• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    貽貝足蛋白fp-5在大腸桿菌中的表達(dá)、修飾與功能分析

    2024-01-25 12:07:44謝紫莎張魯嘉
    生物加工過程 2024年1期
    關(guān)鍵詞:貽貝共表達(dá)殘基

    姚 林,謝紫莎,王 瑞,2,張魯嘉,李 莎,2

    (1. 南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院,江蘇 南京 211800;2. 南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京211800;3. 華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 201100)

    貽貝(mussel)多生長在寒溫帶,屬廣鹽性貝類,遍布世界各沿海國家,其分泌的足絲能夠形成足絲盤固定在海洋礁石上[1-2]。貽貝足絲的主要成分為貽貝足蛋白(Mfp),該蛋白具有卓越的黏附能力、良好的生物相容性和生物降解性,因此在生物醫(yī)藥領(lǐng)域作為一種生物膠黏劑被廣泛研究[3-4]。其中,3,4-二羥基苯丙氨酸(Dopa)在黏附中起到至關(guān)重要的作用,使Mfp能夠通過氫鍵、π-π/π-陽離子相互作用、靜電相互作用、氧化交聯(lián)和金屬-鄰苯二酚配位鍵與底物相互作用[5]。目前已經(jīng)報道的Mfp有6種(Mfp-1~Mfp-6),其中Mfp-5位于貽貝足底部與外界基層接觸部分,Dopa含量高達(dá)25%~30%,是發(fā)揮黏附作用的關(guān)鍵蛋白[6]。

    在天然條件下,通過酸萃取法直接從貽貝足部獲得的蛋白量極少[7-8]。利用基因工程手段在大腸桿菌(E.coli)中合成貽貝足蛋白是一種可行的技術(shù),有望帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。然而,大腸桿菌細(xì)胞無法實(shí)現(xiàn)將酪氨酸殘基羥基化為Dopa的翻譯后修飾過程,而體外通過酪氨酸酶修飾存在效率低的缺陷。Choi等[9]將貽貝融合蛋白fp-151與來自抗生鏈霉菌(Streptomycesantibiocus)的酪氨酸酶(TyrSa)共表達(dá),得到cofp-151,與體外修飾蛋白相比,黏合強(qiáng)度提高了4倍。該研究為改善重組貽貝足蛋白的功能提供了新的思路,而高效的酪氨酸酶是實(shí)現(xiàn)這一過程的關(guān)鍵因素之一。同時,Streptomycescastaneoglobisporu具有更強(qiáng)的黑色素合成能力[10-11],來源于S.castaneoglobisporus的酪氨酸酶(TyrSc)活性更強(qiáng)。此外,來自多刺疣微菌(Verrucomicrobiumspinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)可高效生產(chǎn)L-Dopa,有助于提升Mfp黏合性能[12]。

    為了進(jìn)一步改善Mfp在真核表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)量低、在原核系統(tǒng)中缺乏至關(guān)重要的翻譯后修飾過程的問題,本研究在E.coli中表達(dá)地中海貽貝足蛋白(fp-5),同時將不同來源的酪氨酸酶(TyrSa、TyrSc、和TyrVs)與fp-5共表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)修飾,并對修飾前后的fp-5蛋白測定修飾率和性能,以期為貽貝足蛋白的功能性表達(dá)與潛在應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    使用的菌株、質(zhì)粒和引物列于表1。大腸桿菌E.coliDH5α和大腸桿菌E.coliBL21(DE3)分別作為克隆宿主和表達(dá)宿主。密碼子優(yōu)化后的基因合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司,引物合成及測序驗(yàn)證委托通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司。胰蛋白胨和酵母提取物,Oxoid公司;限制性核酸內(nèi)切酶和Primerstar Max聚合酶,ThermoFisher公司;4×SDS-PAGE上樣緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;來源于蘑菇的酪氨酸酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

    表1 本研究使用的菌株、質(zhì)粒和引物

    1.2 方法

    1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

    從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索得到貽貝足蛋白fp-5的cDNA基因mgfp-5序列(GenBank AY521220.1),并基于大腸桿菌的密碼子使用偏好進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。根據(jù)模板基因序列和pET28a(+)載體設(shè)計(jì)引物P1和P2,擴(kuò)增成熟肽編碼區(qū)域。用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,并回收mgfp-5基因,BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對pET28a(+)質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物雙酶切并膠回收,再將線性質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物在37 ℃下連接30 min,所得質(zhì)粒命名為pET28a(+)-fp5,在N端帶有6×His標(biāo)簽。

