耐高溫和耐低溫固體復(fù)合菌劑對(duì)牛糞堆肥的影響

岳世林,馬曉勇,姜國(guó)均

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000)

堆肥處理是養(yǎng)殖場(chǎng)處置糞便最普遍方式,具有處理成本低、能殺滅病原菌、有效降解有機(jī)污染物等優(yōu)點(diǎn),在我國(guó)河北、內(nèi)蒙古等省區(qū)應(yīng)用廣泛[1]。但北方地區(qū)秋冬季節(jié)氣溫偏低,導(dǎo)致堆肥發(fā)酵慢、效率低,在低溫條件下將牛糞順利堆肥是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題[2]。牛糞中的纖維素、木質(zhì)素等難降解物質(zhì)主要在高溫期進(jìn)行分解,但由于溫度過(guò)高,大部分微生物無(wú)法生存,因此解決高溫期微生物存活也具有重要意義。本試驗(yàn)將篩選出耐高溫和耐低溫菌添加到牛糞中,研究低溫下兩者結(jié)合對(duì)牛糞堆肥發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 牛糞

經(jīng)過(guò)干濕分離含水率為60%的新鮮牛糞,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)牛場(chǎng)提供。

1.2 耐高溫和耐低溫菌

本試驗(yàn)從牛糞堆肥過(guò)程的高溫和低溫期初選出耐高溫和耐低溫菌種,通過(guò)菌株鑒定、淀粉水解、纖維素降解、蛋白質(zhì)水解和拮抗試驗(yàn),最終篩選出8株細(xì)菌。耐高溫菌為嗜熱鏈球菌和地衣芽孢桿菌P8-B2,耐低溫菌包括地衣芽孢桿菌DSM13、地衣芽孢桿菌MRPDSCV17203、巨大芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌AYYT-1、蠟狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。各種細(xì)菌生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期80%時(shí),置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 復(fù)合菌劑制備

將干燥細(xì)麩皮和細(xì)鋸末高壓滅菌,取400 g加入100 g葡萄糖與耐高溫菌混合,記為X1;取細(xì)麩皮和細(xì)鋸末1 200 g,加入300 g葡萄糖與耐低溫菌混合,記為X2。將葡萄糖作為發(fā)酵引物,用適量蒸餾水與固體基質(zhì)混合均勻,含水量為60%,分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,耐高溫菌55 ℃培養(yǎng),耐低溫菌25 ℃培養(yǎng)。將混合好的固體取出,在烘箱中以25 ℃和55 ℃進(jìn)行烘干,將含水量為0%的X1和X2在常溫下混合均勻,固體復(fù)合菌劑制備完成。

1.4 堆肥及樣品采集

2020年12月進(jìn)行堆肥處理,堆肥期22 d。堆肥當(dāng)天記錄為第1天,定時(shí)取樣,理化指標(biāo)采樣時(shí)間為第0、5、10、15、20天,試驗(yàn)組設(shè)為T(mén)組,對(duì)照組設(shè)為C組。高通量測(cè)序采樣時(shí)間為堆肥初期(T1、C1)、升溫期(T2、C2)、高溫期(T3、C3)、降溫期(T4、C4)和腐熟期(T5、C5)5個(gè)時(shí)期,試驗(yàn)組、對(duì)照組和每一個(gè)堆肥時(shí)期均做3個(gè)重復(fù);從堆體四個(gè)角和中心部位(15、30、45 cm)處分別取樣,將同時(shí)期不同部位的樣品均勻混合,一部分-20 ℃保存用于理化指標(biāo)檢測(cè),另一部分-80 ℃保存,用于高通量測(cè)序分析物種組成和各階段優(yōu)勢(shì)微生物。

T組:固體復(fù)合菌劑與牛糞混合均勻,取約170 kg牛糞進(jìn)行堆肥,菌劑接種量約為0.94%;C組:添加等量細(xì)麩皮、細(xì)鋸末和葡萄糖與牛糞混合均勻。

1.5 理化指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)期每天在9:00和17:00各測(cè)量1次,測(cè)量所有取樣點(diǎn)求平均值作為當(dāng)天的堆溫并測(cè)量室溫;pH采用pH計(jì)測(cè)量;含水率采用105 ℃烘干法進(jìn)行測(cè)定;總有機(jī)碳和全氮測(cè)定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB13193-91和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 297-1995;有機(jī)質(zhì)測(cè)定為有機(jī)碳×1.724;全磷和全鉀測(cè)定參考農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NYT 298-1995、NYT 299-1995;種子發(fā)數(shù)指數(shù)(GI)參照王雪的方法測(cè)定[3]。每項(xiàng)指標(biāo)分別重復(fù)3次測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用T-test進(jìn)行顯著性分析,顯著性分析采用SPSS軟件,柱狀圖和折線圖采用GraphPad軟件,稀釋曲線、物種組成及優(yōu)勢(shì)微生物分析采用軟件QIIME2。

