一種三回路式淡水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用

潘國(guó)英，文 暢，黃薇薇，姚雪梅，董麗麗，周梅陽(yáng)，楊 飛

（1. 海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海口 570228; 2. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院，?？?570228）

水產(chǎn)品是糧食供應(yīng)的重要組成部分，也是人類獲取蛋白質(zhì)和微量元素的重要來(lái)源[1]。中國(guó)是世界上最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品出口國(guó)，約占據(jù)全球市場(chǎng)份額的60%[2]。目前，中國(guó)淡水養(yǎng)殖以室外池塘養(yǎng)殖和工廠化流水養(yǎng)殖為主[3]，養(yǎng)殖密度低，用水量高，占地面積大[4]，且含有魚類排泄物、殘留餌料及藥物的養(yǎng)殖尾水直接排放會(huì)造成嚴(yán)重的水環(huán)境污染[5]。由于自然選址的限制和節(jié)能減排等壓力，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展已經(jīng)面臨新的瓶頸。養(yǎng)殖規(guī)模不可能無(wú)序擴(kuò)張，建立生態(tài)環(huán)境可持續(xù)的高密度循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖模式就是一種可行的解決方案[6]。

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（Recirculating Aquaculture Systems，RAS）通過(guò)一系列的物理、生物處理單元將養(yǎng)殖水處理后進(jìn)行循環(huán)利用[7]，具有水資源利用率高、養(yǎng)殖密度大、占地小、養(yǎng)殖過(guò)程可控和生物安全等優(yōu)勢(shì)[8-9]。在RAS 中，實(shí)現(xiàn)高效的固體和含氮污染物去除是降低系統(tǒng)對(duì)水、化學(xué)物質(zhì)以及能源需求的關(guān)鍵[10]。精心設(shè)計(jì)的RAS 可以實(shí)現(xiàn)每日90%～98%的水循環(huán)利用率[4]，但傳統(tǒng)的RAS一般為單回路循環(huán)，即通過(guò)物理沉淀或機(jī)械過(guò)濾去除飼料殘留和魚糞等固體物，再經(jīng)過(guò)硝化作用去除對(duì)魚有毒害作用的氨和亞硝酸鹽[11]，以保證魚類正常生長(zhǎng)。這種單回路RAS 僅針對(duì)水進(jìn)行處理，對(duì)系統(tǒng)中產(chǎn)生的魚糞等固體物并未給予重視[5]。另一方面，硝化作用產(chǎn)生的硝酸鹽積累到一定水平也會(huì)影響魚類生長(zhǎng)[12]，因而需要通過(guò)20%～40%的換水率來(lái)維持安全的硝酸鹽濃度水平（一般不超過(guò)500 mg NO3--N）[4,11,13]。升級(jí)版的二回路式RAS 增加了微生物反硝化單元，可將硝酸鹽還原為氮?dú)馀懦龆刂葡跛猁}的上升。但反硝化過(guò)程需要外加碳源，使運(yùn)行過(guò)程變得復(fù)雜，且對(duì)魚糞仍未進(jìn)行處理[6,10,14]。有些研究收集RAS 本身產(chǎn)生的有機(jī)廢物進(jìn)行水解發(fā)酵，產(chǎn)生容易被細(xì)菌利用的揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）作為碳源使用，從而節(jié)省外加碳源的成本[14]。但是水解后的上清液中含有高濃度的氨氮（TAN，銨+氨），會(huì)增加硝化單元的負(fù)荷。在實(shí)際養(yǎng)殖羅非魚（Oreochromis mossambicus）過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其魚糞呈細(xì)長(zhǎng)條且覆有包膜不易散開，因而容易沉積在微濾機(jī)的進(jìn)水區(qū)底部，而微濾機(jī)反沖洗出來(lái)的水則含有大量細(xì)小的有機(jī)污泥，可以考慮作為碳源使用。為實(shí)現(xiàn)更高效的水循環(huán)和固體管理、提高RAS 的可持續(xù)性，本研究擬在傳統(tǒng)的單回路RAS 基礎(chǔ)上增加了反硝化和厭氧消化單元，構(gòu)建一套由魚缸、微濾機(jī)、好氧硝化、缺氧反硝化和厭氧消化組成的三回路式RAS，并探究以微濾機(jī)單元反沖洗的細(xì)小有機(jī)污泥作為反硝化碳源的可行性及NO3--N 的去除效果和探明系統(tǒng)各處理單元的性能表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 系統(tǒng)組成該RAS 系統(tǒng)安裝在海南省文昌春來(lái)水產(chǎn)有限公司瓊海種苗基地。由1 個(gè)1m3的魚缸和3 個(gè)處理回路構(gòu)成（圖1）。第一回路包括魚缸（養(yǎng)殖體積0.9 m3）、74 μm 轉(zhuǎn)鼓微濾機(jī)、2 個(gè)流化床生物反應(yīng)器，通過(guò)1 個(gè)平均流量為2.3 m3·h-1的水泵（酷魚，佛山）實(shí)現(xiàn)水的循環(huán)（表1）。魚缸底部略呈漏斗狀；底部設(shè)有微孔曝氣管提供不間斷曝氣；水面設(shè)有類似馬桶的自動(dòng)補(bǔ)水裝置。微濾機(jī)通過(guò)定時(shí)控制運(yùn)轉(zhuǎn)，方便調(diào)節(jié)其他2 個(gè)回路的水力停留時(shí)間（HRT）。2 個(gè)流化床反應(yīng)器組成一級(jí)（145 L）和二級(jí)（220 L）硝化過(guò)程，均填充有60%的K3 聚乙烯填料供生物膜附著生長(zhǎng)，填料尺寸Φ25 mm×9 mm，呈蜂窩狀（圖1），密度約0.96 g·cm-3，比表面積約500 m2·m-3，空隙率約88.6%；底部安裝曝氣管，驅(qū)動(dòng)填料循環(huán)流動(dòng)并為微生物生長(zhǎng)提供氧氣，同時(shí)可吹脫水中部分CO2。此外，硝化反應(yīng)器底部放置有石灰石顆粒，可緩慢溶解補(bǔ)充部分堿度。在運(yùn)行過(guò)程中根據(jù)pH 下降情況外加石灰水補(bǔ)充堿度，以維持pH 的穩(wěn)定。

