核因子E2相關(guān)因子2在炎癥性腸病中抗腸纖維化的作用機制*

范夢磊 陳 可 鮑文揚 楊舒凡 陶 瑞 王小云

南通大學(xué)無錫臨床學(xué)院消化內(nèi)科（214002）

腸纖維化是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD）并發(fā)腸梗阻的重要原因之一。纖維化是由炎癥引起的“生理過程”，在炎性受損的腸道組織修復(fù)過程中，腸成纖維細胞代償性地激活、增殖、擴張成腸肌成纖維細胞，后者分泌適宜水平的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）進行組織損傷修復(fù)。一旦組織損傷修復(fù)完成后，ECM 被基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）降解，腸肌成纖維細胞發(fā)生凋亡或恢復(fù)到非激活狀態(tài)。但在IBD 中，腸成纖維細胞在慢性炎癥反應(yīng)的反復(fù)刺激下被持續(xù)激活為腸肌成纖維細胞，繼而分泌過量的ECM，當ECM 的產(chǎn)生與降解失衡，就會導(dǎo)致腸纖維化發(fā)生[1]。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是細胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，具有抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）自由基和炎癥反應(yīng)的作用[2]。近年研究表明Nrf2 在腸纖維化中通過多種途徑發(fā)揮保護作用，本文簡要綜述Nrf2在IBD相關(guān)腸纖維化進程中發(fā)揮的作用和相關(guān)機制。

一、Nrf2的基本結(jié)構(gòu)和激活

Nrf2 由NFE2L2 基因編碼，分子質(zhì)量為67.8 kDa，是細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制性轉(zhuǎn)錄因子，與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。生理條件下，位于細胞質(zhì)的Nrf2 與其抑制子Kelch 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）穩(wěn)定結(jié)合，前者持續(xù)地被Keap1-Cul3 泛素連接酶E3 復(fù)合體泛素化，并可被蛋白酶降解[3]。在炎癥反應(yīng)或應(yīng)激狀態(tài)下，巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞內(nèi)的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶通過呼吸作用產(chǎn)生大量具有細胞毒性的ROS[4]。這些ROS還可以氧化Keap1中的半胱氨酸殘基，使Keap1-Cul3 泛素化系統(tǒng)遭到破壞，Nrf2 便不再被降解，并與Keap1 解離后移位到細胞核中[5]。在細胞核中，Nrf2與小Maf 蛋白形成異二聚體，并與抗氧化基因的上游啟動子區(qū)的抗氧化原件結(jié)合，繼而激活血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）等抗氧化基因的表達，進而促進下游抗氧化酶的表達來清除ROS氧自由基[6]。

二、Nrf2在正常生理情況下抗腸纖維化的作用機制

在正常生理情況下，腸上皮細胞受病原體、炎癥因子刺激后可釋放趨化因子，以招募炎性巨噬細胞和中性粒細胞吞噬入侵的病原體，細胞內(nèi)的NADPH 氧化酶通過呼吸作用產(chǎn)生適量水平的ROS，開始啟動對病原體直接殺傷的氧依賴途徑[7]。ROS又可以通過激活核因子-κB（nuclear factor-κB,NFκB）、NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 炎癥小體等途徑刺激炎癥因子的增加，促使腸上皮細胞炎癥反應(yīng)加劇，發(fā)揮腸上皮細胞的“自身防衛(wèi)”功能[8]。此時，這些ROS 和炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、白細胞介素（interleukin,IL）-1β 等可作為致纖維化因子激活具有分泌ECM 能力的腸肌成纖維細胞，通過產(chǎn)生和釋放ECM 對受損的腸黏膜組織進行修復(fù)[9]。為避免過量的ROS 和炎癥因子引發(fā)慢性持續(xù)性腸黏膜炎癥反應(yīng)，在ROS和炎癥因子的刺激下Nrf2代償性活化并調(diào)控下游抗氧化酶的表達，清除過多的ROS和炎癥因子，使其在細胞中維持適宜水平。Nrf2與ROS之間維持微妙的平衡關(guān)系，即氧化還原平衡，既不會使ROS水平過低不利于清除外源性病原體，又不會使ROS水平過高引起腸黏膜炎癥反應(yīng)的持續(xù)加劇，繼而抑制了腸肌成纖維細胞的持續(xù)過度激活，使ECM 蛋白的生成與降解之間保持平衡，顯著抑制腸纖維化的發(fā)生。Khor等[10]證明，在缺乏Nrf2的小鼠中誘發(fā)急性結(jié)腸炎會導(dǎo)致腸黏膜炎癥反應(yīng)加重，Nrf2是保護腸上皮屏障完整性的重要轉(zhuǎn)錄因子。

