創(chuàng)傷弧菌經(jīng)呼吸道感染小鼠早期靶器官損傷及炎性因子譜分析

張磊，劉劍飛，馬慧，周麗君*

1華南理工大學醫(yī)學院，廣東廣州 510006；2解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心中心實驗室，北京 100048；3解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學中心耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學部研究所，北京 100048；4解放軍總醫(yī)院護理部，北京 100853

弧菌是革蘭陰性菌，常被發(fā)現(xiàn)于河口、湖泊和海洋等水域中，可通過污染海產(chǎn)品對人類健康造成威脅，是食源性疾病的重要病原體之一[1-3]。在已知的12 種致病弧菌中，創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，V.vulnificus)致病性較強，易感人群感染后3 d 不處理，病死率可達100%[4]。隨著氣候轉(zhuǎn)暖、海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類海上活動增加，V.vulnificus感染人類的報道病例數(shù)連年增加，2006 年被Emerging Infectious Diseases雜志納入最危險的細菌之列[5-6]。除食源性途徑外，研究顯示V.vulnificus還可通過開放性傷口和外耳道等多種途徑入侵人體，引發(fā)原發(fā)性敗血癥，進而誘發(fā)耳炎、肺炎等繼發(fā)感染[7-8]。隨著航海作業(yè)增多，頻發(fā)的海水淹溺事件成為海上作業(yè)減員的重要因素[9]。發(fā)生海上淹溺事件時，V.vulnificus可隨海水經(jīng)呼吸道入侵人體。在此過程中，研究V.vulnificus經(jīng)呼吸道侵襲是否造成感染，判斷其感染程度和感染進展時間，進行受累靶組織致病分析等，對其經(jīng)呼吸道感染的防治具有重要意義。目前對V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染宿主的報道鮮見。本研究通過滴鼻途徑建立V.vulnificus呼吸道感染小鼠模型，觀察感染早期階段(0～12 h)小鼠的生存狀態(tài)和炎性因子譜變化，并進行靶組織病理學分析，旨在評估V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染對小鼠靶器官的致傷特點，為相關防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 無水乙醇、二甲苯、正丁醇購自國藥集團；4%多聚甲醛固定液、脫蠟透明液、檸檬酸抗原修復液(pH 6.0)、EDTA 抗原修復液(pH 9.0、pH 8.0)、PBS緩沖液、BSA、兔血清、蘇木精染液、伊紅染液和免疫組化試劑盒購自武漢賽維爾公司；2216E 瓊脂和2216E 肉湯購自青島海博公司；LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒購自美國BioLegend 公司。脫水機購自意大利DIAPATH 公司；包埋機、凍臺購自武漢俊杰公司；病理切片機購自德國Leica Biosystems 公司；顯微鏡成像系統(tǒng)購自日本Nikon公司；流式細胞儀購自美國Cytek公司。

1.1.2 弧菌V.vulnificus模式菌株1H00066購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(Marine Culture Collection of China，MCCC)，保存于含30%甘油的2216E培養(yǎng)基，-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實驗動物與分組 8～10 周齡SPF 級雌性BALB/c小鼠24只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021-0006]，體重17～18 g。隨機分為對照組、低濃度感染組、中濃度感染組和高濃度感染組，每組6 只。小鼠于SPF 條件下飼養(yǎng)于北京易科攀搏生物科技有限公司，實驗周期(60 h 適應性飼養(yǎng)+12 h 實驗)內(nèi)均自由飲食。本研究動物實驗方案經(jīng)康泰醫(yī)學檢驗服務河北有限公司實驗動物倫理委員會批準，所有流程均符合國際實驗動物科學理事會(the International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)的相關指南，并遵守國家有關實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 創(chuàng)傷弧菌呼吸道感染小鼠模型的制備V.vulnificus1H00066 復壯后，接種至2216E 肉湯，35 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h，12 000 r/min 室溫離心2 min。棄上清，菌體沉淀使用無菌1×PBS 洗滌3 次，并使用無菌1×PBS 分別稀釋至OD600nm=0.1(低濃度感染組)、OD600nm=0.2(中濃度感染組)、OD600nm=0.3(高濃度感染組)。各感染組分別取1 ml新鮮菌液，3000 r/min 室溫離心5 min；1×PBS 重懸至100 μl，充分渦旋混勻，4 ℃保存?zhèn)溆茫煌瑫r制備100 μl 1×PBS緩沖液作為對照組。各組小鼠均通過滴鼻給藥法逐滴緩慢滴入鼻腔，經(jīng)呼吸道給藥至體內(nèi)，構建創(chuàng)傷弧菌經(jīng)呼吸道感染小鼠模型。