表1 系統(tǒng)各單元工作參數(shù)

圖1 三回路式循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)（RAS）示意圖

第二回路主要由1 個(gè)工作體積為153 L 的反硝化單元組成，主要作用是利用微濾機(jī)反沖洗水含有的細(xì)小有機(jī)污泥作為反硝化碳源，去除系統(tǒng)中的硝酸鹽。反硝化器上部放置約40 cm 厚的懸浮填料，起到截留固體浮渣的作用并可作為微生物載體；填料下部空間配備水泵循環(huán)回路，以促進(jìn)泥水混合。吸附在微濾機(jī)濾網(wǎng)上的顆粒通過(guò)定時(shí)反沖洗排入20 L 的暫存池中，由浮球液位開關(guān)控制間歇泵入反硝化單元，平均流量約為0.03 m3·h-1（表1）；上清液從填料表層溢流重新進(jìn)入微濾機(jī)。底部的剩余污泥則定期泵入第三回路的厭氧消化單元作進(jìn)一步處理。

第三回路主要由1 個(gè)工作體積為726 L 的厭氧消化單元組成，用于魚糞污泥等顆粒物的厭氧消化，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化和減量化，并可回收沼氣（本研究未進(jìn)行監(jiān)測(cè)）。單元上部有一個(gè)簡(jiǎn)易的錐形三相分離器，其下有約30 cm 厚的懸浮填料層，起到截留固體浮渣作用；填料下部空間也配備水泵循環(huán)回路，以促進(jìn)泥水混合。沉積在微濾機(jī)進(jìn)水區(qū)底部的顆粒物通過(guò)管道排入20 L 的密閉暫存池，然后定時(shí)泵送進(jìn)入?yún)捬跸瘑卧?，平均流量約0.0025 m3·h-1（表1）；上清液則溢流排出系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)中平均每天尾水排放量約60 L，占系統(tǒng)總水量的2.60%，養(yǎng)殖水體的6.67%。

1.2 魚類放養(yǎng)與生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)用水為當(dāng)?shù)氐牡叵滤?。系統(tǒng)通過(guò)不斷調(diào)試和改進(jìn)，使各處理單元進(jìn)入穩(wěn)定工作狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，放養(yǎng)100 條平均體質(zhì)量為522 g 的吉富羅非魚（O.mossambicus），以便處理系統(tǒng)快速進(jìn)入穩(wěn)定負(fù)荷運(yùn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中（2021-07-26—2021-11-23），每2 周隨機(jī)從魚缸中撈取10 條魚稱重，檢查其生長(zhǎng)情況。羅非魚飼料購(gòu)自海南省某公司，其蛋白質(zhì)、脂肪和P 的含量分別為29%、6%和0.8%。每日喂食量為魚總生物量的1%～2%，分2 次（8:30 am，17:30 pm）進(jìn)行人工喂食，記錄喂食量。實(shí)驗(yàn)持續(xù)121 d。