1.7 物種組成及優(yōu)勢(shì)微生物

采用派森諾生物有限公司(上海)Illumina平臺(tái)Miseq進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。通過(guò)上機(jī)檢測(cè)得到各樣本有效數(shù)據(jù)分析物種組成和優(yōu)勢(shì)菌群。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)

2.1.1 溫度 由圖1可見(jiàn),堆肥過(guò)程需要22 d,兩組堆肥溫度變化趨勢(shì)基本一致,先升高后降低。T組和C組第1天堆溫分別為28.3和21.0 ℃;T組溫度快速上升,比C組提前兩天到達(dá)高溫階段,第5天進(jìn)入高溫期溫度為55.3 ℃,第8天達(dá)到堆肥最高溫59.7 ℃,高溫階段持續(xù)7 d;C組第7天溫度為55.3 ℃,第9天達(dá)到最高溫56.3 ℃,高溫階段持續(xù)5 d,基本符合我國(guó)《糞便無(wú)害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB7959-87)》。表明添加復(fù)合菌劑可以迅速啟動(dòng)堆肥初始溫度,提高堆肥最高溫并延長(zhǎng)高溫時(shí)間。

圖1 堆肥過(guò)程中溫度的變化

2.1.2 pH 由圖2可見(jiàn),本次堆肥中pH先升高再降低。初始pH在8.0左右,隨著堆肥過(guò)程的進(jìn)行,第5天試驗(yàn)組pH與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05),其他時(shí)間段試驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)顯著行差異。pH第10天達(dá)到最大值,隨后pH一直下降,在結(jié)束時(shí)降到最低值,維持在8.0～8.5之間。

圖2 堆肥過(guò)程中pH的變化

2.1.3 含水率 由圖3可見(jiàn),堆肥初始含水率均約60.0%,2組堆肥含水率變化趨勢(shì)基本一致。堆肥結(jié)束時(shí),C組含水率下降了18.4%,T組最終下降了24%,第5、10、15天2組差異顯著。表明在牛糞堆肥過(guò)程中,添加該復(fù)合菌劑可促進(jìn)水分揮發(fā)。

圖3 堆肥過(guò)程中含水率的變化

2.1.4 碳氮比 由圖4可見(jiàn),堆肥過(guò)程中C/N變化規(guī)律是一直下降,初始牛糞C/N無(wú)顯著性差異,第5、10、15天時(shí),試驗(yàn)組相比對(duì)照組顯著降低(P<0.01),第20天無(wú)顯著差異,本次試驗(yàn)初始C/N值C組和T組分別為32.0和32.4,堆肥結(jié)束時(shí)C組和T組C/N值分別為16.4和15.1。表明添加菌劑后堆肥C/N下降更快。

圖4 堆肥過(guò)程中C/N的變化

2.1.5 有機(jī)質(zhì) 由圖5可見(jiàn),堆肥過(guò)程有機(jī)質(zhì)含量呈緩慢減少趨勢(shì)。第0天、20天時(shí),T組相比C組無(wú)顯著性差異,第5天、10天時(shí)T組相比C組極顯著降低(P<0.01),第15天T組相比C組顯著降低(P<0.05)。C和T初始含量分別為682.3、682.5 g/kg,最終含量分別為567.7、559 g/kg,分別下降了114.6、123.5 g/kg,早期堆肥牛糞中所含的大量易分解的有機(jī)物迅速分解下降快。

圖5 堆肥過(guò)程中有機(jī)質(zhì)的變化

2.1.6 全磷 由圖6可見(jiàn),堆肥過(guò)程中全磷含量呈上升趨勢(shì)。第0～5天T組相比C組無(wú)顯著性差異,第10天T組相比C組顯著升高(P<0.05),第15天、20天時(shí)T組相比C組無(wú)顯著性差異。C組和T組初始含量分別為54.4、55.3 g/kg,最終含量分別為63.1、66.1 g/kg。表明在堆肥過(guò)程中,添加菌劑可提高總磷含量。

圖6 堆肥過(guò)程中全磷的變化

2.1.7 全鉀 由圖7可見(jiàn),堆肥過(guò)程中全鉀含量呈上升趨勢(shì)。所有時(shí)間段T組相比C組均無(wú)顯著性差異。C組和T組初始含量為7.4 g/kg,最終含量分別為11.0、11.6 g/kg。表明在堆肥過(guò)程中添加菌劑對(duì)總鉀含量影響不大。