    類似地,將編碼不同來源酪氨酸酶的DNA序列合成并分別插入pACYCDuet-1的BamHⅠ/HindⅢ 酶切位點(diǎn)和NdeⅠ/XhoⅠ 酶切位點(diǎn)(TyrSa/ORF438:GenBank M11582.1;TyrSc/ORF378:GenBank AY254101.1/GenBank AY254102.1);pETDuet-1的NdeⅠ/XhoⅠ 酶切位點(diǎn)(TyrVs:GenBank MK550618.1)。得到的質(zhì)粒分別命名為pACYC-TyrSa-438、pACYC-TyrSc-378和pETDuet-TyrVs。用引物對P3/P4從pET28a-fp5擴(kuò)增mgfp-5基因,連接到EcoR Ⅰ/HindⅢ 酶切的pETDuet-TyrVs線性載體上,得到質(zhì)粒pETDuet-TyrVs-fp5。

    1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

    用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pET28a-fp5轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,產(chǎn)物在抗性平板(含25 μg/mL卡那霉素)上均勻涂布,37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的陽性克隆送至測序。

    用CaCl2法制備工程菌E.coli(pET28a-fp5)感受態(tài),然后將pACYC-TyrSa-438、pACYC-TyrSc-378轉(zhuǎn)化至該感受態(tài)細(xì)胞,得到雙載體表達(dá)系統(tǒng)。將pETDuet-TyrVs-fp5轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)酪氨酸酶和fp-5共表達(dá)。同上述方法涂布在相應(yīng)抗性的平板并進(jìn)行驗(yàn)證。

    1.2.3 重組貽貝足蛋白的表達(dá)純化

    挑取測序正確的單克隆接種于5 mL含有25 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基(NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L)中,37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)OD600達(dá)到0.6~0.8,加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h。發(fā)酵結(jié)束后在5 000 r/min、4 ℃下離心20 min收集菌體,并儲存在-80 ℃以供后續(xù)使用。

    將收集的菌體用磷酸緩沖鹽液(PBS)洗滌,參照文獻(xiàn)[13]純化目的蛋白。用Bradford法檢測蛋白質(zhì)含量后冷凍干燥,-80 ℃保存。

    1.2.4 重組貽貝足蛋白的修飾

    1)NBT/Gly染色試驗(yàn)。由于硝基藍(lán)四氮唑(NBT)在堿性條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)具有染色能力,因此常用NBT/Gly染色法檢測多巴和多巴醌的存在。將凍干蛋白粉重溶在0.1 mol/L PBS(pH 7.0)中,使用10 U來源于雙孢蘑菇的商品化酪氨酸酶室溫下振蕩修飾6 h,得到體外酪氨酸酶修飾的fp-5(mfp-5)。牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照,分別將2 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋白溶液滴在PVDF膜表面,37 ℃下過度干燥后,參照文獻(xiàn) [13]進(jìn)行染色試驗(yàn)。

    2)差異光譜法。為了定量酪氨酸酶修飾的fp-5中的Dopa含量,酸-硼酸鹽差異光譜法測定。在堿性pH下Dopa與硼酸鹽配位化合,因此紫外吸收光值更高。用紫外-可見分光光度計(jì)測量1 mmol/L Dopa標(biāo)準(zhǔn)品和修飾后fp-5分別在0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L硼酸鈉中250~350 nm波長處的吸光值。用樣品在0.1 mol/L硼酸鈉中292 nm處的吸光值減去0.1 mol/L HCl中的吸光值,得到差異光譜值。根據(jù)比爾定律(式(1))計(jì)算樣品中Dopa的濃度。

    A=εbc

    (1)

    式中:A—Dopa在292 nm下的吸光差值;ε—摩爾吸光系數(shù),3 200 L/(mol·cm);b—吸收層厚度,cm;c—Dopa的濃度,mol/L。

