張新要,侯子航,鄭淑心,劉向陽(yáng),閆筱筱,蒲文宣,崔 紅*
1.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,湖南省長(zhǎng)沙市勞動(dòng)中路386 號(hào) 410007
2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院,鄭州市鄭東新區(qū)平安大道218 號(hào) 450046
煙草葉面腺毛是葉片表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu),能夠特異地合成和分泌二萜化合物、蔗糖酯等多種生物活性物質(zhì)和香氣前體物質(zhì),對(duì)煙株抗性和煙葉品質(zhì)具有積極影響[1-3]。煙堿是煙草特有的次生代謝物質(zhì),影響煙葉的勁頭、吃味和香氣品質(zhì),是評(píng)價(jià)煙葉和卷煙品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[4]。因此,提高煙草腺毛密度和煙堿含量是煙草品種改良的重要目標(biāo),但關(guān)于二者的聚合定向改良還未見(jiàn)報(bào)道。
茉莉酸(Jasmonate acid,JA)信號(hào)分子調(diào)控是提高煙堿含量的重要途徑之一[5]。JAZ(Jasmonate zim domain,JAZ)蛋白是JA 信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子,在SCFCOI1復(fù)合物作用下被26S蛋白酶體降解,釋放茉莉酸信號(hào)途徑的正向調(diào)控因子,促進(jìn)茉莉酸早期應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄[6]。在煙草中,NtJAZ1 與NtMYC2a、NtMYC2b 以復(fù)合物形式存在;在茉莉酸信號(hào)誘導(dǎo)下,NtJAZ1 被降解,NtMYC2a、NtMYC2b得以釋放,并與NtPMT1a啟動(dòng)子G-Box 區(qū)域結(jié)合調(diào)控其轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)煙堿生物合成[7-8]。鄭淑心等[9]利用基因編輯技術(shù),創(chuàng)制了K326 的NtJAZ1基因純合突變株系NK-9,其煙堿生物合成關(guān)鍵基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表達(dá)水平顯著提高,烤后煙葉煙堿含量提高40%以上,但葉面腺毛密度和腺毛分泌物含量有明顯降低。鑒于腺毛及其分泌物對(duì)煙株抗性和煙葉品質(zhì)的重要性,在利用NtJAZ1作為靶點(diǎn)進(jìn)行煙堿含量改良時(shí),如何保證葉片具有較高的腺毛密度至關(guān)重要。煙草腺毛發(fā)生受NtCycB2負(fù)向調(diào)控,敲除該基因之后煙草葉面腺毛密度顯著提高且對(duì)煙株發(fā)育無(wú)明顯影響[10-11]。為了在提高葉片煙堿含量的同時(shí)維持較高的腺毛密度和腺毛分泌物含量,以NtCycB2純合突變株系hairy K326為材料,利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)NtJAZ1進(jìn)行敲除,篩選純合突變株系并進(jìn)行農(nóng)藝性狀、腺毛密度、生物堿含量、烤后煙葉化學(xué)成分的比較分析,擬闡明NtCycB2、NtJAZ1共敲除對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育、腺毛發(fā)生、腺毛分泌物和煙堿積累的影響,為進(jìn)行煙堿和葉面化學(xué)成分的聚合改良奠定基礎(chǔ)。
供試材料為煙草K326 和hairy K326,hairy K326為課題組前期創(chuàng)制的NtCycB2基因突變的多腺毛K326突變株系[10]。hairy K326的種子經(jīng)消毒后接種于MS培養(yǎng)基上,在恒溫(28±1)℃、恒濕60%±2%、16 h 光/8 h 暗的條件下進(jìn)行培養(yǎng),無(wú)菌苗用于遺傳轉(zhuǎn)化。
1.2.1NtJAZ1基因敲除載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化
根據(jù)茄科基因組網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)已發(fā)表的煙草NtJAZ1基因兩個(gè)拷貝的序列(Nitab4.5_0000073g0270.1、Nitab4.5_0004234g0080.1),利用CRISPR2 在 線 軟 件(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)設(shè)計(jì)靶序列:5′-CCTCAAGAAGTTATT TCTACTGC-3′,合成二聚體后構(gòu)建NtJAZ1基因敲除載體(pCBSG012-JAZ1),見(jiàn)圖1。
圖1 NtJAZ1基因敲除載體結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of NtJAZ1 knockout vector
