中含有蒲公英醇、蒲公英素等多種成份，同時含有豐富的礦物質、維生素和多種營養(yǎng)成分，蒲公英中富含黃酮、異黃酮等抗氧化物質和抗氧化酶，這類物質通常具有較好的抗氧化活性，能夠有效清除體內(nèi)自由基[4-6]。蒲公英的藥用價值也與其所含黃酮類物質有較為直接的關系[7]。

本文通過單因素實驗及正交實驗對蒲公英黃酮類物質進行提取及工藝優(yōu)化，以總黃酮含量為指標篩選其最佳提取工藝，并進一步對黃酮提取物的抗氧化活性進行評價，為蒲公英在食品、藥品、化妝品等多種領域的進一步深加工提供理論支持。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑及儀器

蒲公英飲片購自人民同泰藥店；無水乙醇（AR天津富宇）；DPPH（純度95% 北京中生瑞泰）；蘆?。兌?5% 上海士峰）；NaNO2（AR 天津鴻鑫）；Al（NO3）3、NaOH，均為分析純，天津科密歐。

DB-20 型紫外分光光度計（馭锘實業(yè)）；FW-100型高速萬能粉碎機（北京光明）；DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）；RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城）。

1.2 蒲公英總黃酮的提取工藝優(yōu)化

1.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取蘆丁0.0200g，用無水乙醇定容至100mL 的容量瓶中[8]。分別吸取不同體積蘆丁標準溶液置于25mL 比色管中，用體積分數(shù)為30%的乙醇補充至10mL，加入0.7mL 5%的NaNO2，混勻靜置5min，加入0.7mL 10%的Al（NO3）3，混勻靜置6min 后，再加入5mL 1mol·L-1NaOH 溶液，用30%的乙醇定容，靜置10min 后，于510nm 波長測定吸光度[7]。

1.2.2 單因素實驗 蒲公英藥材粉碎后過80 目篩，分別選取不同料液比、提取次數(shù)、不同乙醇濃度、提取溫度、提取時間對蒲公英總黃酮進行提取，并對提取液進行總黃酮含量的測定。

1.2.3 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結果，選取提取溫度（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）作為考察因素，每個因素設定3 個水平，以總黃酮含量為考察指標，采用L9（34）表進行正交實驗[10,11]。

1.3 抗氧化活性實驗

1.3.1 DPPH 自由基清除實驗 用無水乙醇配制濃度為0.04%的DPPH 貯存溶液（40mg·mL-1），避光保存，備用。使用時將DPPH 貯存液進行10 倍稀釋，得到濃度為0.004%的DPPH（4mg·mL-1）溶液。

分別取不同濃度的各樣品溶液（2、1、0.5、1.25、0.625mg·mL-1）100μL，加入1.4 mL 無水乙醇，1.0mL的DPPH 溶液，室溫避光或黑暗條件反應30min，同時以無水乙醇為空白，于517nm 波長測定吸光值；以1.5mL 無水乙醇加1 mL DPPH 為對照。按下列公式計算DPPH 自由基清除率。用無水乙醇做空白對照。

式中 Ac：1.5mL 無水乙醇+1mL DPPH 的吸光度值；Ao：100μL 樣品+1.4mL 無水乙醇+1mL DPPH 的吸光度值。

1.3.2 羥基自由基清除實驗 蒲公英待測樣品的制備：在試管中依次加入不同濃度的蒲公英黃酮提取液1mL、9mmol·L-1的FeSO4溶液1mL、9mmol·L-1的水楊酸乙醇溶液1mL、8.8mmol·L-1的H2O2溶液1mL。充分混勻，37℃孵育30min。在3000r·min-1下離心10min，取上清液，以水為參比液于510nm 處測吸光度Ax；在試管中加入待測液，其余試劑用蒸餾水代替，測得本底吸光度Ax0；生育酚（Trolox）作為陽性對照，陰性對照以蒸餾水代替，測得陰性對照吸光度A0。按下式計算羥自由基清除率：