    再以蛋白濃度計(jì)算得到Dopa的數(shù)量,每個fp-5分子含有20個酪氨酸殘基,由此得到修飾率[14]。

    1.2.5 重組貽貝足蛋白的功能分析

    1)附著力。研究了未修飾和修飾fp-5在不同類型材料表面的涂層能力。具體涂層顯色過程參照文獻(xiàn)[15],增設(shè)了聚苯乙烯和聚乙烯兩種較玻璃具有不同親疏水性的材料。通過Gel-Pro Analyzer軟件(Media Cybernatics,version 4.0.0.4)對蛋白斑點(diǎn)圖像進(jìn)行掃描分析,比較斑點(diǎn)強(qiáng)度。每個樣品重復(fù)測量3次。

    2)黏附力。通過Mfp黏結(jié)兩塊鋁片(寬10 mm×長 100 mm)的搭接剪切實(shí)驗(yàn),可以測量Mfp的大規(guī)模黏附強(qiáng)度。將鋁片依次浸泡在正己烷、丙酮、乙醇和MQ水中15 min,清潔鋁片表面[16]。在室溫下干燥過夜后,在每個鋁片黏附端滴加10 μL的50 g/L乙酸溶液,將5 mg凍干蛋白粉溶解并用抹刀均勻涂抹,2個鋁片覆蓋重疊(10 mm × 10 mm)。為保證重疊區(qū)貼合均勻,用夾子固定,放入37 ℃培養(yǎng)箱3 h進(jìn)一步交聯(lián)。用萬能材料試驗(yàn)機(jī)測量剪切力,用100 N稱重傳感器,剪切方向的速度為 2 mm/min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 序列分析及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    用Signalp-5.0在線軟件[17]進(jìn)行信號肽預(yù)測,通過Neighbor-Joining方法,對細(xì)菌和真菌來源的酪氨酸酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,并對重組載體進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見圖1。由圖1可知:fp-5的成熟肽區(qū)域由76個氨基酸構(gòu)成。經(jīng)NCBI同源性比對,貽貝5型足蛋白具有高度保守序列,來源于紫貽貝(Mytilusedulis)和地中海貽貝(Mytilusgalloprovincialis)的5型足蛋白的氨基酸序列幾乎一致。來源于Verrucomicrobium屬、Strepthomyces屬和Agaricus屬的酪氨酸酶處于不同進(jìn)化枝,其中TyrSa和TyrSc處于相對近距離進(jìn)化枝。為了實(shí)現(xiàn)重組TyrSa/TyrSc的功能表達(dá),插入ORF438/ORF378片段,它們可以促進(jìn)Cu2+進(jìn)入活性位點(diǎn)以具有酶活[18]。如果表達(dá)TyrVs去除C端延伸區(qū)的截?cái)嗖糠?酶活會更高[19]。

    圖1 序列分析及重組載體的驗(yàn)證Fig.1 Sequence analysis and verification of recombinant vector

    通過PCR從克隆質(zhì)粒擴(kuò)增目的基因片段,fp-5、TyrSa、ORF438、TyrSc、ORF378和TyrVs的基因片段的理論大小分別為250、822、441、822、381和1 011 bp。對構(gòu)建的重組載體進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,條帶大小與預(yù)期一致(圖1(d))。再將構(gòu)建的質(zhì)粒送至公司測序驗(yàn)證,插入序列正確,表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

    2.2 重組貽貝足蛋白的表達(dá)與純化

    圖2為重組貽貝足蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果。由圖2可知:E.coli(pET28a-fp5)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能夠表達(dá)分子量~1.24×104的可溶蛋白fp-5,與理論分子量一致,表達(dá)量約為總蛋白量的51%,產(chǎn)量約為19.3 mg/L。N端融合6×His標(biāo)簽的fp-5經(jīng)Ni柱親和層析純化,洗脫得到純度約98%的目的蛋白(圖2(b)),在雙載體和單載體系統(tǒng)中,重組fp-5蛋白與來源于細(xì)菌的酪氨酸酶成功共表達(dá),體內(nèi)修飾fp-5(cofp-5)和TyrVs(~3.80×104)以可溶形式表達(dá),而TyrSa(~3.24×104)和TyrSc(~3.27×104)大部分表達(dá)為包涵體,cofp-5在單載體表達(dá)系統(tǒng)中的分子量(~1.07×104)小于雙載體系統(tǒng)中的分子量(~1.24×104)。ORF438(~1.49×104)或 ORF378(~1.30×104)的分子量與cofp-5相似,因此,它們不能通過SDS-PAGE清楚地區(qū)分。當(dāng)單獨(dú)攜帶pACYC-TyrSa-438或pACYC-TyrSc-378質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)時,ORF438或ORF378僅以不溶性形式存在(數(shù)據(jù)未顯示)。