1.3 數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)與分析方法系統(tǒng)通過(guò)南京某智能水產(chǎn)養(yǎng)殖監(jiān)測(cè)裝置對(duì)魚缸中溶解氧（DO）、溫度（T）、pH 以及反硝化單元中的氧化還原電位（ORP）進(jìn)行實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。每日對(duì)魚缸中的TAN 和NO2--N 進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速估測(cè)（數(shù)據(jù)未展示）。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置7 個(gè)取樣點(diǎn)，包括魚缸、微濾機(jī)進(jìn)水口、硝化單元進(jìn)水口和出水口、反硝化單元進(jìn)水口和出水口、厭氧消化單元出水口（圖1）。每周對(duì)各取樣點(diǎn)取樣分析，測(cè)定TAN、NO2--N、NO3--N、PO43--P、TN、TP、化學(xué)需氧量（COD）、電導(dǎo)率（EC）、堿度（ALK）和濁度（Turbidity）。

EC 通過(guò)梅特勒-托利多某電導(dǎo)率儀測(cè)定，TP 和PO43--P 采用釩鉬酸鹽法測(cè)定，ALK 采用鹽酸滴定法測(cè)定，TN 和NO3--N 采用二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜法測(cè)定，TAN 采用納氏試劑光度法測(cè)定，NO2--N 采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定，COD 采用重鉻酸鉀法測(cè)定[15]。

1.4 微生物群落分析在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別采集硝化單元、反硝化單元和厭氧消化單元的微生物樣品，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行微生物高通量測(cè)序。采用E.Z.N.A.?土壤DNA 試劑盒（Omega Bio-tek, US）提取微生物樣品的總DNA，利用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）對(duì)提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和純化，然后在Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)運(yùn)行與水質(zhì)保障實(shí)驗(yàn)前期（第1～20 天，2021-07-26—2021-08-14），該RAS 中不存在硝酸鹽積累現(xiàn)象，因此未對(duì)反硝化單元中的水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，僅檢測(cè)了反硝化單元內(nèi)氧化還原電位（ORP）和DO 的變化情況；從第21 天開始對(duì)反硝化單元的出水指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。為期121 d的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，系統(tǒng)發(fā)生了2 次意外事件：第74 天時(shí)，由于厭氧消化單元進(jìn)水的單向閥損壞，導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)富含TAN 的水大量倒灌進(jìn)入微濾機(jī)，造成微濾機(jī)進(jìn)水中的TAN 和NO2--N 急劇上升，但修復(fù)后在24 h 內(nèi)系統(tǒng)各水質(zhì)指標(biāo)又恢復(fù)至正常水平。第86 天時(shí)，反硝化單元內(nèi)產(chǎn)生大量浮泥，導(dǎo)致出水水質(zhì)渾濁和微濾機(jī)頻繁堵塞。為解決此問(wèn)題，通過(guò)對(duì)反硝化單元的進(jìn)水速率、水力停留時(shí)間和底部污泥停留時(shí)間進(jìn)行了為期16 d 的調(diào)試，使浮泥問(wèn)題得到解決。

2.1.1 第一回路-固體顆粒分離和硝化作用微濾機(jī)和硝化單元構(gòu)成了系統(tǒng)的第一處理回路，魚糞等顆粒物通過(guò)微濾機(jī)74 μm 濾網(wǎng)過(guò)濾分離，魚缸中水體濁度維持在2.30 NTU 以下，平均1.45 NTU；COD 在88.7 mg·L-1以下，平均37.10 mg·L-1（圖2-a）。