圖7 堆肥過(guò)程中全鉀的變化

2.1.8 種子發(fā)芽指數(shù)(GI) 由圖8可見(jiàn),堆肥過(guò)程中GI呈上升趨勢(shì)。第0天和20天時(shí)T組相比C組無(wú)顯著性差異,第5天和15天T組相比C組顯著升高(P<0.05),第10天時(shí)T組相比C組極顯著升高(P<0.01)。C組和T組初始GI分別26%和26.3%,最終GI分別為88.2%和92.7%,第0～10天兩組上升幅度最大,說(shuō)明高溫期對(duì)GI起關(guān)鍵作用,堆肥結(jié)束時(shí)兩組的GI均已超過(guò)80%,可視為該牛糞已無(wú)植物毒性或者牛糞已經(jīng)腐熟。

圖8 堆肥過(guò)程中GI的變化

2.2 高通量測(cè)序分析

2.2.1 稀釋曲線 由圖9可見(jiàn),C1和T1曲線最低,依次逐漸升高,最高的是C5和T5。表明本次試驗(yàn)的測(cè)序量達(dá)到符合反映本次試驗(yàn)中牛糞菌群的多樣性組成水平。

圖9 Alpha指數(shù)稀疏曲線

2.2.2 物種組成及優(yōu)勢(shì)微生物 由圖10可見(jiàn),C組和T組門(mén)水平牛糞堆肥樣品中物種組成及優(yōu)勢(shì)微生物。共檢出31個(gè)門(mén),本圖僅顯示豐度最高前10個(gè)。物種組成主要包括:變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌(Actinobacteria)、綠灣菌門(mén)(Chloroflexi)、Thermi、柔膜菌門(mén)(Tenericutes)和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)。各種菌群多樣性在C組和T組的變化規(guī)律基本一致,但是豐度占比有很大差異。Proteobacteria是兩組各階段的優(yōu)勢(shì)微生物,占比均為58.0%相差不大;Bacteroidetes存在各階段,但是高溫期的豐度占比最高,C3和T3豐度分別為32.5%和35.5%;Firmicutes在堆肥結(jié)束幾乎不存在,為堆肥初期(C1、T1)和升溫期(C2、T2)優(yōu)勢(shì)微生物,C1、T1、C2、T2豐度分別為17.9%、24.4%、13.0%、14.4%;Actinobacteria是初期、降溫期(C4、T4)和腐熟期(C5、T5)優(yōu)勢(shì)微生物,豐度占比均為8.0%左右相差很小;Chloroflexi是降溫期和腐熟期優(yōu)勢(shì)微生物,C4、T4、C5、T5豐度分別為11.2%、12%、13.3%、20.3%。試驗(yàn)表明加入復(fù)合菌劑會(huì)改變細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖情況,改變各菌種在不同堆肥階段豐度占比,增加優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量。

圖10 門(mén)水平物種組成

由圖11可見(jiàn),C組和T組屬水平牛糞堆肥樣品中物種組成及優(yōu)勢(shì)微生物。共檢出41個(gè)屬,本圖僅顯示豐度最高前10個(gè)。物種組成主要包括:其他菌(Others)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、放線菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、魯氏絲狀桿菌(Ruminofilibacter)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、棲海面菌屬(Aequorivita)、藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)、B-42和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)。除了Others占比最高外,Pseudomonas升溫期的優(yōu)勢(shì)微生物,C2和T2豐度分別為22.0%和23.0%;Acinetobacter、Psychrobacter和Corynebacterium是初期的優(yōu)勢(shì)微生物,C1和T1豐度分別為10.1%、23.4%、17.0%、15.0%、4.9%和5.2%;Cellvibrio是高溫期的優(yōu)勢(shì)微生物豐度為T(mén)3 6.0%和C3 5.0%;Ruminofilibacter降溫期和腐熟期的優(yōu)勢(shì)微生物,豐度由1.0%上升至C5中3.7%,由7.0%上升至T5中10.0%;藤黃色單胞菌屬(Luteimonas)和B-42在各組各階段占比很小,但依然可以看出是高溫期及降溫期的優(yōu)勢(shì)微生物。試驗(yàn)說(shuō)明,在堆肥前加入復(fù)合菌劑會(huì)改變各種微生物在堆肥不同時(shí)期的豐度占比,優(yōu)勢(shì)微生物數(shù)量增加。