    圖2 重組蛋白的表達(dá)與純化SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression and purification

    2.3 重組貽貝足蛋白的修飾分析

    通過NBT/Gly氧化還原循環(huán)染色方法,定性檢測Dopa殘基,不同顏色強(qiáng)度的斑點(diǎn)反映了不同水平的Dopa含量,結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知:作為陰性對照的BSA和缺乏Dopa的未修飾fp-5完全沒有被染色,體外修飾的mfp-5可以看到一個淡藍(lán)紫色的斑點(diǎn),與TyrSa體內(nèi)修飾的cofp-5(5-Sa)顏色強(qiáng)度相近。此外,TyrSc體內(nèi)修飾的cofp-5(5-Sc)顏色較淺,而TyrVs體內(nèi)修飾的cofp-5(5-Vs)顯示出最強(qiáng)的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。由此可見,不同修飾方式和酪氨酸酶能夠?qū)p-5蛋白的酪氨酸殘基進(jìn)行不同程度的修飾。

    圖3 cofp-5中酪氨酸殘基修飾的分析Fig.3 Analysis of tyrosine modifications in cofp-5

    進(jìn)一步比較3種表達(dá)系統(tǒng)中cofp-5的產(chǎn)量和酪氨酸的修飾率,結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知:體內(nèi)修飾蛋白5-Vs、5-Sa和5-Sc的產(chǎn)量分別為18.6、27.2和19.1 mg/L。該產(chǎn)量低于先前文獻(xiàn)[20]的fp-5產(chǎn)量(4.5 L培養(yǎng)物產(chǎn)量約為50 mg/L),可能是由于搖瓶試驗(yàn)和發(fā)酵罐發(fā)酵工藝的不同,其中5-Vs表達(dá)量的降低可能是由于TyrVs的大量可溶表達(dá)。

    通過酸-硼酸鹽差異光譜分析定量體內(nèi)修飾cofp-5中Dopa,結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知:5-Vs中的20個酪氨酸殘基中約有11個羥基化為Dopa,修飾率約為55.20%,高于5-Sa(約15.70%)和5-Sc(約26.00%)。目前僅有報道對共表達(dá)修飾前后的黏附性進(jìn)行測試,而未進(jìn)一步分析修飾率[9]??傮w而言,采用共表達(dá)體內(nèi)修飾與體外修飾的貽貝足蛋白(9.6%)相比[21],修飾率顯著提高。

    2.4 重組貽貝足蛋白在不同表面的附著力

    為了研究不同酪氨酸修飾率的fp-5蛋白的附著和涂層性能,本研究對BSA、mBSA(體外修飾的BSA)、fp-5、mfp-5(體外修飾的fp-5)、5-Vs、5-Sa和5-Sc進(jìn)行了對比分析。分別將這幾種蛋白質(zhì)溶液滴在不同種材料的表面,即載玻片(glass)、聚苯乙烯板(PS)和聚乙烯薄膜(PE)。通過振蕩沖洗后考馬斯亮藍(lán)染色,研究蛋白附著力強(qiáng)度,結(jié)果如圖4(a)、4(b)和4(c)所示。由圖4(a)~(c)可知:BSA和mBSA被完全沖掉,未修飾和修飾的fp-5不同程度地黏附在所有測試基材上。修飾后的fp-5表現(xiàn)出顯著的表面包覆能力,而未修飾的fp-5輕微黏附在表面,這表明Dopa不是促成Mfp黏附特性的唯一因素[22]。已有的研究僅對Mfp(fp-5[23]和fp-3[15])體外修飾前后在玻璃表面的附著力進(jìn)行測試,其中fp-5的附著強(qiáng)度僅通過肉眼觀察比較。選取不同親疏水性表面,通過軟件分析斑點(diǎn)強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)在更疏水的表面,Dopa對附著力影響更大,這可能是由于Dopa含有大量的芳香結(jié)構(gòu),通過疏水相互作用附著在疏水材料表面,在Dopa氧化自聚合過程中,逐漸形成更大的共軛結(jié)構(gòu),疏水作用顯著增強(qiáng)。