圖2 三回路式RAS 中濁度與COD（a）、TAN（b）、NO2--N（c）、NO3--N（d）、ALK 與pH（e）和TN（f）的濃度變化

微濾機(jī)出水泵入硝化單元，TAN 在此轉(zhuǎn)化為NO2--N 進(jìn)而轉(zhuǎn)化為NO3--N。N 以飼料投加的方式進(jìn)入系統(tǒng)，隨魚類生長(zhǎng)逐漸增加，平均每天有29.92 g N 進(jìn)入系統(tǒng)，后期達(dá)到53.59 g·d-1。如圖2-b～d 所示，二級(jí)硝化單元出水和魚缸中的TAN 和NO2--N 濃度并沒(méi)有隨著魚缸的N 負(fù)荷增加而顯著升高，始終維持在較低的水平，其中TAN 在0.22～1.38 mg·L-1范圍內(nèi)波動(dòng)，平均0.78 mg·L-1和1.02 mg·L-1（圖2-b）；NO2--N 濃度在0.04～0.21 mg·L-1范圍內(nèi)波動(dòng)，平均0.10 mg·L-1和0.16 mg·L-1（圖2-c）。各單元中NO3--N 濃度變化比較一致，前18 d 從6.84 mg·L-1持續(xù)上升到69.77 mg·L-1；隨后由于反硝化過(guò)程的介入，在30～90 mg·L-1間變化（圖2-d），平均50.80 mg·L-1。此外，2 個(gè)硝化單元的pH 維持在6.96～7.52，ALK 在40.47～97.25 g ·L-1（圖2-e），保證了良好的硝化效率。2 個(gè)硝化單元的TAN 平均去除速率為20.05 g ·d-1，最高達(dá)83.55 g ·d-1。即使在第74 d發(fā)生厭氧消化單元的進(jìn)水單向閥損壞，微濾機(jī)進(jìn)水TAN 和NO2--N 急劇上升至1.80 mg·L-1和1.37 mg·L-1（圖2-b～c），硝化單元出水和魚缸水質(zhì)仍然維持穩(wěn)定，且運(yùn)行很快恢復(fù)正常，表明本循環(huán)回路具有較好的抗沖擊負(fù)荷能力。

2.1.2 第二回路-反硝化作用反硝化單元是第二處理回路的核心單元，以微濾機(jī)反沖洗產(chǎn)生的細(xì)小污泥作為碳源在缺氧條件下把NO3--N 轉(zhuǎn)化為N2O 和N2而除去。實(shí)驗(yàn)前期（第1～20 天）系統(tǒng)中硝酸鹽水平低，反硝化過(guò)程未介入。第21～85 天，反硝化單元的DO 維持在0.27 mg·L-1以下，COD 與NO3--N 的比值平均為7.9，NO2--N 在0.04～1.76 mg·L-1波動(dòng)，無(wú)明顯的亞硝酸鹽積累（圖3-a～b）。反硝化單元進(jìn)、出水的平均ALK分別為66.84 和173.7 mg·L-1（圖3-c）。計(jì)算得反硝化過(guò)程每天可為RAS 補(bǔ)充49.61 mg·L-1的堿度。隨著魚長(zhǎng)大和喂食量增加，進(jìn)水中NO3--N 負(fù)荷由21.02 g·d-1逐漸增加到59.13 g·d-1，平均負(fù)荷30.76 g·d-1，平均濃度42.72 mg·L-1；而出水的NO3--N 仍維持在50 mg·L-1以下，平均濃度17.13 mg·L-1（圖3-a）。因此，NO3--N 的平均去除率為59.9%，平均N 去除速率為88.68 g ·（m3·d）-1，最高去除速率176.38 g ·（m3·d）-1。從86 d 開始，由于系統(tǒng)調(diào)試，進(jìn)水COD 值顯著降低，NO2--N 濃度則從0.13 mg·L-1上升到4.14 mg·L-1，且此后一直維持在1.26～4.45 mg·L-1的高水平，表明亞硝酸鹽還原效率降低，反硝化不完全。第86 天，反硝化單元內(nèi)產(chǎn)生大量浮泥，導(dǎo)致出水渾濁和微濾機(jī)堵塞。浮泥的產(chǎn)生可能是由于混合不夠均勻，水力停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，底部污泥堆積導(dǎo)致反硝化單元內(nèi)N2帶動(dòng)污泥上浮。為此，做了以下調(diào)整：（1）將底部部分污泥排入?yún)捬跸瘑卧?；?）將進(jìn)水流量由0.27 m3·h-1降低至0.03 m3·h-1，延長(zhǎng)進(jìn)水時(shí)間，防止進(jìn)水水流帶動(dòng)污泥上?。唬?）在滿足缺氧條件下，增大微濾機(jī)的反沖洗頻率、提高進(jìn)水量，使反硝化單元的水力停留時(shí)間由8.76 h 降低至4.93 h。經(jīng)過(guò)為期16 d 的運(yùn)行調(diào)整，浮泥問(wèn)題顯著改善。然而，由于微濾機(jī)反沖洗頻率增加，導(dǎo)致反沖洗水的污泥濃度降低，COD 與NO3--N 比值低于3～6，不利于NO3--N 完全轉(zhuǎn)化為N2[16]。