采用葉盤(pán)法[12]對(duì)hairy K326 進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。葉圓片經(jīng)侵染和共培養(yǎng),置于分化培養(yǎng)基(MS+Cef 0.500 00 g/L +Hyg 0.006 00 g/L + 6-BA 0.001 00 g/L + NAA 0.000 15 g/L)上進(jìn)行分化篩選,不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+Hyg 0.008 00 g/L+NAA 0.000 10 g/L)進(jìn)行培養(yǎng),獲得潮霉素抗性植株。
1.2.2 分子鑒定
提取潮霉素抗性苗DNA,利用引物1(F1:5′-CTAGGAAAGGCTAAAAAGAAACAGT-3′;R1:5′-GGATTGTGATATTGGCTGAGTT-3′)和引物2(F2:5′-CGAAATTCTTGAGTCAAATTGG-3′;R2:5′-AAC ATTTTAGAAGTTGGAGGAG-3′),分別對(duì)NtJAZ1-1、NtJAZ1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送華大基因進(jìn)行序列測(cè)定。突變單株自交收獲種子,并進(jìn)行純合鑒定。
1.2.3 煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查
試驗(yàn)材料于2021年3月移栽種植于湖南瀏陽(yáng)隔離封閉試驗(yàn)田,田間種植和管理按照烤煙栽培技術(shù)流程[13]和當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉栽培規(guī)程進(jìn)行。按標(biāo)準(zhǔn)方法在煙草初花期分別測(cè)量株高、葉片數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、莖圍、節(jié)距等農(nóng)藝性狀指標(biāo)[14]。
1.2.4 煙草生物堿的提取和測(cè)定
分別在煙草現(xiàn)蕾期、打頂后1 周和成熟期取K326、hairy K326和J-21株系中部葉片,測(cè)定生物堿含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。將殺青后的鮮煙葉烘干碾磨,過(guò)0.25 mm 孔徑的樣品篩。取200 mg 煙末,在堿性條件下用甲基叔丁基醚(MTBE)提取生物堿,以正十六烷為內(nèi)標(biāo),參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[15]通過(guò)氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)定量檢測(cè)生物堿含量,3次重復(fù)。
1.2.5 腺毛形態(tài)觀察及密度統(tǒng)計(jì)
在煙草現(xiàn)蕾期選取上部葉片(長(zhǎng)度約10 cm)進(jìn)行腺毛觀察。使用0.2%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))羅丹明B溶液染色20~30 min,用無(wú)菌水清洗后采用超景深顯微鏡(VHX-5000,日本基恩士公司)進(jìn)行腺毛形態(tài)觀察和密度統(tǒng)計(jì)。
1.2.6 煙草葉面化學(xué)成分分析
在煙草中部葉片成熟期,選取5 株生長(zhǎng)發(fā)育一致、健壯無(wú)病害的煙株,取第12葉位的葉片,參照李旖梅等[16]的方法進(jìn)行葉面化學(xué)成分的萃取和檢測(cè),3次重復(fù)。
1.2.7 常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定
選取烤后B2F 等級(jí)煙葉,采用連續(xù)流動(dòng)化學(xué)分析儀(AA3,德國(guó)SEAL),按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[17-19]測(cè)定水溶性總糖、還原糖、煙堿、氯、鉀含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),3次重復(fù)。
1.2.8 中性香氣物質(zhì)測(cè)定
選取B2F 等級(jí)烤后煙葉,參照趙銘欽等[20]的方法測(cè)定煙葉中性香氣成分含量。
1.2.9 數(shù)據(jù)分析
使用SPSS 17 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素(One-way ANOVA)方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)(LSD 法,P<0.05 或P<0.01),使用SigmaPlot 14.0 數(shù)據(jù)分析繪圖軟件制圖。
以hairy K326 為材料,進(jìn)行NtJAZ1基因編輯載體的遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過(guò)潮霉素篩選后,共獲得了38 株陽(yáng)性植株。利用特異引物對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序,有10 株在gRNA 區(qū)域檢測(cè)到序列突變,基因編輯效率為26.32%。其中,J-21中的NtJAZ1-1和NtJAZ1-2均發(fā)生突變,NtJAZ1-1在250~253 bp 處4 個(gè)堿基發(fā)生了替換,NtJAZ1-2序列在254~255 bp處缺失了A和G 2 個(gè)堿基(圖2A)。NtJAZ1-1和NtJAZ1-2所發(fā)生的序列突變均導(dǎo)致翻譯提前終止和功能缺失(圖2B)。