    圖4 修飾/未修飾fp-5在各種表面涂層分析Fig.4 Recombinant fp-5 with or without tyrosinase modified coating to various surfaces

    通過Gel-Pro軟件對蛋白斑點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4(d)~4(f)所示。由圖4(d)~4(f)可知:5-Vs的蛋白斑點(diǎn)顏色在所有材料表面相對較深。這說明通過酪氨酸酶共表達(dá)修飾,將酪氨酸殘基羥基化為Dopa,Dopa通過π-π/π-陽離子相互作用,從而一定程度提升了重組貽貝足蛋白的附著力。

    2.5 重組貽貝足蛋白的黏附強(qiáng)度

    為了量化重組貽貝足蛋白的大規(guī)模黏附水平,通過搭接剪切試驗(yàn),分別對fp-5、5-Vs、5-Sa和5-Sc黏附鋁片的情況進(jìn)行研究,結(jié)果如圖5(a)所示。對5-Vs進(jìn)行黏附試驗(yàn),結(jié)果見圖5(b)。由圖5(a)可知:未修飾fp-5的剪切強(qiáng)度為(0.07±0.002) MPa,而5-Sa((0.08±0.030) MPa)和5-Sc((0.14±0.006) MPa)的剪切強(qiáng)度值略高于未修飾fp-5的。值得注意的是,cofp-5中黏附強(qiáng)度最大的為5-Vs((0.32±0.02) MPa),約為未修飾的fp-5的4.6倍。這是由于酪氨酸酶體內(nèi)修飾后,Dopa通過形成金屬-鄰苯二酚配位鍵增強(qiáng)黏附作用。盡管cofp-5的整體黏附強(qiáng)度小于之前的文獻(xiàn)報道,其中fp-5的強(qiáng)度為1.11 MPa[20],但這些研究是在不同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行的,并且先前的研究未測試修飾后的黏附強(qiáng)度,難以直接進(jìn)行比較。由圖5(b)可知:力-距離曲線的最高點(diǎn)為黏合頭的物理斷裂處,后逐漸下降。綜上,采用來源于多刺疣微菌的酪氨酸酶體內(nèi)修飾fp-5的策略獲得了具有強(qiáng)黏附特性的貽貝蛋白(5-Vs)。

    圖5 fp-5和cofp-5的大規(guī)模黏附強(qiáng)度Fig.5 Bulk-scale adhesive strength of fp-5 and cofp-5

    3 結(jié)論

    在E.coli中實(shí)現(xiàn)fp-5的共表達(dá)修飾,并對修飾率和黏附性進(jìn)行定量分析,主要結(jié)論如下:

    1)成功在大腸桿菌中共表達(dá)fp-5和酪氨酸酶,實(shí)現(xiàn)酪氨酸殘基體內(nèi)羥基化為Mfp黏附過程中的關(guān)鍵物質(zhì)Dopa。

    2)比較不同體內(nèi)修飾cofp-5的產(chǎn)量和修飾率,篩選出最佳共表達(dá)系統(tǒng),蛋白5-Vs產(chǎn)量18.6 mg/L,修飾率約為55.20%,遠(yuǎn)高于體外修飾效率。

    3)對5-Vs附著力和黏附強(qiáng)度進(jìn)行評價,黏附力約為未修飾fp-5的4.6倍,有望作為生物黏合劑應(yīng)用于生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域。