式中 Ax：加入待測液后的吸光度值；Ax0：待測液本底吸光度值；A0：空白對照液吸光度值。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

以蘆丁為對照品進行總黃酮標準曲線的繪制。以吸光度Y 為縱坐標、濃度X 為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程，見圖1。

圖1 蘆丁對照品的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin control

通過單因素實驗結果表明，乙醇濃度、提取溫度和提取時間對蒲公英提取物總黃酮含量的影響較大，結果見圖2~4。

圖2 不同乙醇濃度對蒲公英提取物總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on total flavonoids content of dandelion extract

圖3 不同提取溫度對蒲公英提取物總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on total flavonoids content of dandelion extract

由圖2~4 可見，在乙醇濃度為50%時，蒲公英總黃酮含量最高，為0.7860mg·mL-1。在提取溫度為70℃時，蒲公英總黃酮的含量最高，為0.7001mg·mL-1。在提取時間為70min 時，蒲公英總黃酮含量最高，為0.7762mg·mL-1。

為綜合考察不同因素之間的交互影響，在單因素實驗基礎上進一步進行了正交優(yōu)化實驗分析。

2.2 正交實驗結果

選擇提取溫度、乙醇濃度和提取時間為主要因素，進行正交實驗，并對結果進行了直觀分析和方差分析。結果見表1、2。

表1 蒲公英總黃酮提取的正交實驗結果Tab.1 Orthogonal experiment results of total flavonoids extraction from dandelion

表2 正交實驗方差分析表Tab.2 Variance analysis table of orthogonal test

由表1、2 可見，各因素對提取效果均有影響，影響大小順序為乙醇濃度＞提取溫度＞提取時間，實驗結果表明，總黃酮的最佳提取工藝為A2B1C3，即在提取溫度為70℃、乙醇濃度為40%、提取時間為80min時，總黃酮含量為0.9170mg·mL-1。

2.3 抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH 自由基清除實驗 蒲公英黃酮提取物的DPPH 自由基清除實驗結果見圖4。

圖4 蒲公英提取物的DPPH 自由基清除實驗Fig.4 DPPH scavenging of free radical from dandelion extract

圖4 不同提取時間對蒲公英提取物總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of different extraction time on total flavonoids content of dandelion extract

由圖4 可見，當蒲公英提取物濃度為4mg·mL-1時，DPPH 自由基清除率達到80.8%，IC50值為0.8492mg·mL-1。蒲公英提取物具有較好的清除自由基能力，且隨著濃度的增大，清除率逐漸增強。陽性對照維生素C 的DPPH 清除自由基實驗其IC50值為9.5μg·mL-1。

2.3.2 羥基自由基清除實驗 羥基自由基清除實驗結果見圖5。

圖5 蒲公英提取物的羥基自由基清除率實驗Fig.5 Hydroxyl radical scavenging experiment of dandelion extract

由圖5 可見，蒲公英提取物具有較好的清除羥基自由基能力，其IC50值為1.0717mg·mL-1，表明當蒲公英提取物濃度為1.0717mg·mL-1時，能夠清除約50%羥基自由基。且隨著蒲公英提取物濃度的增加，羥基自由基的清除率也隨之增加，二者總體呈正相關。陽性對照生育酚（Trolox）的羥基自由基清除能力IC50值為0.022mg·mL-1。

雖然蒲公英提取物清除DPPH 自由基與羥基自由基的能力與陽性對照比還有一定的差距，但作為一種分布廣泛、易獲得的道地藥材，其應用和開發(fā)潛力仍然值得人們關注。

3 結論

本文通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化提取蒲公英中總黃酮，最佳提取工藝為：乙醇濃度為40%，提取溫度為70℃，提取時間為80min。此時，總黃酮含量為0.9170mg·mL-1。進一步對蒲公英黃酮提取物進行DPPH 自由基清除實驗和羥基自由基清除實驗，結果表明，蒲公英黃酮提取物具有良好的抗氧化及清除自由基能力。