三、Nrf2在IBD中抗腸纖維化的作用機制

1.Nrf2 與NF-κB 信號通路介導(dǎo)的腸纖維化：NF-κB 信號通路促進腸道炎癥反應(yīng)和相關(guān)腸纖維化的發(fā)生。Rahmani等[11]證明在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎相關(guān)的腸纖維化模型中，瑞格色替（rigosertib）可通過抑制NF-κB 激活來降低小鼠結(jié)腸組織膠原沉積和促纖維化基因Col1a1、Col1a2、Acta2 的表達，以此達到緩解腸纖維化的作用。MMP-9 可通過刺激成纖維細胞活化和膠原合成來促進腸纖維化，同樣受到NF-κB 的調(diào)節(jié)，輔酶Q10 通過抑制NF-κB/MMP-9 通路可減輕放射性腸病相關(guān)腸纖維化程度[12]。在三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS）誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎相關(guān)纖維化模型中，特異性阻斷NF-κB可抑制腸道炎癥反應(yīng)和ECM的廣泛沉積[13]。

Nrf2及其調(diào)節(jié)的抗氧化酶不僅具有抗氧化能力，還能直接抑制NF-κB 的激活及其調(diào)控的具有促纖維化作用的炎癥因子，以此達到緩解腸纖維化的作用。作為Nrf2 激動劑，寡聚糖可通過抑制NF-κB 及其下游TNF-α、IL-6 炎癥因子來減少TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化模型大鼠的腸道Ⅰ型膠原蛋白和α 平滑肌肌動蛋白沉積[14]。同樣，有研究[15]表明藥物黃腐酚（xanthohumol）能通過激活Nrf2/RAGE/NF-κB 緩解2型糖尿病誘導(dǎo)的肝纖維化。

2.Nrf2與輔助性T 細胞（T helper cell,Th）17/調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell,Treg 細胞）失衡介導(dǎo)的腸纖維化：Treg 細胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，Th17 則較多地發(fā)揮啟動細胞炎癥反應(yīng)的作用，Th17/Treg 細胞失衡不僅破壞腸道免疫穩(wěn)態(tài)，還在腸道炎癥反應(yīng)和腸纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。在腸道炎癥反應(yīng)和相關(guān)腸纖維化中，Th17 及其分泌的IL-17 炎癥因子發(fā)揮促進作用，而由Treg 細胞分泌的IL-10 則發(fā)揮抑制作用。對IL-10基因敲除小鼠予以IL-10治療，可促進腸道組織抑制素的表達并緩解IBD 相關(guān)腸纖維化水平[17]。Li 等[18]的研究表明與IgG 處理的TNBS 小鼠結(jié)腸炎相比，經(jīng)IL-17 抗體處理的TNBS 小鼠結(jié)腸炎和腸纖維化明顯改善，膠原蛋白3、IL-17、TNF-α、MMP 抑制劑-1 和MMP-2 mRNA 和蛋白表達水平均明顯降低。Zhang 等[19]發(fā)現(xiàn)在TNBS 誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎模型中，予以IL-17A 抗體治療可通過減少上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）來減輕結(jié)直腸纖維化。藥物黃蜀葵花總黃酮通過降低TNBS 小鼠結(jié)腸炎血清和組織中IL-17水平，以及升高由Treg細胞產(chǎn)生的IL-10水平來調(diào)節(jié)Th17/Treg 細胞平衡，繼而抑制纖維化相關(guān)膠原Col1a2、Col3a2 和平滑肌肌動蛋白表達，減緩腸纖維化發(fā)生、進展[20]。