    猜你喜歡
    貽貝共表達(dá)殘基
    “貽貝之鄉(xiāng)”耕海忙
    基于各向異性網(wǎng)絡(luò)模型研究δ阿片受體的動力學(xué)與關(guān)鍵殘基*
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構(gòu)體中的應(yīng)用
    侵襲性垂體腺瘤中l(wèi)ncRNA-mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
    貽貝、海虹、青口、淡菜……到底有何區(qū)別
    膀胱癌相關(guān)lncRNA及其共表達(dá)mRNA的初步篩選與功能預(yù)測
    全球貽貝產(chǎn)量減少導(dǎo)致貿(mào)易受挫
    中國流行株HIV-1gag-gp120與IL-2/IL-6共表達(dá)核酸疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)免疫研究
    蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)序列與殘基種類間關(guān)聯(lián)的分析
    基于Ⅲumina平臺的厚殼貽貝外套膜轉(zhuǎn)錄組從頭測序
    90打野战视频偷拍视频| 午夜激情av网站| 激情五月婷婷亚洲| 美女扒开内裤让男人捅视频| 91国产中文字幕| 亚洲av在线观看美女高潮| 桃花免费在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产一区二区在线观看av| 免费观看av网站的网址| 免费观看人在逋| 天天操日日干夜夜撸| 人成视频在线观看免费观看| 麻豆av在线久日| 午夜av观看不卡| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av成人精品一二三区| 一本色道久久久久久精品综合| 国产高清国产精品国产三级| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美性长视频在线观看| 女性被躁到高潮视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 高清不卡的av网站| 伦理电影免费视频| 看免费av毛片| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产免费福利视频在线观看| 久久免费观看电影| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品熟女少妇八av免费久了| 性色av乱码一区二区三区2| 美女高潮到喷水免费观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 看免费成人av毛片| 成在线人永久免费视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 在线观看免费日韩欧美大片| bbb黄色大片| 久久久久视频综合| av天堂久久9| 中文字幕av电影在线播放| 精品国产国语对白av| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 自线自在国产av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品第一国产精品| 少妇 在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品一国产av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲欧洲日产国产| 久久人人爽人人片av| 在线观看免费视频网站a站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 91麻豆av在线| 下体分泌物呈黄色| 国产在线观看jvid| 母亲3免费完整高清在线观看| 婷婷丁香在线五月| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 成人国语在线视频| 女性被躁到高潮视频| 涩涩av久久男人的天堂| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产一区二区 视频在线| 一级黄片播放器| av视频免费观看在线观看| 欧美在线一区亚洲| 国产男人的电影天堂91| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美97在线视频| 欧美xxⅹ黑人| 精品一区在线观看国产| 一本综合久久免费| 日本五十路高清| 成人免费观看视频高清| 国产成人免费观看mmmm| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久欧美国产精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲国产欧美在线一区| 韩国精品一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 自线自在国产av| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品一区二区在线观看99| 色94色欧美一区二区| 十八禁网站网址无遮挡| 看十八女毛片水多多多| 久久久亚洲精品成人影院| 精品国产乱码久久久久久小说| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费在线观看日本一区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利视频在线观看免费| 尾随美女入室| 最近中文字幕2019免费版| 一区二区三区精品91| 久久久久视频综合| 美女福利国产在线| 成年av动漫网址| 欧美激情极品国产一区二区三区| 18在线观看网站| 国产精品三级大全| 热99国产精品久久久久久7| 国产高清视频在线播放一区 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久热爱精品视频在线9| 欧美中文综合在线视频| 黑人猛操日本美女一级片| 美女主播在线视频| 视频区图区小说| 中文字幕色久视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜视频精品福利| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品偷伦视频观看了| 国产男人的电影天堂91| 亚洲成人手机| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 天天添夜夜摸| 制服诱惑二区| 一级毛片电影观看| 老汉色∧v一级毛片| 久久久国产精品麻豆| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 九草在线视频观看| 大片电影免费在线观看免费| 黄色 视频免费看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美精品亚洲一区二区| videosex国产| 国产高清videossex| 超碰97精品在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 高清av免费在线| 一级黄色大片毛片| 国产av精品麻豆| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品在线美女| 国产亚洲精品久久久久5区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 婷婷色av中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产免费又黄又爽又色| 亚洲五月婷婷丁香| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品日本国产第一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人91sexporn| 热99国产精品久久久久久7| 另类亚洲欧美激情| 99热网站在线观看| 国产精品一二三区在线看| 午夜福利免费观看在线| 久久影院123| 99久久人妻综合| 亚洲七黄色美女视频| 免费av中文字幕在线| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久久久久久久大奶| 日本a在线网址| 两人在一起打扑克的视频| 色播在线永久视频| 热99国产精品久久久久久7| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 