圖3 反硝化單元中NO3--N 與COD（a）、NO2--N（b）、ALK 與pH（c）、ORP（d）的濃度變化

ORP 是指示反硝化單元運(yùn)行情況的重要參數(shù)之一，它反映了單元內(nèi)的氧化物水平（如O2和NO3-），可用于判定反硝化進(jìn)行的程度。當(dāng)ORP在0～-200 mV 內(nèi)，表示發(fā)生一步反硝化，即NO3--N→NO2--N；當(dāng)ORP＜-200 mV 時(shí)，發(fā)生完全反硝化，即NO2--N→N2；當(dāng)ORP＜-400 mV 時(shí)，則容易產(chǎn)生有毒的H2S[11]。第21～85 天，ORP 主要在-200～-450 mV 波動(dòng)（圖3-d），表明反硝化單元內(nèi)發(fā)生完全反硝化，脫氮效果穩(wěn)定。第86～121 天，ORP 在-50～-200 mV 波動(dòng)（圖3-d），表示反硝化單元為一步反硝化，出現(xiàn)亞硝酸鹽積累現(xiàn)象，這與碳源供應(yīng)不足有關(guān)。

2.1.3 第三回路-厭氧消化作用第三回路通過(guò)厭氧消化過(guò)程實(shí)現(xiàn)顆粒物的穩(wěn)定化和減量化，系統(tǒng)運(yùn)行期間顆粒物全部進(jìn)入消化單元，無(wú)污泥外排。消化單元每天約60 L 上清液溢出（占系統(tǒng)總水量的2.66%），此為系統(tǒng)除蒸發(fā)和漏損之外的日水量損失。該上清液中TAN 的平均濃度為7.84 mg·L-1，最高21.62 mg·L-1，TN 為20.99 mg·L-1，TP 為16.34 mg·L-1，COD 為60.02 mg·L-1（表2）。試驗(yàn)結(jié)束后消化單元內(nèi)僅有少量污泥殘留，穩(wěn)定化和減量化效果較好。

表2 厭氧消化單元上清液的每月平均水質(zhì)參數(shù) mg·L-1

2.2 系統(tǒng)表現(xiàn)

2.2.1 魚類生長(zhǎng)本三回路式RAS 主要評(píng)估系統(tǒng)的水質(zhì)保障能力，故選擇成年羅非魚進(jìn)行試驗(yàn)，養(yǎng)殖參數(shù)見(jiàn)表3。所放養(yǎng)的100 尾羅非魚初始平均質(zhì)量522 g，每日飼料投喂量由實(shí)驗(yàn)初期魚體質(zhì)量的0.5%逐漸增加至魚體質(zhì)量的1%～2%。經(jīng)過(guò)121 d 的飼養(yǎng)后，羅非魚平均體質(zhì)量為970 g，養(yǎng)殖密度達(dá)到107.7 kg·m-3，存活率為100%，月平均飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）在1.2～1.99 之間，平均值1.74（表3）。

表3 本三回路式RAS 羅非魚121 d 的養(yǎng)殖參數(shù)

2.2.2 養(yǎng)殖耗水量本三回路式RAS 的總水量為2.255 m3，其中魚缸的養(yǎng)殖水量為0.9 m3。厭氧消化單元每日溢流水量約60 L·d-1，占系統(tǒng)總水量的2.66%，養(yǎng)殖水量的6.67%，加上蒸發(fā)、滲漏和魚類捕撈等造成的水量損失，每日換水率約為系統(tǒng)總水量的3%。該系統(tǒng)的養(yǎng)殖耗水量（以生產(chǎn)1 kg 魚所需的耗水量計(jì)算）為162.1 L·kg-1（表3），水體交換速率（以投加1 kg 飼料所需的耗水量計(jì)算）為92.9 L·kg-1（表3）。

2.2.3 魚缸水質(zhì)實(shí)驗(yàn)期間，魚缸的水溫在21.5～31.7 ℃之間波動(dòng)，pH 維持在6.92～7.39，DO 在4.00 mg·L-1以上；TAN 和NO2--N 的平均濃度分別為1.05 mg·L-1和0.16 mg·L-1，最高濃度分別為1.60 mg·L-1和0.30 mg·L-1（表4），滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)要求[17]。NO3--N 濃度在前20 d 內(nèi)呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)，之后穩(wěn)定在55 mg·L-1左右（圖2-d），其濃度遠(yuǎn)低于淡水魚類的耐受閾值（96 hLC50s＞1 000 mg·L-1）和養(yǎng)殖水質(zhì)控制要求的500 mg·L-1[4,18]。磷酸鹽濃度呈緩慢增加趨勢(shì)，由1.21 mg·L-1到17.12 mg·L-1（表4）。

表4 魚缸的水質(zhì)參數(shù)