圖2 NtJAZ1基因敲除株系的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of NtJAZ1 knockout lines
K326、hairy K326 和J-21 漂浮育苗,于2021年3月移栽種植于湖南瀏陽(yáng)封閉試驗(yàn)田中。在整個(gè)生育期中,J-21 生長(zhǎng)發(fā)育正常,大田長(zhǎng)勢(shì)與K326 和hairy K326無(wú)明顯區(qū)別(圖3)。煙株農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示,與K326 和hairy K326 相比,J-21 株系在株高、葉數(shù)、葉長(zhǎng)和葉寬等方面雖有所變化,但均無(wú)顯著差異;與K326 相比,J-21 和hairy K326 的節(jié)距明顯減小,莖圍有所增加,見(jiàn)表1。
表1 煙株農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析①Tab.1 Statistical analysis of agronomic characteristics of tobacco plants
圖3 田間煙株形態(tài)觀察Fig.3 Morphological observation of tobacco plants in the field
在現(xiàn)蕾期分別對(duì)K326、hairy K326 和J-21 的上部葉片進(jìn)行腺毛觀察和密度統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖4(A,B)所示。從圖4 中可以看出,J-21 株系腺毛發(fā)育完善,腺頭飽滿,羅丹明染色后呈現(xiàn)深紫紅色。腺毛密度統(tǒng)計(jì)結(jié)果依次為hairy K326>J-21>K326,J-21株系的腺毛密度比K326 提高113.18%,但比hairy K326有所降低。這說(shuō)明NtCycB2基因敲除能夠顯著提高腺毛密度,NtJAZ1基因敲除對(duì)腺毛密度有負(fù)面影響,而NtCycB2和NtJAZ1基因共敲除能提高腺毛密度并促進(jìn)腺頭發(fā)育。
圖4 腺毛形態(tài)觀察和葉面化學(xué)成分分析Fig.4 Morphological observation of trichome and analysis of leaf surface chemical components
利用GC/MS 技術(shù)對(duì)K326、hairy K326 和J-21 成熟的中部葉片進(jìn)行葉面化學(xué)成分的萃取和分析,結(jié)果如圖4(C、D)所示。從圖4 中可以看出,K326、hairy K326和J-21的葉面化學(xué)成分組成一致,含量高低依次為J-21>hairy K326>K326,J-21的葉面化學(xué)成分總含量比K326和hairy K326分別提高156.35%和41.65%。其中,西柏烷二萜含量分別比K326 和hairy K326提高192.49%和34.46%,蔗糖酯含量分別比K326 和hairy K326 提高113.50%和65.90%,烷烴含量無(wú)明顯變化。表明NtCycB2基因和NtJAZ1基因共敲除對(duì)葉面化學(xué)成分積累有積極影響。
分別對(duì)現(xiàn)蕾期、打頂后1周和成熟期的中部葉片進(jìn)行生物堿含量測(cè)定,結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出,K326、hairy K326 和J-21 的生物堿均由煙堿、新煙草堿、降煙堿和假木賊堿組成。其中,煙堿含量占生物堿總量的90%以上。隨著葉片的生長(zhǎng)發(fā)育,煙堿含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與K326 和hairy K326相比,J-21 的煙堿含量均極顯著提高?,F(xiàn)蕾期煙堿含量差距最為明顯,J-21 分別比K326 和hairy K326提高213.33%和261.54%;打頂后J-21煙堿含量提高幅度減少,分別比K326和hairy K326提高29.73%和27.43%;在成熟采收期,J-21 的煙堿含量比K326 和hairy K326 分別提高37.14%和32.28%。說(shuō)明NtCycB2和NtJAZ1基因共敲除在提高腺毛密度和分泌物含量的同時(shí),對(duì)生物堿合成也具有明顯的促進(jìn)作用,而且主要發(fā)生在打頂前。
2.5.1 常規(guī)化學(xué)成分分析