Nrf2 及其下游抗氧化酶HO-1 可以通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡減輕IBD 腸道炎癥反應(yīng)。研究表明HO-1促使小鼠結(jié)腸炎模型中腸系膜淋巴結(jié)和脾臟的Th17/Treg細胞比例下降，并下調(diào)維甲酸相關(guān)孤兒受體γt的表達和IL-17A 水平，上調(diào)Foxp3 的表達和IL-10 水平，促使初始CD4+T 細胞從Th17向Treg細胞分化，從而減輕小鼠結(jié)腸炎癥反應(yīng)[21]。雙氫青蒿素在小鼠結(jié)腸炎模型中通過促進腸黏膜組織中HO-1表達來降低脾臟和腸黏膜固有層中Th1、Th17、Th9 和Th22 細胞數(shù)量，增加Treg 細胞數(shù)量[22]。以上多項研究為Nrf2/HO-1 通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 細胞平衡減輕IBD 腸道炎癥相關(guān)纖維化提供了證據(jù)。

3.Nrf2與轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor,TGF）-β1/Smads 信號通路介導(dǎo)的腸纖維化：①TGF-β1/Smads 信號通路通過產(chǎn)生ROS促進腸纖維化。TGF-β1作為經(jīng)典的促纖維化因子，主要由間質(zhì)細胞或巨噬細胞產(chǎn)生，通過TGF-β1/Smads 信號通路的經(jīng)典途徑促進Snai1 等促纖維化基因轉(zhuǎn)錄[23]。近年來發(fā)現(xiàn)ROS是誘導(dǎo)腸纖維化的重要介質(zhì)，ROS可作為TGF-β1/Smads 信號通路的下游分子，對腸纖維化有促進作用[9]。腸成纖維細胞表面的TGF-β1配體-受體復(fù)合物經(jīng)胞內(nèi)的磷脂酰肌醇3-激酶或SMAD2/3 蛋白激活NADPH 氧化酶4，繼而促進ROS 產(chǎn)生。ROS 的增多可通過促進腸成纖維細胞激活轉(zhuǎn)化為腸肌成纖維細胞、EMT、纖溶酶原激活物抑制劑1 表達增加等方式促進腸纖維化[24]。腸上皮細胞在EMT 過程中失去自身的分化表型，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞，以此獲得分泌ECM 蛋白的潛力。Rieder等[25]發(fā)現(xiàn)，清除過多的ROS能抑制TGF-β1 引發(fā)的EMT 進程，繼而抑制腸纖維化。纖溶酶原激活物抑制劑1 通過抑制ECM 蛋白的降解促進腸纖維化進展。此外，TGF-β1又通過抑制抗氧化酶如HO-1、谷胱甘肽過氧化物酶、SOD 等的表達，間接減少了ROS 的消除[26]。同樣ROS可促進非活性狀態(tài)的TGF-β1前體脫離TGF-β結(jié)合蛋白和TGF-β 前肽而被激活增多，繼而促進TGF-β1/Smads信號通路介導(dǎo)腸纖維化作用[27]，以此形成ROS 和TGF-β1 共同增多的惡性循環(huán)，ROS 和TGF-β1/Smads 信號通路發(fā)揮協(xié)同作用，共同推動IBD 腸纖維化的發(fā)生、進展。②Nrf2 通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路延緩腸纖維化。Nrf2 及其調(diào)節(jié)的抗氧化酶通過清除體內(nèi)ROS 抑制TGF-β1/Smads 信號通路，繼而抑制下游NOX4 釋放更多的ROS，減弱了ROS 和TGF-β1 的促腸纖維化協(xié)同作用[24,26]。Guan 等[28]在小鼠腸纖維化模型中給予Nrf2激動劑特丁基對苯二酚處理，小鼠結(jié)腸組織中的TGF-β1 及其下游Smad2/3 通路蛋白表達降低，炎癥指標如髓過氧化物酶、TNF 和纖維化指標如Ⅰ型膠原纖維、平滑肌肌動蛋白的mRNA和蛋白表達均降低。應(yīng)用熒光探針檢測TGF-β1 刺激腸成纖維細胞后ROS 的表達升高，而特丁基對苯二酚預(yù)處理過的腸成纖維細胞的ROS、TGF-β1水平明顯降低。在小鼠慢性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化模型中，實驗組的Nrf2 及其下游抗氧化酶HO-1 表達較對照組下降，蛆蟲提取物通過上調(diào)Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1 mRNA和蛋白表達來抑制TGF-β1/Smads 信號通路，從而抑制腸纖維化，而在Nrf2抑制劑（ML385）預(yù)處理后蛆蟲提取物對腸纖維化的保護作用被消除[29]。Nrf2還可以在其他器官纖維化中起到保護作用，有研究[30]表明Nrf2 通過清除ROS 和抑制TGF-β1/Smads 信號通路逆轉(zhuǎn)腎纖維化。Nrf2 還可通過抑制TGF-β1/Smads信號通路，減弱肝星狀細胞的激活繼而抑制肝纖維化，達到肝纖維化的治療目標[31]。在系統(tǒng)性硬化病中，抗氧化劑肉桂醛激活Nrf2途徑，緩解了TGF-β1和IL-13介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，以及隨后的成纖維細胞中ECM 的上調(diào)，繼而延緩全身多器官纖維化的進展[32]。TGF-β1/Smads 信號通路不僅通過產(chǎn)生ROS 促進腸纖維化，還可以通過經(jīng)典途徑促進Snai1 等促纖維化基因的表達，Nrf2能否完全阻斷TGF-β1/Smads信號通路的促纖維化途徑還不得而知，但一系列研究表明Nrf2至少可以在一定程度上延緩腸纖維化進展。