2.3 N、P 平衡N、P 質(zhì)量平衡計(jì)算和分析結(jié)果如圖4 所示。飼料是RAS 中N 和P 的唯一來(lái)源。試驗(yàn)過(guò)程共投入77.91 kg 飼料，其中，含有3.62 kg N 和 1.40 kg P。

圖4 本三回路式RAS 中的N（a）、P（b）平衡分析

根據(jù)文獻(xiàn)資料計(jì)算得到，通過(guò)飼料進(jìn)入系統(tǒng)的3.62 kg N 中，約22%（0.80 kg）被魚同化[19]，4.4%（0.16 kg）以無(wú)機(jī)氮的形式（如NO3--N、TAN）殘留在水體中，4.2%（0.15 kg）主要以TAN 的形式從厭氧消化單元排出，17.3%（0.63 kg）保留在污泥中，剩余52.1%（1.89 kg）的N 則通過(guò)反硝化以N2形式排出系統(tǒng)外（圖4-a）。進(jìn)入系統(tǒng)的P 為1.40 kg，約18.8%（0.26 kg）被魚轉(zhuǎn)化利用[19]，3.9%（0.05 kg）以磷酸鹽的形式殘留在水體中，68.8%（0.96 kg）的P 以污泥的形式存在于消化單元中，剩余8.5%（0.12 kg）的P 通過(guò)溢流從消化單元排出系統(tǒng)（圖4-b）。

2.4 微生物群落組成及功能細(xì)菌分布通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行微生物群落分析，在門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布如圖5-a，其中相對(duì)豐度小于0.5%的菌群被歸為“其他”。變形菌門和擬桿菌門是反硝化的主要門，包含許多與反硝化過(guò)程相關(guān)的細(xì)菌[20]，其他門包括綠彎菌門（Chloroflex）、梭桿菌門（Fusobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）等參與了硝化、反硝化和厭氧消化過(guò)程。結(jié)果表明，綠彎菌門（Chloroflex）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidota）為硝化單元、反硝化單元和厭氧消化單元中的優(yōu)勢(shì)門，相對(duì)豐度分別為5.81%～53.24%、11.72%～37.45%和14.10%～30.32%。而硝化螺旋菌門（Nitrospirota）僅在硝化單元出現(xiàn)，相對(duì)豐度為2.07%。

圖5 本三回路式RAS 中細(xì)菌在門水平（a）和屬水平（b）的群落組成分析

各處理單元中，與氮代謝相關(guān)的功能菌屬的結(jié)構(gòu)分布如圖5-b 所示，其中硝化螺旋菌參與硝化作用；紅細(xì)菌屬為異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌（HNADB），可參與異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用[21]；黃桿菌屬和固氮菌屬是經(jīng)典的反硝化細(xì)菌，可促進(jìn)高效反硝化體系的形成[22]。在硝化單元、反硝化單元和厭氧消化單元中，分別有8.29%、12.02%和14.62%的菌屬與氮代謝相關(guān)。在硝化單元中，與氮代謝相關(guān)的菌屬有硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonadaceae）、紅細(xì)菌屬（Rhodobacte）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）等，其中硝化螺旋菌屬、紅細(xì)菌屬和生絲微菌屬（Hyphomicrobium）為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為2.07%、3.04%和1.30%。反硝化單元中與氮代謝相關(guān)的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為黃桿菌屬、紅細(xì)菌屬和固氮螺菌屬（Azospira），相對(duì)豐度分別為3.60%、2.01%和1.80%。厭氧消化單元中與氮代謝相關(guān)的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為固氮螺菌屬、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）和土生單胞菌屬（Terrimonas），相對(duì)豐度分別為4.52%、3.54%和2.56%。羅姆布茨菌屬和土生單胞菌屬同樣參與了反硝化過(guò)程。此外，羅姆布茨菌屬和土生單胞菌屬可分別將單糖和淀粉進(jìn)一步水解為VFAs，為反硝化微生物提供容易利用的碳源[22]。

3 討 論

3.1 羅非魚生長(zhǎng)情況羅非魚是海南最主要的淡水養(yǎng)殖魚類（約占90%），在傳統(tǒng)大塘養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖密度僅約4.5 kg·m-3，占地面積大，生長(zhǎng)過(guò)程不可控，尾水排放對(duì)周邊水環(huán)境影響嚴(yán)重，產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到制約。與Shnel 等[23]提出的最大養(yǎng)殖密度為61.8 kg·m-3的新型RAS 相比，本三回路式RAS 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了107.7 kg·m-3的養(yǎng)殖密度，魚的存活率為100%，F(xiàn)CR 為1.74。試驗(yàn)后期較高的FCR（1.99）