波多野结衣一区麻豆| 成年美女黄网站色视频大全免费| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品九九99| 国产成人精品久久二区二区91| 久久中文字幕一级| 两性夫妻黄色片| 丝袜人妻中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 国产国语露脸激情在线看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 捣出白浆h1v1| 波野结衣二区三区在线| 久久久久精品人妻al黑| 男女无遮挡免费网站观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜影院在线不卡| 久久久久久久国产电影| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲 国产 在线| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲视频免费观看视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 高清黄色对白视频在线免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一级毛片电影观看| 久久久国产一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费高清在线观看视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 99热网站在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产精品国产精品| 欧美激情高清一区二区三区| 国产成人欧美在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 国产成人精品在线电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 日韩视频在线欧美| av网站免费在线观看视频| 成人国产av品久久久| 色网站视频免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品乱久久久久久| 婷婷丁香在线五月| 9色porny在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 咕卡用的链子| 美女视频免费永久观看网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 各种免费的搞黄视频| 午夜福利视频精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久av网站| 国产成人精品无人区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久ye,这里只有精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲人成电影免费在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女高潮到喷水免费观看| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 热re99久久国产66热| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美亚洲日本最大视频资源| 纯流量卡能插随身wifi吗| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产野战对白在线观看| 国产高清视频在线播放一区 | 国产日韩欧美视频二区| 欧美成人午夜精品| 天天影视国产精品| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品熟女久久久久浪| 少妇精品久久久久久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 色婷婷av一区二区三区视频| 黄色a级毛片大全视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久ye,这里只有精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲视频免费观看视频| 在线看a的网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产成人欧美在线观看 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲成人手机| 久久久久久人人人人人| 国产一区二区激情短视频 | 视频区图区小说| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 9热在线视频观看99| 宅男免费午夜| 欧美日韩视频精品一区| 国产视频首页在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | 一本久久精品| 男女午夜视频在线观看| 黄频高清免费视频| 欧美中文综合在线视频| 韩国高清视频一区二区三区| 看免费成人av毛片| 色婷婷av一区二区三区视频| 老司机在亚洲福利影院| 国产欧美亚洲国产| av片东京热男人的天堂| 色婷婷久久久亚洲欧美| 蜜桃在线观看..| 日本一区二区免费在线视频| 我要看黄色一级片免费的| 尾随美女入室| 欧美久久黑人一区二区| 免费在线观看完整版高清| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品三级大全| 久热这里只有精品99| 亚洲综合色网址| 免费黄频网站在线观看国产| 色婷婷av一区二区三区视频| 男人舔女人的私密视频| 一级,二级,三级黄色视频| 青青草视频在线视频观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线观看免费视频网站a站| 少妇人妻 视频| 久久精品久久久久久久性| 精品免费久久久久久久清纯 | 2021少妇久久久久久久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 一级毛片我不卡| 赤兔流量卡办理| av片东京热男人的天堂| 热re99久久精品国产66热6| 香蕉丝袜av| 两个人看的免费小视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色播在线永久视频| kizo精华| www.熟女人妻精品国产| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品免费大片| 国产午夜精品一二区理论片| 99久久精品国产亚洲精品| 一级黄片播放器| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 999精品在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜免费鲁丝| 午夜福利乱码中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 性色av一级| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | av不卡在线播放| 热99久久久久精品小说推荐| 久久性视频一级片| 9191精品国产免费久久| 一区福利在线观看| 人人妻人人澡人人看| 日韩一区二区三区影片| 香蕉丝袜av| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品视频人人做人人爽| 日本vs欧美在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 十八禁人妻一区二区| 9191精品国产免费久久| 男女床上黄色一级片免费看| av一本久久久久| 午夜影院在线不卡| 成年人黄色毛片网站| 亚洲一区中文字幕在线| 久久中文字幕一级| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产免费视频播放在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产福利在线免费观看视频| 黄色a级毛片大全视频| 无遮挡黄片免费观看| 91国产中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 一级片免费观看大全| 久久国产精品影院| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 