1.2.2 實驗動物的處理及取材 在感染早期(0～12 h)每間隔1 h監(jiān)測一次各組小鼠的生存狀態(tài)，包括存活率、呼吸道與消化道有無異常癥狀、體表毛發(fā)情況及精神狀況。至12 h 監(jiān)測終點后麻醉小鼠并進行眼球取血，靜置分離血清備用。脫頸處死小鼠后，獲取心臟、肺、肝、脾、腎、胃(1×PBS去內(nèi)容物)、回腸段(部分)等重要內(nèi)臟器官，使用無菌1×PBS 沖洗，置于4%多聚甲醛固定液中固定，24 h 后更換固定液，直至完全固定，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 小鼠內(nèi)臟器官組織病理學分析 將完全固定的小鼠臟器組織進行石蠟包埋并切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，200×光鏡下觀察小鼠心臟、肺、肝、脾、腎、胃、回腸等內(nèi)臟器官的組織病理學變化。

1.2.4 免疫組化檢測小鼠回腸、肺、肝和脾組織中白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10、γ 干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α表達情況 將完全固定的小鼠臟器組織進行石蠟包埋并切片。經(jīng)脫蠟水化后，置于檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)中進行修復，隨后置于3% H2O2室溫避光孵育25 min，1×PBS 沖洗后加入血清封閉30 min。1×PBS沖洗后分別加入抗IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α 抗體，4 ℃孵育過夜，1×PBS 沖洗后加入二抗室溫孵育5 min。加入DAB顯色液，蘇木精復染3 min，脫水、封片。切片置于顯微鏡下觀察，結果標記為藍色(細胞核)、棕黃色(陽性表達的相應細胞因子)。采用Aipathwell 軟件分析IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α 的陽性表達率。陽性表達率(%)=陽性面積/組織面積×100%。

1.2.5 小鼠血清1 3種炎性細胞因子表達水平檢測采集小鼠血液，3000 r/min 室溫離心5 min，取上層血清儲存于-80 ℃冰箱備用。每個樣本吸取25 μl 血清，按照LEGENDplexTM多因子檢測試劑盒說明書方法，同時檢測各組小鼠血清中IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-10、 IL-23、 IL-12p70、 IL-17A、 IL-27、 IFN- γ、IFN-β、TNF-α、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1 和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等13 種炎性細胞因子的表達水平。實驗流程如下：混合包被熒光微球與25 μl 血清孵育2 h，加入25 μl 檢測抗體孵育60 min，加入25 μl 藻紅蛋白標記的鏈霉親和素(SA-PE)孵育30 min；采用流式細胞術檢測13種細胞因子的熒光強度，利用LEGENDplex軟件進行數(shù)據(jù)處理，對其表達量進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)發(fā)布，以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠外觀生理學變化 感染后0～12 h，不同濃度感染組小鼠均先后出現(xiàn)較明顯的外觀生理學改變，包括弓背、安靜、精神萎靡、立毛、毛發(fā)粗糙、呼吸異常和腹瀉等癥狀；各組差異主要體現(xiàn)為不同癥狀的時間進程。隨感染程度加重，外觀生理學改變發(fā)生時間前移，異常表現(xiàn)的小鼠數(shù)量增加。高濃度感染組小鼠于感染后12 h 死亡1 例，低、中濃度感染組無死亡病例。此外，各組小鼠均未見昏迷、暈厥、嘔吐、寒戰(zhàn)或局部表層皮膚壞死等經(jīng)消化道感染或開放傷口感染后的常見癥狀。

2.2V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠靶器官及相關組織病理學檢查結果 HE染色結果顯示，與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠的腎、心臟、胃均未見異常病理變化，而肝、肺、回腸、脾等器官出現(xiàn)不同程度的病理損傷，且高濃度感染組損傷程度更重(圖1)。

圖1 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠主要臟器病理改變(HE ×200)Fig.1 Pathological changes of major organs in mice with V. vulnificus early infection via respiratory tract (HE ×200)