可能與羅非魚在此體質(zhì)量時(shí)的生長(zhǎng)特性有關(guān)[24-25]。Oliveira 等[25]繪制的羅非魚生長(zhǎng)曲線表明，羅非魚體質(zhì)量超過(guò)200～300 g后，生長(zhǎng)呈穩(wěn)定狀態(tài)，并不隨喂食量的增加而明顯增加。同時(shí)，Martins等[24 - 25]的研究表明，在低換水速率的RAS 中，個(gè)體較大的羅非魚（體質(zhì)量200～300 g）會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩的趨勢(shì)，表現(xiàn)出低生長(zhǎng)速率和高飼料轉(zhuǎn)化率（FCR 高達(dá)2.12），而個(gè)體較小的羅非魚［（81.4±21.0）g］生長(zhǎng)得更好[25]。本研究中的羅非魚個(gè)體更大，但FCR 值反而低于其他研究結(jié)果，說(shuō)明系統(tǒng)具有較高的養(yǎng)殖效率。

3.2 系統(tǒng)性能分析該三回路式RAS 在傳統(tǒng)的單回路RAS 基礎(chǔ)上增加了反硝化和厭氧消化單元，從而實(shí)現(xiàn)高效水循環(huán)和魚糞污泥處理。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚糞和懸浮固體（SS）的高效分離是RAS 中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可大大減輕魚缸和硝化單元中的碳（C）、N 負(fù)荷，降低系統(tǒng)的需氧量，還可為養(yǎng)殖生物提供優(yōu)越的水體環(huán)境。根據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，養(yǎng)殖系統(tǒng)中TAN 和NO2--N 的濃度宜控制在5.0（pH＜8.0 時(shí)）和0.3 mg·L-1以下[18,26]。傳統(tǒng)RAS 中的硝化單元一般采用一級(jí)流化床反應(yīng)器，填料填充率小于36%[17]，單位體積TAN 去除率為70～270 g·（m3·d）-1[17]。在本RAS 中，硝化單元中填料的單位體積TAN 去除率達(dá)381 g·（m3·d）-1，其良好的硝化效率可歸因于硝化單元中流化床反應(yīng)器的二級(jí)設(shè)計(jì)、較高的填料填充率（60%）、充足的曝氣（DO＞5 mg·L-1）、合適的pH 和ALK 控制。試驗(yàn)過(guò)程中，硝化單元進(jìn)水的TN 和NO3--N 總是略高于硝化單元出水，可能是由于硝化單元內(nèi)發(fā)生了脫氮作用，而硝化單元中含有好氧反硝化細(xì)菌的微生物群落分析結(jié)果證實(shí)了這一猜測(cè)。

第二處理回路的反硝化過(guò)程可減少為維持NO3--N 水平而需要的水體交換量，產(chǎn)生的OH-還可為系統(tǒng)補(bǔ)充堿度[16,27]。但反硝化過(guò)程需要外加碳源如甲醇、醋酸鈉或糖蜜等，導(dǎo)致運(yùn)行成本增加[28]。本研究以微濾機(jī)反沖洗產(chǎn)生的細(xì)小污泥作為碳源取得了成效，通過(guò)資源化利用降低系統(tǒng)的C 排放并節(jié)約運(yùn)行成本[29-30]。在相似的COD 與NO3--N 比值條件下，Suhr 等[31]利用淡水虹鱒魚商業(yè)RAS 水解污泥的上清液作為反硝化碳源，其脫氮速率為124.8 g ·（m3·d）-1。本研究中污泥未經(jīng)過(guò)水解過(guò)程直接使用，而硝酸鹽的去除速率與之相當(dāng)。因此，合理調(diào)控污泥進(jìn)入反硝化單元和排入?yún)捬跸瘑卧谋壤S持合適的COD 與NO3--N 的比值是系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定反硝化脫氮的關(guān)鍵。反硝化過(guò)程產(chǎn)生的ALK 與石灰石一起有效彌補(bǔ)了硝化作用和魚呼吸作用所造成的ALK 損失和pH 下降，減少了外加堿性化學(xué)品的用量和成本，為RAS 的穩(wěn)定運(yùn)行提供了有力保障。