對(duì)不同材料的B2F等級(jí)煙葉進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定,結(jié)果如表2所示。從表2 中可以看出,與對(duì)照相比,J-21 的煙堿、總氮和鉀含量顯著提高。其中,J-21 的煙堿含量分別比K326 和hairy K326 提高39.81%和45.32%,J-21 的總氮含量分別比K326 和hairy K326 提高18.97%和13.74%,J-21 的鉀含量分別比K326 和hairy K326 提高43.70%和21.25%。總糖含量相比于K326 有所下降,比hairy K326 則有所提升,還原糖含量相比于K326 和hairy K326 均有所下降,氯含量無(wú)顯著變化??傮w來(lái)看,各化學(xué)成分含量均處在適宜范圍內(nèi)。
表2 烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分分析Tab.2 Results of routine chemical components in cured tobacco leaves
2.5.2 中性香氣成分分析
采用GC/MS 技術(shù)對(duì)B2F 等級(jí)煙葉進(jìn)行中性香氣物質(zhì)分析,結(jié)果如表3所示。從表3 中發(fā)現(xiàn),J-21的中性致香物質(zhì)總量增加,分別比K326 和hairy K326 提高13.79%和5.44%。其中,西柏烷類降解產(chǎn)物茄酮的含量增幅較高,比K326 增加217.49%,比hairy K326 增加48.45%,這與葉面化學(xué)成分檢測(cè)結(jié)果的變化趨勢(shì)相一致。另外,J-21 的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、新植二烯含量也有明顯增加。
表3 中性致香物質(zhì)成分分析Tab.3 Results of neutral aroma components in cured tobacco leaves
腺毛密度和煙堿含量與煙株抗性和煙葉品質(zhì)密切相關(guān),二者都是煙草品種改良的重要目標(biāo)。NtJAZ1 通過(guò)與NtMYC2 結(jié)合抑制煙堿生物合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),是進(jìn)行高煙堿煙草定向改良的理想靶點(diǎn)之一[7]。但在K326 的NtJAZ1基因敲除純合株系中,葉面腺毛密度明顯降低[9]。這說(shuō)明NtJAZ1基因功能缺失在促進(jìn)煙堿合成的同時(shí),對(duì)腺毛發(fā)生具有一定的抑制作用,并對(duì)煙株抗性和煙葉品質(zhì)產(chǎn)生不利的影響。煙草腺毛發(fā)育與煙堿合成同樣受到茉莉酸信號(hào)的誘導(dǎo),這在本氏煙中已有報(bào)道,Yan X等[21]發(fā)現(xiàn)NbJAZ3基因在MeJA誘導(dǎo)本氏煙長(zhǎng)柄腺毛發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
為彌補(bǔ)NtJAZ1敲除對(duì)腺毛發(fā)生的不利影響,在提高煙堿含量的同時(shí)維持較高的腺毛密度,本研究中以NtCycB2基因敲除的多腺毛K326 突變品系hairy K326 為材料,進(jìn)行NtJAZ1基因編輯,獲得了NtCycB2、NtJAZ1同時(shí)突變的純合株系J-21,其煙堿含量比對(duì)照提高了39.81%,這與在K326 中單敲NtJAZ1基因的結(jié)果相一致,而且兩個(gè)材料都表現(xiàn)出打頂前煙堿含量增幅較大,打頂后增幅降低的趨勢(shì)[9]。其原因可能是在正常情況下,打頂刺激了茉莉酸的大量合成,導(dǎo)致NtJAZ1被降解,促進(jìn)煙堿合成加速;而在NtJAZ1功能缺失之后,煙株對(duì)打頂刺激的敏感性降低,因而導(dǎo)致了煙堿合成增幅明顯下降。與單敲NtJAZ1基因相比,NtCycB2、NtJAZ1雙敲株系J-21腺毛密度和分泌物含量比K326顯著提高;與NtCycB2基因敲除的hairy K326相比,J-21腺毛密度雖有所降低,但分泌物含量卻明顯提高。由此推測(cè),NtJAZ1對(duì)腺毛的物質(zhì)代謝具有一定的促進(jìn)作用,腺毛形態(tài)觀察和羅丹明組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了這一推論。
NtCycB2、NtJAZ1雙敲對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響,而且表現(xiàn)出較強(qiáng)的田間綜合抗性,這可能與其多腺毛、高煙堿的特性有關(guān)。已有的研究證明,NtCycB2敲除導(dǎo)致的多腺毛煙草具有較高的耐旱[22]、耐鹽[23]、抗蟲(chóng)[24]、耐鎘[25]能力。當(dāng)然,NtCycB2、NtJAZ1雙敲導(dǎo)致煙堿含量和腺毛分泌物含量的顯著提高,這對(duì)煙葉感官品質(zhì)及工業(yè)可用性的影響還有待于進(jìn)一步深入研究。
通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)創(chuàng)制了NtCycB2和NtJAZ1共敲除的K326 突變株系J-21。研究發(fā)現(xiàn),NtCycB2和NtJAZ1共敲除在不影響煙株正常的生長(zhǎng)發(fā)育的前提下,與K326 相比,葉面腺毛密度和腺毛分泌物含量分別提高113.18%和156.35%,烤后煙葉西柏烷類降解產(chǎn)物茄酮含量提高217.49%,煙堿含量提高39.81%,這表明NtCycB2和NtJAZ1在煙堿含量和腺毛密度的聚合定向改良中具有較大的應(yīng)用潛力。