(1)肝。對照組小鼠肝細胞排列整齊，形態(tài)正常，著色均勻，結構清晰，無明顯病理變化。低濃度感染組小鼠肝組織邊緣可見少量肝細胞水樣變性，細胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染；中濃度感染組小鼠肝組織中可見較多肝細胞氣球樣變性，細胞腫脹，核居中，胞質(zhì)空泡化；高濃度感染組小鼠肝組織中可見較多肝細胞水樣變性，細胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，多見淋巴細胞與點狀的巨噬細胞就浸潤，少見肝細胞點狀壞死，核溶解。(2)肺。對照組小鼠肺組織無異常病理表現(xiàn)。低濃度感染組可見肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細胞與中性粒細胞浸潤；中濃度感染組可見較大范圍的肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，局部可見出血；高濃度感染組可見較大范圍的肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細胞、中性粒細胞與巨噬細胞浸潤，可見較多出血。(3)回腸。對照組小鼠回腸形態(tài)結構正常，未見明顯的炎癥表現(xiàn)。低濃度感染組小鼠回腸組織局部固有層底部可見少量淋巴細胞浸潤；中濃度感染組小鼠回腸組織黏膜層局部可見腸腺擴張，腺腔內(nèi)可見壞死細胞碎片；高濃度感染組小鼠回腸組織黏膜層可見多處水腫，腸上皮與固有層之間可見空隙。(4)脾。對照組脾組織結構正常。低濃度感染組可見多處脾小結生發(fā)中心擴張，紅髓有大面積髓外造血灶，伴有多核巨細胞數(shù)量明顯增多；中濃度感染組脾小結數(shù)量明顯減少，紅髓有大面積髓外造血灶，伴有多核巨細胞數(shù)量增多；高濃度感染組小鼠局部脾小結中可見生發(fā)中心擴張，紅髓有大面積髓外造血灶，伴有多核巨細胞數(shù)量明顯增多，少見中性粒細胞浸潤。

2.3V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠靶器官中炎性因子表達變化 采用免疫組織化學法檢測V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠靶器官(回腸、肺、肝和脾)中炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α 的陽性表達率，結果見圖2－5。

圖2 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠回腸組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達變化Fig.2 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in intestinal of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.3.1 回腸 與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠回腸組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達率均明顯增高(P<0.05)。中、高濃度感染組小鼠回腸組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達率均明顯高于低濃度感染組(P<0.05)(圖2)。

2.3.2 肺 與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠肺組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達率均明顯增高(P<0.05)。中、高濃度感染組小鼠肺組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達率均明顯高于低濃度感染組(P<0.05)(圖3)。

圖3 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠肺組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達變化Fig.3 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in lung of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.3.3 肝 與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠肝組織中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達率均明顯增高(P<0.05)。中、高濃度感染組小鼠肝組織中IL-6、IL-10 和IFN-γ 的陽性表達率均明顯高于低濃度感染組(P<0.05)(圖4)。

圖4 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠肝組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達變化Fig.4 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in liver of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.3.4 脾 與對照組比較，低濃度感染組小鼠脾組織IL-10、IFN-γ 和TNF-α 的陽性表達率均明顯增高(P<0.05)，IL-6 的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。中、高濃度感染組小鼠脾組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽性表達率均明顯高于低濃度感染組和對照組(P<0.05)(圖5)。

圖5 V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠脾組織IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的表達變化Fig.5 Expression of IL-6, IL-10, IFN-γ, and TNF-α in spleen of mice with early infection of V. vulnificus via respiratory tract

2.4V.vulnificus呼吸道感染早期小鼠血清促炎-抑炎因子譜變化 采用高通量多因子檢測結合流式細胞術結果顯示，與對照組比較，低、中、高濃度感染組小鼠血清TNF-α、MCP-1 表達水平明顯增高(P<0.05)，IL-27表達水平明顯降低(P<0.05)，IL-10和IFN-β 表達水平無明顯差異(P>0.05)，而中、高濃度感染組小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-17A、GM-CSF表達水平明顯增高(P<0.05)，高濃度感染組小鼠血清IL-1α、IL-23、IL-12p70、IFN-γ表達水平均明顯增高(P<0.05，表1)。

表1 V. vulnificus呼吸道感染早期小鼠血清13種炎性因子表達水平(pg/ml, ±s, n=6)Tab.1 Expression levels of 13 inflammatory factors in serum of mice with V. vulnificus early infection via respiratory tract (pg/ml, ±s, n=6)

表1 V. vulnificus呼吸道感染早期小鼠血清13種炎性因子表達水平(pg/ml, ±s, n=6)Tab.1 Expression levels of 13 inflammatory factors in serum of mice with V. vulnificus early infection via respiratory tract (pg/ml, ±s, n=6)