第三處理回路的厭氧消化過(guò)程可實(shí)現(xiàn)魚糞污泥的穩(wěn)定化和減量化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后消化單元?dú)埩舻纳倭课勰嗑哂休^高N、P 含量，且常含磷灰石和鳥糞石等礦物質(zhì)，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)有望作為緩釋肥被回收利用[32]。該RAS 每天僅有約7%的尾水從厭氧消化單元溢出，大大減輕了尾水處理的壓力和對(duì)周邊水環(huán)境的影響。而溢出的尾水含有植物生長(zhǎng)所需的N、P 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和多種微量元素，可作為水培蔬菜的營(yíng)養(yǎng)液被進(jìn)一步利用。

3.3 N、P 平衡分析本三回路式RAS 具有更低的N 殘留，且以水體交換形式產(chǎn)生的N 排放量（1.94 g·kg-1飼料）比傳統(tǒng)的RAS 低21 倍[13,26]。反硝化去除52.1%的N 則略低于文獻(xiàn)[10 - 11]的報(bào)道（60%～70%）。上述結(jié)果與反硝化單元可處理的水量有關(guān)，而試驗(yàn)后期（86～102 d）反硝化單元發(fā)生污泥上浮現(xiàn)象對(duì)此有較大影響。如正常運(yùn)行，則可實(shí)現(xiàn)59.7%的N 去除。

據(jù)報(bào)道，飼料中只有15%～40%的P 被魚類同化[19]，剩下的則被排到水體中。雖然較高濃度的磷酸鹽并不對(duì)魚類造成傷害，但排放到環(huán)境中會(huì)造成水體富營(yíng)養(yǎng)化等問(wèn)題。本研究中，經(jīng)厭氧消化處理后，約8.5%的P 通過(guò)溢流排出系統(tǒng)，低于文獻(xiàn)報(bào)道的22.9%[23]；剩余68.8%的P 以污泥的形式存在于消化單元中。此外，該三回路式RAS 的水體交換速率為92.9 L·kg-1，遠(yuǎn)小于流水式養(yǎng)殖、半封閉養(yǎng)殖的水體交換速率(v)（流水式養(yǎng)殖v＞50 m3·kg-1，半封閉養(yǎng)殖v為1～50 m3·kg-1）[5]，也低于常規(guī)RAS（0.1～1 m3·kg-1）和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模RAS（生產(chǎn)1 kg 魚需要數(shù)百到數(shù)千升水）[5，19]，顯示出優(yōu)越的水資源利用效率。

3.4 微生物群落分析在硝化單元、反硝化單元和厭氧消化中，共檢測(cè)到21 個(gè)與氮代謝相關(guān)的菌屬（相對(duì)豐度大于0.05%），包括自養(yǎng)硝化菌屬（AOB 和NOB），異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌屬和反硝化菌屬（DB）；AOB 和NOB 主要富集在硝化單元中；HNADB 具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化的能力[21]，主要包括紅細(xì)菌屬、黃桿菌屬、氫噬胞菌屬和食酸菌屬（Acidovorax）等，該類菌屬在硝化單元、反硝化單元和厭氧消化3 個(gè)處理單元中均有富集。表明硝化單元中TAN 和NO2--N 的高效去除是AOB、NOB 和HNADB 共同作用的結(jié)果。同時(shí)，各處理單元中的脫氮作用也與HNADB 密切相關(guān)。在脫氮過(guò)程中，DB 也發(fā)揮著重要作用，主要包括羅姆布茨菌屬、土生單胞菌屬和熱單胞菌屬（Thermomonas）等，該類菌屬主要富集在反硝化單元和厭氧消化單元中。值得關(guān)注的是，硝化單元中同樣存在著DB，相對(duì)豐度為2.43%，因此，存在弱脫氮效果。

4 結(jié) 論

（1）本研究通過(guò)引入反硝化單元和厭氧消化單元組成三回路式RAS，達(dá)到養(yǎng)殖水循環(huán)利用、魚糞污泥減量化、穩(wěn)定化和控制NO3--N 的目的，實(shí)現(xiàn)每日約93%的養(yǎng)殖水體循環(huán)率。

（2）利用微濾機(jī)反沖洗的細(xì)小污泥作為反硝化碳源可行，反硝化運(yùn)行相對(duì)穩(wěn)定，有效控制NO3--N 水平，節(jié)約運(yùn)行成本。

（3）共21 個(gè)菌屬參與了N 代謝，包括紅細(xì)菌屬、黃桿菌屬和固氮螺旋菌屬等。其中紅細(xì)菌屬和黃桿菌屬等異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌屬HNADB在硝化單元被發(fā)現(xiàn)，表明硝化單元中存在弱脫氮作用。

（4）飼料中的N、P 僅有不到40%被魚同化，其余作為污染物被去除，是巨大的資源浪費(fèi)。因此，C、N、P 資源回收利用途徑研究具有重要意義。