4.Nrf2 在IBD 腸道炎癥反應(yīng)和相關(guān)腸纖維化中異常表達：有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在IBD患者炎癥節(jié)段腸黏膜的表達水平明顯低于非炎癥節(jié)段[33]。而在小鼠實驗性結(jié)腸炎模型中，實驗組結(jié)腸組織中Nrf2及其調(diào)節(jié)的下游SOD、還原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）、過氧化氫酶等抗氧化酶表達水平較對照組下降[34]。SOD 在IBD 患者腸黏膜組織中的活性較健康人明顯降低，且降低程度與IBD 的嚴重程度呈正比[35]。GSH 是Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化多肽，在ROS的刺激下會失去抗氧化能力并轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized,GSSG），GSH/GSSG比值可作為機體抗氧化能力指標之一。研究發(fā)現(xiàn)在克羅恩病患者的正常和炎癥腸段中的GSH 水平和GSH/GSSG比值均降低，GSH 在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者結(jié)腸組織中的表達低于健康人腸組織[36]。ROS 在小鼠實驗性結(jié)腸炎模型和IBD 患者結(jié)腸黏膜組織中水平均升高[37]。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎相關(guān)腸纖維化模型中，實驗組結(jié)腸組織的Nrf2表達較健康對照小鼠顯著降低[29]。

在正常情況下，腸黏膜屏障受到外界病原體或細菌入侵時，固有層內(nèi)巨噬細胞的Nrf2 代償性升高，通過清除過多的ROS和炎癥因子避免腸道炎癥的持續(xù)放大，被激活的腸肌成纖維細胞數(shù)量下降，分泌適宜水平ECM 蛋白進行組織損傷修復(fù)。在IBD腸道炎癥和相關(guān)腸纖維化中，結(jié)腸組織Nrf2表達水平降低，導(dǎo)致其對NF-κB 信號通路、TGF-β1/Smads 信號通路抑制性下降，Th17/Treg 細胞比例失衡，繼而產(chǎn)生過量的ROS、TNF-α、IL-17 和TGF-β 等致纖維化因子[1]，過度激活腸肌成纖維細胞并大量分泌ECM 蛋白，促進了腸纖維化進展（圖1）?？梢娂せ頝rf2靶點可為未來治療IBD并發(fā)腸纖維化提供新的思路。