IL.白細胞介素；IFN.干擾素；TNF-α.腫瘤壞死因子-α；MCP-1.單核細胞趨化蛋白-1；GM-CSF.粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；與對照組比較，(1)P<0.05；與低濃度感染組比較，(2)P<0.05；與中濃度感染組比較，(3)P<0.05

高濃度感染組8.58±0.44(1)(2)(3)10.53±0.81(1)(2)(3)7.64±0.73(1)(2)3.15±0.00 15.15±1.27(1)(2)(3)4.27±0.25(1)(2)(3)8.28±0.88(1)(2)1.69±0.00(1)7.76±0.71(1)(2)(3)14.43±0.09 104.70±1.97(1)(2)(3)17.61±0.37(1)(2)(3)113.10±10.47(1)(2)(3)炎性因子IL-1β IL-1α IL-6 IL-10 IL-23 IL-12p70 IL-17A IL-27 IFN-γ IFN-β TNF-α MCP-1 GM-CSF對照組3.74±0.00 5.91±0.46 3.99±0.32 3.31±0.28 3.93±0.00 1.85±0.00 3.49±0.17 33.16±8.87 4.28±0.54 15.55±0.74 3.82±0.00 5.08±0.70 15.36±2.14低濃度感染組4.08±0.59 6.07±0.50 4.46±0.35 3.15±0.00 3.93±0.19 2.06±0.19 4.80±0.82 1.69±0.00(1)5.32±0.92 14.51±0.71 41.33±3.62(1)8.47±0.62(1)19.03±6.38中濃度感染組5.30±0.46(1)6.62±0.26 6.56±0.62(1)(2)3.15±0.00 4.04±0.19 2.22±0.33 6.62±1.35(1)1.69±0.00(1)5.66±0.33 15.62±0.41 68.03±2.37(1)(2)15.71±0.20(1)(2)27.86±3.99(1)

3 討 論

既往研究顯示，V.vulnificus可通過消化道和局部傷口兩種途徑感染人類，且病程進展迅速，經(jīng)消化道感染后主要表現(xiàn)為腸胃炎、敗血癥和蜂窩組織炎等，經(jīng)傷口感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、膿毒血癥和壞死性筋膜炎等[10]。上述兩種感染途徑均可迅速導致人體發(fā)生嚴重的炎性反應，從而造成多器官損傷，病死率超過50%[11]。呼吸道是人體與外界相通的重要途徑，發(fā)生海上淹溺事件時，V.vulnificus可能通過呼吸道入侵人體，但目前對V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染的報道少見。本研究采用滴鼻法建立了不同濃度V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染小鼠模型，對其早期感染進程(0～12 h)中的致傷作用進行了病理學觀察，可為進一步研究V.vulnificus多途徑感染致病性及臨床救治提供參考。

本研究廣泛摘取V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染早期小鼠循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的重要器官組織，病理學觀察顯示，回腸、肺、肝、脾等器官出現(xiàn)不同程度的損傷，應為V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染后主要的受累靶器官。其中肝細胞損傷程度隨菌液接種濃度增高而加重。肺組織隨菌液接種濃度增高，其炎性浸潤程度呈上升趨勢。回腸組織的病變程度隨V.vulnificus菌液接種濃度增高而呈現(xiàn)更加復雜的臨床變化。脾組織代償性造血功能出現(xiàn)的頻率隨V.vulnificus感染程度加重而增高，提示合并多組織損傷程度加深。

本研究結果顯示，小鼠經(jīng)呼吸道感染V.vulnificus后，可在12 h 內(nèi)引起呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等器官不同程度的組織結構損傷、細胞變形和炎性細胞浸潤，這些病理學表現(xiàn)可對感染組小鼠的腹瀉、喘咳等外觀生理學癥狀做出解釋。對V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染與經(jīng)其他途徑感染進行比較，經(jīng)腹腔、皮下和肌肉感染V.vulnificus除可引起脾、肺、肝產(chǎn)生病理學變化外，還可導致小鼠出現(xiàn)心臟和腎組織損傷，但胃和腸無顯著病理變化；V.vulnificus經(jīng)消化道感染較之其他感染途徑的致傷作用更為廣泛，可導致小鼠心臟、肝、脾、肺、腎、胃和腸等器官組織的廣泛損傷，引起更為嚴重的繼發(fā)感染[12-15]。本研究結果顯示，V.vulnificus可通過呼吸道感染小鼠，在其早期感染進程中，心臟、腎和胃受到的影響較小。此結果可為判定V.vulnificus的感染途徑提供參考，從而及時針對受累器官展開臨床診斷和治療。對于不同途徑感染V.vulnificus后受累靶器官的損傷情況及其致傷機制有待進一步研究。

