乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定

陳盛

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中非常重要的活性物質(zhì)，具有多種生理功能。γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮度上起著重要作用，具有安神、降血壓、改善肝腎功能、促進睡眠、緩解焦慮、抗抑郁等多種生理功效。

現(xiàn)有的食品中，γ-氨基丁酸檢測的手段主要有酶法、比色法、液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。其中，高效液相色譜法因高準(zhǔn)確度、高靈敏度等優(yōu)勢應(yīng)用較為廣泛，但是由于γ-氨基丁酸對紫外、可見光不靈敏，必須被衍生化后加上發(fā)光基團后才能被高效液相色譜的紫外或熒光檢測器檢測到，其衍生產(chǎn)物并不穩(wěn)定，對檢測結(jié)果影響較大。

本研究建立了使用氨基酸分析儀檢測乳與乳制品中γ-氨基丁酸含量的方法，其利用γ-氨基丁酸水溶性的特點，經(jīng)鹽酸水解后，經(jīng)離子交換柱層析分離，與茚三酮溶液產(chǎn)生顯色反應(yīng)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量檢測出其含量。整個操作過程快速簡單，不需要額外衍生，提取效率高，適合乳與乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定。

1.實驗部分

1.1試劑和材料

1.1.1試劑

鹽酸（HCl）：濃度≥36%，優(yōu)級純。

氫氧化鈉（NaOH）：優(yōu)級純。

檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）：優(yōu)級純。

苯酚（C6H5OH）：優(yōu)級純。

檸檬酸三鈉（二水）：優(yōu)級純。

硼酸：優(yōu)級純。

醋酸鈉：優(yōu)級純。

醋酸鉀：優(yōu)級純。

冰乙酸：優(yōu)級純。

茚三酮：優(yōu)級純。

1.1.2試劑配制

鹽酸溶液（6mol/L）：取500mL 鹽酸加水稀釋至1000mL，混勻。

NaoH溶液：稱取50gNaoH，溶于50mL 水中，用水定容至100mL后混勻備用。

檸檬酸鈉緩沖溶液：稱取19.6g檸檬酸鈉加水溶解，后加入16.5mL鹽酸，用水定容至1000mL，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.2。

1.1.3氨基酸分析儀上所使用溶液配制

緩沖液Buffer A：取11.8g檸檬酸三鈉+6.0g檸檬酸+0.5g苯酚溶于水中，加入濃鹽酸6.5mL、甲醇65mL，混勻后用HCl溶液和NaOH溶液調(diào)pH值到3.45，最后定容至1L，過膜待用（0.45μm）。

緩沖液Buffer B：取19.6g檸檬酸三鈉+5.0g硼酸+3.1g氫氧化鈉溶于水中，混勻后用HCl溶液和NaOH溶液調(diào)pH值到10.85，最后定容至1L，過膜待用（0.45μm）。

4mol鉀/鈉醋酸緩沖液（pH 5.51）：取272.0g三水醋酸鈉、196.0g醋酸鉀，加入500mL水及200mL乙酸溶解?；旌暇鶆?，用乙酸調(diào)pH值到5.51后，定容至1L，過膜待用（0.45μm）。

茚三酮衍生溶液：取20g茚三酮+600mL、甲醇+2g苯酚攪拌溶解；加入400mL 4mol鉀/鈉醋酸緩沖液混合均勻，定容至1L儲備液待用；最后向溶液中加入還原劑，充入氮氣2分鐘。

清洗溶液：600mL異丙醇與400mL去離子水混合。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品 ：γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，天津埃爾塔公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取 0.0100g 標(biāo)準(zhǔn)品（4.3）置于10.0mL 棕色容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為1.0mg/mL，4oC冰箱中保存，有效期3個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液（4.4.1）1.0mL至10.0mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為100μg/mL，4oC冰箱中保存，有效期1個月。

1.3儀器和設(shè)備

氨基酸分析儀：賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司。電子天平：BP211D，Sartorius公司。

漩渦混合器——TALBOYS（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；鼓風(fēng)干燥箱（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.4分析步驟

1.4.1樣品前處理

稱取試樣1g（精確到0.0001g）置于水解瓶中，加入10mL6mol/L 鹽酸溶液（1.2.1），并加入3-4滴苯酚。將水解瓶放入冰箱冷凍室內(nèi)，冷凍約3min-5min后，抽真空后充入氮氣（重復(fù)抽真空-充入氮氣3次），在充氮氣狀態(tài)下擰緊螺絲蓋。將水解瓶置于110℃±1℃的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出后冷卻至室溫。

打開水解瓶，將水解液過濾至50mL離心管中。準(zhǔn)確吸取1.0mL濾液移入15mL玻璃試管中，用試氮吹儀在40℃-50℃水浴中下吹干。

加入1.0mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液到15mL試管內(nèi)溶解殘渣，振蕩混勻后，吸取溶液過膜待用（0.22μm）。

1.5測定條件

1.5.1 氨基酸分析儀條件

色譜柱： LCA K06/Na柱。

流動相：檸檬酸鈉A=0.12N，pH 3.45；B=0.2N，pH10.85。

流速：洗脫泵 0.45mL/min+衍生泵 0.25mL/min。

柱溫：58℃-70℃梯度控溫。

進樣體積：50μL。

檢測波長：440nm及570nm。

壓力：30bar-40bar 。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，用水定容，再得到濃度分別為：50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液注入氨基酸分析儀，得到各組分的色譜圖和峰面積。以目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

2.結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系

在濃度為50-2000μg/L，γ-氨基丁酸的峰面積與其濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程 y=0.8701x+2.1092，R2=1。具體見表1、圖1。

2.2儀器精密度

配制濃度為1μg/mL的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，連續(xù)進樣6次，其峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%。其結(jié)果見表2、圖2。

2.3 檢出限和定量限

根據(jù)γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積計算，當(dāng)信噪比（S/N）為3時，測得儀器的檢出濃度為50μg/L，得到方法的檢測限為0.5mg/kg；方法的定量限則為1.5mg/kg。

2.4回收率、精密度及空白試驗

以純牛奶及奶酪為空白樣品，分別在樣品中添加γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收試驗，添加濃度分別為50、100、200mg/kg， 每個濃度3個平行。結(jié)果見表3。

3.小結(jié)與討論

本文實驗結(jié)果表明，氨基酸分析儀可以用于乳與乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定。該方法比高效液相色譜法減少了手動衍生的步驟，可直接進行測定，操作簡單，節(jié)省時間，同時衍生產(chǎn)物較高效液相色譜法穩(wěn)定。用氨基酸分析儀測量乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量的方法簡單快速，在濃度為50-2000μg/L，γ-氨基丁酸的峰面積與其濃度呈良好的線性關(guān)系。該方法豐富了乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量的測定方法，可為研究乳及乳制品中γ-氨基丁酸含量提供技術(shù)參考。