圖11 屬水平物種組成

3 討 論

在冬季進(jìn)行牛糞堆肥,添加復(fù)合菌劑的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比,堆溫迅速升高,高溫期持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),C/N、含水率、有機(jī)質(zhì)含量下降快,GI上升,尤其是GI明顯提高,隨著堆肥反應(yīng)的進(jìn)行,牛糞堆肥堆體 TP、TK含量均呈上升趨勢(shì),這主要由于牛糞進(jìn)行堆肥過(guò)程中,有機(jī)C、有機(jī)N 和有機(jī)P均被微生物同化吸收及異化分解,但對(duì)K元素吸收利用率很低,微生物對(duì)有機(jī)C、N、P的需求高于對(duì)有機(jī)K的需求,K元素在堆肥過(guò)程中基本無(wú)損耗,添加微生物沒(méi)有顯著改變,而微生物對(duì)有機(jī)C的需求高于對(duì)有機(jī)N的需求,也高于對(duì)有機(jī)P的需求,一般需求比例為 C:N:P=100:5:1[4],在堆肥降解過(guò)程中有機(jī)C的降解速率高于有機(jī)N,高于有機(jī)P,導(dǎo)致堆肥過(guò)程中有機(jī)P的損耗率低于有機(jī)C和有機(jī)N,所以牛糞堆肥堆體TP含量均呈上升趨勢(shì),添加復(fù)合菌劑后變化趨勢(shì)一致,可以顯著降低C/N,因此TP含量顯著升高[5];各菌群豐度變化明顯。大多數(shù)的研究都是將耐高溫菌或耐低溫菌其中一類(lèi)菌添加在牛糞中驗(yàn)證堆肥效果,很少有研究將二者放在一起制成復(fù)合菌劑,分析對(duì)堆肥發(fā)酵的影響。本試驗(yàn)通過(guò)將耐高溫菌和耐低溫菌混合制備固體復(fù)合菌劑添加在牛糞中,在冬季進(jìn)行堆肥發(fā)酵,即驗(yàn)證制備的菌劑在冬季的堆肥效果。事實(shí)上微生物代謝是堆肥性質(zhì)變化的根本原因[6],微生物通過(guò)代謝有機(jī)物來(lái)釋放能量和養(yǎng)分,從而促進(jìn)堆肥的成熟,堆肥的成熟反過(guò)來(lái)促使微生物生長(zhǎng)和繁殖[7],Jusoh等[8]研究結(jié)果表示接種菌劑有利于堆肥礦化作用,縮短堆肥腐熟時(shí)間5～8 d,劉陽(yáng)等[9]研究表明,添加耐低溫復(fù)合細(xì)菌可以有效促進(jìn)堆肥在低溫條件下的溫度升高,并加速高溫時(shí)期的開(kāi)始,周伏忠等[10]通過(guò)添加自研的耐高溫微生物制劑來(lái)發(fā)酵雞糞生產(chǎn)有機(jī)肥料,獲得了良好的結(jié)果,與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致,說(shuō)明添加耐低溫菌和耐高溫菌對(duì)堆肥發(fā)酵有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)篩選的細(xì)菌只有一株是鏈球菌,其余幾株均為芽孢桿菌,與Jing等[11]研究結(jié)果基本一致,研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌是原始堆肥高溫期的主要優(yōu)勢(shì)菌,可能與芽孢桿菌耐高溫和耐低溫的生長(zhǎng)特性有關(guān),也可以在低溫環(huán)境良好生長(zhǎng),同時(shí)由高通量測(cè)序分析高溫期的優(yōu)勢(shì)微生物是Bacteroidetes,與本試驗(yàn)篩選的菌基本相符,芽孢桿菌屬,可以延長(zhǎng)高溫堆肥時(shí)間,對(duì)指導(dǎo)微生物菌劑在堆肥中應(yīng)用和進(jìn)一步提高堆肥效率具有重要意義[12]。嗜熱鏈球菌是一株高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵菌株[13],常做為酸奶的發(fā)酵劑之一,被廣泛的應(yīng)用于發(fā)酵乳制品加工當(dāng)中[14],而在工業(yè)發(fā)酵中研究較少,本試驗(yàn)在牛糞堆肥發(fā)酵高溫期中篩選到該菌,并發(fā)現(xiàn)對(duì)糞便中纖維素有一定的降解作用,因此可以繼續(xù)研究該菌在堆肥發(fā)酵中的作用。本試驗(yàn)中篩選到耐高溫菌2株,可繼續(xù)進(jìn)行篩選,耐低溫菌可以從多個(gè)環(huán)境中篩選,如直接從凍土中篩選,但能否在堆肥過(guò)程中存在,與牛糞中固有菌是否互利共生,還需要更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究表明,添加佐劑成功制備耐高溫和耐低溫堆肥發(fā)酵固體微生物復(fù)合菌劑,縮短了堆肥時(shí)間,提高了堆肥效率和有機(jī)肥品質(zhì)。堆肥溫度和微生物數(shù)量是堆肥成功的關(guān)鍵。