一区二区三区激情视频| 久久九九热精品免费| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美黄色淫秽网站| 国产真人三级小视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 国产午夜精品一二区理论片| 午夜免费鲁丝| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| av国产久精品久网站免费入址| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品久久久久成人av| 国产福利在线免费观看视频| 久久人人爽人人片av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 美女主播在线视频| 亚洲 国产 在线| 两人在一起打扑克的视频| 国产成人系列免费观看| 91麻豆av在线| 1024香蕉在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 女人久久www免费人成看片| 久久精品国产综合久久久| 香蕉丝袜av| 美女国产高潮福利片在线看| 一区二区三区精品91| 少妇粗大呻吟视频| 国产一区二区在线观看av| 波多野结衣av一区二区av| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产欧美日韩一区二区三 | 一区二区三区乱码不卡18| 国产成人精品久久久久久| 丝袜脚勾引网站| 中国美女看黄片| 婷婷色av中文字幕| 性少妇av在线| 青春草视频在线免费观看| 一级片'在线观看视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 视频区欧美日本亚洲| 夫妻性生交免费视频一级片| 制服人妻中文乱码| 久久精品久久精品一区二区三区| 热99国产精品久久久久久7| 午夜免费男女啪啪视频观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本91视频免费播放| 精品国产一区二区久久| 久久久久久人人人人人| 免费观看a级毛片全部| 亚洲中文字幕日韩| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜福利免费观看在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 又黄又粗又硬又大视频| 99国产精品免费福利视频| bbb黄色大片| 欧美日韩黄片免| 视频在线观看一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲,欧美精品.| 日韩大片免费观看网站| 久久久久久人人人人人| 欧美日韩成人在线一区二区| 热re99久久国产66热| 亚洲久久久国产精品| 午夜av观看不卡| 91精品伊人久久大香线蕉| 搡老岳熟女国产| 欧美日韩成人在线一区二区| 美国免费a级毛片| 日韩电影二区| 亚洲av男天堂| 亚洲精品中文字幕在线视频| 满18在线观看网站| 一级毛片电影观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品人妻1区二区| 亚洲国产av新网站| 飞空精品影院首页| 午夜av观看不卡| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成人免费电影在线观看 | 超碰成人久久| 亚洲精品美女久久av网站| 人人澡人人妻人| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品一区二区免费欧美 | 免费在线观看黄色视频的| 在线观看人妻少妇| 在线观看国产h片| 国产在线免费精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| www.精华液| 欧美黑人欧美精品刺激| 无限看片的www在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲熟女毛片儿| 国产一区二区在线观看av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| xxxhd国产人妻xxx| 免费观看人在逋| 国产精品国产三级国产专区5o| 女警被强在线播放| 久久亚洲精品不卡| 日本av手机在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 日韩 亚洲 欧美在线| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久热在线av| 波野结衣二区三区在线| 亚洲精品第二区| 麻豆国产av国片精品| 在线观看一区二区三区激情| 成人影院久久| 午夜福利在线免费观看网站| 又紧又爽又黄一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 在线观看免费视频网站a站| 一级毛片女人18水好多 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲美女黄色视频免费看| 99久久人妻综合| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品欧美亚洲77777| 赤兔流量卡办理| √禁漫天堂资源中文www| 精品人妻1区二区| 精品国产一区二区久久| 欧美成人午夜精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产成人a∨麻豆精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 99久久人妻综合| 99香蕉大伊视频| 一区二区三区激情视频| 一级片免费观看大全| 成年人午夜在线观看视频| 国产一区二区激情短视频 | netflix在线观看网站| 欧美xxⅹ黑人| 97精品久久久久久久久久精品| 人成视频在线观看免费观看| 在线 av 中文字幕| 电影成人av| 下体分泌物呈黄色| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 青草久久国产| 18禁观看日本| 亚洲伊人久久精品综合| www.自偷自拍.com| 亚洲人成电影免费在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美日韩一级在线毛片| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久国产精品人妻一区二区| 永久免费av网站大全| 免费在线观看日本一区| 午夜福利,免费看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 赤兔流量卡办理| 欧美国产精品一级二级三级| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲中文av在线| 国产在视频线精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成年人午夜在线观看视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 97人妻天天添夜夜摸| 国产成人精品久久久久久| a级毛片黄视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 不卡av一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 美女国产高潮福利片在线看| 精品福利永久在线观看| 五月天丁香电影| 中国美女看黄片| 中文字幕制服av| 黄色片一级片一级黄色片| 自线自在国产av| 亚洲成国产人片在线观看| 精品一区二区三卡| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲第一av免费看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲av日韩在线播放| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 人体艺术视频欧美日本| 黄色 视频免费看| 一级毛片电影观看| 亚洲九九香蕉| 国产一级毛片在线| www.熟女人妻精品国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜精品国产一区二区电影| 中国国产av一级| cao死你这个sao货| 国产深夜福利视频在线观看| 人人澡人人妻人| 亚洲国产欧美一区二区综合| 午夜福利视频在线观看免费| 脱女人内裤的视频|