毛頭牛蒡子總木脂素有效部位的化學(xué)成分研究*

葛 亮，劉富銘，田樹(shù)革

（新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000）

毛頭牛蒡子為菊科牛蒡?qū)倜^牛蒡（Arctium tomentosum Mill.）的干燥成熟果實(shí)，維吾爾名為“可熱可孜烏拉蓋”，在我國(guó)新疆地區(qū)分布廣泛、資源豐富、歷史悠久[1]。毛頭牛蒡子含有多糖類、木脂素類、黃酮類等多種化學(xué)物質(zhì)[2]，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹等功效，具有抗衰老、保肝、抗腫瘤等藥理學(xué)作用[3]。毛頭牛蒡子含有較多的牛蒡苷，是天然產(chǎn)物牛蒡苷的重要藥用資源[4]。

本項(xiàng)目前期已經(jīng)考察了毛頭牛蒡子總木脂素類成分的最佳提取工藝，并完成了對(duì)毛頭牛蒡子總木脂素類成分的富集工藝研究，制備了毛頭牛蒡子總木脂素有效部位。本實(shí)驗(yàn)是對(duì)毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中的有效成分進(jìn)行分析，采用分光光度法檢測(cè)其中總木脂素的含量，并采用HPLC 法檢測(cè)其中牛蒡苷、牛蒡苷元的含量，為毛頭牛蒡子總木脂素有效部位的下一步開(kāi)發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑及儀器

毛頭牛蒡子（Arctium tomentosum Mill.）采集于新疆烏魯木齊水磨溝區(qū)，曬干后剝出毛頭牛蒡子，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院李永和主任藥師鑒定均為菊科牛蒡?qū)僦参锩^牛蒡的干燥成熟果實(shí)；牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)R1208F45507）、牛蒡苷元對(duì)照品（批號(hào)C14A8Q33977），純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司；HPD-100 大孔吸附樹(shù)脂（河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；H3PO4、氯仿、H2SO4、乙醇，均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇（色譜醇 美國(guó)Fisher Scientific 公司）；超純水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

島津高效液相色譜儀（包括DGU-20A5 在線脫氣機(jī)、LC-20AT 輸液泵、CBM-20A 色譜工作站、SPD-20A 型紫外線檢測(cè)器、SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10ASVP 柱溫箱，日本島津公司）；Kromasil C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm，大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；TU-1810PC 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XS105 型萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；R-1001N 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；LGJ-25C 型冷凍干燥機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；LG-500A 型高速中藥粉碎機(jī)（浙江百信藥機(jī)器械廠）；HH-4 型水浴鍋（金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠）；KQ-500VDE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 毛頭牛蒡子總木脂素有效部位的制備

稱取適量毛頭牛蒡子藥粉，加入15 倍量的58%乙醇回流提取2 次，每次提取62min[5]，濃縮藥液至濃度以生藥計(jì)為0.2g·mL-1，采用徑高比為1∶10的帶閥門玻璃柱，取已預(yù)處理的HPD-100 大孔吸附樹(shù)脂，裝柱，上樣濃度為0.2g·mL-1，以1.5 BV·h-1的流速上樣4BV，7BV 蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)，4BV的70%乙醇以1BV·h-1的流速洗脫，收集洗脫液[6]，洗脫液濃縮至黏稠后，放至-80°C 冰箱冷凍，冷凍完全后在冷凍干燥機(jī)中干燥，成品為淡棕黃色松散粉末，放置在陰涼干燥處，備用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 總木脂素含量測(cè)定所需對(duì)照品溶液 精密稱取牛蒡苷對(duì)照品3mg 置于25mL 容量瓶中，加95 %乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.2 總木脂素含量測(cè)定所需供試品溶液 精密稱取毛頭牛蒡子總木脂素有效部位20mg，用95%乙醇超聲至溶解并定容到10mL 容量瓶中，混勻即得。

1.3.3 牛蒡苷、牛蒡苷元含量測(cè)定所需對(duì)照品溶液精密稱取牛蒡苷、牛蒡苷元對(duì)照品適量，分別置于10mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為牛蒡苷儲(chǔ)備液、牛蒡苷元儲(chǔ)備液。再吸取適量牛蒡苷和牛蒡苷元儲(chǔ)備液混合配成含牛蒡苷2mg·mL-1、牛蒡苷元0.1mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

1.3.4 牛蒡苷、牛蒡苷元含量測(cè)定所需供試品溶液精密稱取毛頭牛蒡子總木脂素有效部位20mg，用甲醇超聲至溶解并定容到10mL 容量瓶中，混勻即得。

1.4 色譜條件

Kromasil C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.3%的磷酸水溶液，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；流速為1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為5μL。在該色譜條件下，牛蒡苷峰和牛蒡苷元峰的理論塔板數(shù)均不低于10000。液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