四、Nrf2在IBD中的治療應(yīng)用和進展

Nrf2 為IBD 治療藥物提供了新的視角，目前在維持IBD緩解方面常用的藥物是5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic acid,5-ASA）。研究表明，5-ASA 的作用機制與Nrf2 活性部分相關(guān)，5-ASA 被腸道中性粒細胞產(chǎn)生的次氯酸氧化后獲得親電性醌成為氧化型5-ASA，并與Keap1 共價結(jié)合，導(dǎo)致Nrf2 從Nrf2/Keap1 復(fù)合物中釋放。由于氧化應(yīng)激和次氯酸的產(chǎn)生與炎癥反應(yīng)和中性粒細胞浸潤結(jié)腸黏膜有關(guān)，因此僅在炎癥黏膜中觀察到5-ASA 活化作用，而在健康腸黏膜中未觀察到。與此概念平行，5-ASA 直腸給藥可誘導(dǎo)炎癥結(jié)腸組織中的Nrf2 的核積累和HO-1 蛋白表達增多，但在正常結(jié)腸組織中未見，進一步支持了5-ASA作用是炎癥依賴性的觀點[38]。

Keap1 是Nrf2 的負調(diào)節(jié)因子，現(xiàn)有的新療法通過靶向Keap1 分子治療UC。Lu 等[39]進行的兩階段研究評估Keap1抑制劑CPUY192018 對UC 小鼠模型中Nrf2 下游分子影響，發(fā)現(xiàn)隨著CPUY192018 在細胞核內(nèi)的累積增多，NCM460 結(jié)腸細胞內(nèi)Nrf2 表達水平增加，并發(fā)揮典型的Nrf2 相關(guān)分子效應(yīng)，增加抗氧化酶的表達，并通過清除ROS 減輕UC 腸黏膜炎癥反應(yīng)。

吳茱萸次堿、高良姜黃素等可通過上調(diào)Nrf2表達水平降低小鼠實驗性結(jié)腸炎中炎性標志物水平[40-41]。在動物實驗性結(jié)腸炎并發(fā)腸纖維化模型中，寡聚糖、蛆蟲、特丁基對苯二酚等通過激活Nrf2降低腸纖維化指標，發(fā)揮緩解腸纖維化進展的作用[14，28-29]。但在人腸纖維疾病中，尚鮮見以Nrf2 為靶點的相關(guān)藥物治療，其具有較大的研究潛力。

五、結(jié)語

綜上所述，Nrf2 是一種抗氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，促進了下游抗氧化酶的表達。Nrf2 可通過抑制NF-κB 激活、調(diào)節(jié)Th17/Treg 細胞平衡抑制腸纖維化，又能通過清除ROS 來抑制TGF-β1/Smads 信號通路，繼而抑制腸纖維化。但其并不阻斷TGF-β1/Smads 信號通路經(jīng)典途徑的Snai1 等促纖維化基因的表達，因此Nrf2對腸纖維化的抑制程度還有待于進一步研究。在IBD 中，Nrf2 及其調(diào)節(jié)的抗氧化酶水平降低，對上述通路的調(diào)節(jié)性下降，不足以清除具有致纖維化作用的ROS和炎癥因子，對腸道炎癥反應(yīng)和相關(guān)腸纖維化保護作用均下降。Nrf2在IBD 中抗纖維化的作用機制尚未明確，具有較大的研究潛力，研發(fā)以Nrf2為靶點的藥物可為IBD的治療開辟一條新途徑。