本研究結合病理學觀察，測定了小鼠受累靶器官回腸、肺、肝、脾中炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α 的表達水平，結果顯示，經(jīng)呼吸道感染V.vulnificus后靶器官中IL-6、IL-10、IFN-γ 和TNF-α的表達量隨菌液接種濃度升高而增加，提示靶器官損傷程度隨小鼠感染程度加重而加重。作為促炎因子，IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達增加會引起機體炎性反應，在此基礎上易合并其他癥狀而造成器官損傷[16-17]。陸海霞等[14]的研究顯示，小鼠經(jīng)腹腔途徑感染V.vulnificus后，肝組織中IL-6、IFN-γ 和TNF-α表達明顯升高，與本研究結果一致。在本研究中，感染組小鼠靶器官中抑炎因子IL-10 表達量明顯升高，究其原因，可能是由于V.vulnificus感染早期機體分泌促炎因子，導致促炎反應的發(fā)生和促炎細胞因子的大量釋放，隨之刺激抑炎因子代償性分泌增多。此外，本研究結果提示，當促炎因子總體表達水平顯著高于抑炎因子時，會引起靶器官發(fā)生炎性反應，導致器官、組織和細胞受損。

既往研究顯示，V.vulnificus在感染過程中會誘導多種炎性因子參與機體內(nèi)的炎性反應[18]。為進一步明確V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染小鼠后血清炎性因子譜的變化規(guī)律，同時為V.vulnificus呼吸道感染的無創(chuàng)性診斷提供參考，本研究進一步檢測了小鼠血清中多種炎性因子的變化，結果顯示，不同濃度感染組小鼠血清中多種促炎因子表達水平均呈升高趨勢，在高濃度感染組中尤為明顯，其中TNF-α和MCP-1的表達變化相對更為顯著。TNF-α 作為發(fā)生感染時體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)之一，可刺激其他細胞因子如IL-6、血小板活化因子的產(chǎn)生，引起多器官功能損害，是組織損傷的早期敏感指標[19]。而巨噬細胞、單核細胞在靶器官受到嚴重損傷時可誘導分泌MCP-1，導致其表達水平明顯升高[20]。這兩種促炎因子表達水平的顯著變化提示V.vulnificus呼吸道感染早期宿主體內(nèi)可能存在廣泛的炎性反應。同時，本研究結果顯示，血清中平衡炎性反應的細胞因子IL-27表達水平迅速下降，造成表達失調(diào)，加劇了機體的炎性反應，進而協(xié)同促炎因子而對機體造成損傷。IL-27的類似變化鮮見于其他相關研究，提示其具備作為V.vulnificus呼吸道感染早期敏感指標的潛在價值。此外，TNF-α 和GM-CSF 在高濃度感染組小鼠血清中表達水平明顯增高，均超過100 pg/ml。IL-10 和IFN-β 作為抑炎因子，其表達量在感染后變化不明顯，提示其可能不適合作為V.vulnificus呼吸道感染早期檢測指標。由此可見，在經(jīng)呼吸道感染V.vulnificus后，及時監(jiān)測血清中炎性因子譜的變化對于病情判斷和臨床治療具有重要指導意義。

本研究存在一定局限性。首先，感染實驗采用標準菌株，缺乏對不同來源菌株的相關研究，從而導致實驗結果可能存在偏差，因此需要加強對國內(nèi)其他來源V.vulnificus菌株的呼吸道致病性研究；其次，尚未以V.vulnificus致病的具體機制為突破點開展進一步探索?；谏鲜鰞牲c，本課題組在未來應進一步展開樣本擴大實驗和V.vulnificus呼吸道致病機制研究。

綜上所述，本研究成功構建了多濃度V.vulnificus呼吸道感染小鼠模型，結果顯示，回腸、肺、肝和脾是該途徑感染重要的靶器官；感染早期小鼠出現(xiàn)了明顯的外觀生理學改變，靶器官中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α呈高表達，同時血液中多種炎性因子表達失衡，促使機體內(nèi)過度炎性反應的發(fā)生，誘導小鼠廣泛的機體損傷。TNF-α、MCP-1 和IL-27 可能成為V.vulnificus經(jīng)呼吸道感染早期的潛在敏感指標。