表1 高效液相色譜儀梯度洗脫程序Tab.1 Elution program of HPLC

2 結(jié)果與討論

2.1 總木脂素含量測(cè)定的最大吸收波長(zhǎng)的確定

分別取總木脂素含量測(cè)定所需對(duì)照品和供試品溶液，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紫外可見(jiàn)光吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectrun

由圖2 可見(jiàn)，對(duì)照品和供試品均在280nm 處有最大吸收峰，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為280nm。

2.2 總木脂素含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 分別置于10mL 容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度搖勻，在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=11.4083X-0.0036，r=0.9993，表明牛蒡苷在0.024~0.072mg·mL-1濃度范圍呈良好的線性關(guān)系，可以用此回歸方程計(jì)算毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中總木脂素的含量。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液2mL 置于10mL 容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次測(cè)定吸光度值，計(jì)算RSD 值。結(jié)果表明，在連續(xù)6 次測(cè)定中，RSD 為0.2%，表明該方法精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液0.2mL 置于25mL 容量瓶中，加95%乙醇稀釋至刻度搖勻，分別于0.5、1、1.5、2、2.5、3h 在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算RSD 值。結(jié)果得RSD 為0.34%，表明供試品溶液在3h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批次毛頭牛蒡子總木脂素有效部位6 份，按“1.3.2”的方法制備，在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD 值。結(jié)果得RSD 為1.61%，表明測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量供試品6份，分別加入相同量的對(duì)照品，按“1.3.2”的方法制備，在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并計(jì)算其回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2，其平均回收率為102.48%，RSD 為1.05%，滿足樣品分析測(cè)試要求。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of recovery test

2.3 牛蒡苷、牛蒡苷元含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL 分別置于5mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，分別進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行回歸分析，得牛蒡苷的線性回歸方程為：Y=2979087.48X+242806.27，r=0.9991，線性范圍為0.2~2mg·mL-1。牛蒡苷元的線性回歸方程為：Y=5575387.95X+10939.96，r=0.9995，牛蒡苷元的線性范圍為0.01~0.1mg·mL-1。結(jié)果表明，牛蒡苷和牛蒡苷元峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，可以計(jì)算毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中牛蒡苷和牛蒡苷元的含量。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“1.4”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定各峰面積。計(jì)算得牛蒡苷峰面積的RSD 為0.83%，牛蒡苷元峰面積的RSD為1.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、12、24、48h 后進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得牛蒡苷含量的RSD 為0.94%，牛蒡苷元峰面積的RSD 為1.30%，表明供試品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6 份總木脂素有效部位，按照“1.3.4”的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算得牛蒡苷的RSD 值為1.25%、牛蒡苷元的RSD 值為1.50%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取6 份總木脂素有效部位，分別精密加入牛蒡苷對(duì)照品0.56mg 和牛蒡苷元對(duì)照品0.032mg，按照“1.3.4”的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算其回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表3，牛蒡苷的平均回收率為100.74%，RSD 為1.61%，牛蒡苷元的平均回收率為102.22%，RSD 為1.76%，滿足樣品分析測(cè)試要求。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of recovery tests

2.4 有效部位中總木脂素的含量測(cè)定

精密稱量毛頭牛蒡子有效部位20mg，按“1.3.2”的方法制備供試品溶液，在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，帶入“2.2.1”的線性回歸方程，計(jì)算出總木脂素含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 總木脂素含量測(cè)定（n=3，%）Tab.4 The content of total lignans（n=3，%）

由表4 可見(jiàn)，毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中總木脂素的含量為95.68 %。

2.5 有效部位中牛蒡苷和牛蒡苷元含量測(cè)定

精密稱量毛頭牛蒡子有效部位20mg，按“1.3.4”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 牛蒡苷和牛蒡苷元含量測(cè)定（n=3，%）Tab.5 The content of arctiin and arctigenin（n=3，%）

由表5 可見(jiàn)，毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中牛蒡苷含量為55.71%，牛蒡苷元含量為2.99%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用確定的最佳提取和富集工藝進(jìn)行制備毛頭牛蒡子總木脂素有效部位，并且采用冷凍干燥技術(shù)干燥收集的洗脫液。對(duì)所制備好的毛頭牛蒡子總木脂素有效部位進(jìn)行化學(xué)成分分析，先采用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其總木脂素的含量，測(cè)得含量為95.68%。再參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行選擇、對(duì)洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中牛蒡苷、牛蒡苷元的含量進(jìn)行測(cè)定，其中，牛蒡苷含量為55.71%、牛蒡苷元含量為2.99%。對(duì)毛頭牛蒡子總木脂素有效部位中總木脂素類成分和主要活性成分牛蒡苷、牛蒡苷元的定性定量分析，為后期有效部位的抗腫瘤活性研究提供了相關(guān)研究數(shù)據(jù)。