外泌體調(diào)控胚胎發(fā)育的研究進(jìn)展

盧永昌,甘建宇,黃思秀,洪林君

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510642)

胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育需要與母體之間建立正確的信息交流,胚胎在子宮中所處的微環(huán)境直接影響到胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。外泌體作為胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控因子之一,其中所含物質(zhì)的變化有可能會(huì)導(dǎo)致胚胎生長(zhǎng)發(fā)育受阻甚至死胎[1]。近年來(lái),外泌體在調(diào)節(jié)胚胎微環(huán)境影響胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制正受到越來(lái)越多的關(guān)注。但研究主要聚焦于外泌體中的一些蛋白質(zhì)、RNA或其他因子的含量變化,對(duì)于外泌體在胚胎發(fā)育過(guò)程的具體影響作用機(jī)制的研究尚沒(méi)有特別深入,因此深入分析外泌體所含物質(zhì)對(duì)胚胎發(fā)育的調(diào)控作用能夠有效提高胚胎成活率,有力推動(dòng)家畜的遺傳選育。本文對(duì)外泌體與胚胎發(fā)育間的聯(lián)系做一綜述,以期對(duì)外泌體對(duì)胚胎發(fā)育的影響機(jī)制提供參考。

1 外泌體概述

外泌體(Exosome)是內(nèi)源性脂質(zhì)納米粒(LNP)與細(xì)胞內(nèi)的多囊小體融合后,通過(guò)細(xì)胞間的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主動(dòng)分泌到細(xì)胞外液中的一種細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)[2],直徑約為30～100 nm[3]。Salamonsen等[4]在2013年首先報(bào)道了人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系ECC1可以產(chǎn)生EVs,并證實(shí)了子宮腔液中存在外泌體。研究發(fā)現(xiàn),外泌體對(duì)人[5]、大鼠[6]、牛[1]、羊[7]和豬[8]等多種哺乳動(dòng)物的妊娠過(guò)程和胚胎發(fā)育過(guò)程發(fā)揮著重要作用,并具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控細(xì)胞分裂、分化、抗氧化等多方面的功能。對(duì)母胚交流、胚胎發(fā)育有影響作用的外泌體主要來(lái)源于胎盤(pán)[9]、子宮內(nèi)膜[4]和胚胎[10],且不同器官產(chǎn)生的外泌體有著不同的功能,其引起介導(dǎo)作用的程度也均不相同[11-16]。胚胎產(chǎn)生的外泌體能夠在母體的子宮內(nèi)膜中被發(fā)現(xiàn),而胚胎同樣可以吸收子宮內(nèi)膜中產(chǎn)生的外泌體,從而對(duì)自身的發(fā)育起到影響作用[10]。這意味著外泌體的相互傳遞是母體與胚胎之間的一種交流形式[17],也反映了不同來(lái)源的外泌體具有相互影響的作用。

2 外泌體對(duì)胚胎發(fā)育的影響

胚胎以外泌體為媒介與母體子宮內(nèi)膜“溝通”。存在于外泌體內(nèi)的RNA(如microRNA (miRNA)、mRNA、長(zhǎng)非編碼RNA (lncRNA)、環(huán)狀RNA (circRNA)等[11])一般被統(tǒng)稱為外泌體穿梭RNA (esRNA)。esRNA在與靶細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合過(guò)程中傳遞到靶細(xì)胞基質(zhì)中,并通過(guò)多個(gè)機(jī)制影響著細(xì)胞的生命活動(dòng)[19]。外泌體中的部分內(nèi)容物在促進(jìn)胚胎附植、調(diào)控基因表達(dá)、影響組織器官形成等方面發(fā)揮著重要作用。

2.1 胚胎發(fā)育過(guò)程

輸卵管中精子與卵子通過(guò)受精作用融合發(fā)育成為受精卵。受精卵在透明帶中不斷卵裂,在經(jīng)歷多次有絲分裂過(guò)程后進(jìn)入桑葚胚期。受輸卵管生理環(huán)境影響,桑葚胚之前較容易出現(xiàn)發(fā)育阻滯和胚胎衰老現(xiàn)象[20],因此早期胚胎發(fā)育主要受輸卵管環(huán)境調(diào)控[21]。隨著胚胎的不斷發(fā)育,在受精后6 d左右(如,豬需要5～6 d,牛7～8 d,羊6～7 d)[22],胚胎細(xì)胞開(kāi)始分化進(jìn)入囊胚期,此時(shí)囊胚游離于子宮腔液中,并處于自由狀態(tài)。囊胚從透明帶(ZP)的孵化是胚胎發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程,以豬為例,這個(gè)過(guò)程大約在第8天時(shí)結(jié)束。這一階段由于早期精卵細(xì)胞較弱,受精卵的活力低,因此容易死亡并被母體吸收。囊胚向子宮移動(dòng)一段時(shí)間后,最終附植在子宮內(nèi)血管稠密的地方。附植的部位以及附植的方式在各種動(dòng)物中存在較大差異。豬的胚胎通常附植于子宮角子宮系膜的對(duì)側(cè),由于大量滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜靠接、粘連逐漸形成彌散型上皮絨毛膜胎盤(pán),微絨毛在子宮內(nèi)膜的陷窩中與母體子宮上皮交錯(cuò)伸入即完成胚胎的附植。這個(gè)時(shí)期的胚胎將面臨發(fā)育過(guò)程中的首個(gè)死亡高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)期[23]。這一時(shí)期的宮內(nèi)環(huán)境是胚胎死亡的關(guān)鍵因素,大多數(shù)有染色體疾病的胚胎在此階段死亡。據(jù)報(bào)道,豬在附植期間胚胎死亡率可以達(dá)到30%～40%[24]。存活的胚胎繼續(xù)發(fā)育形成器官,此階段母畜會(huì)分泌大量有利于胚胎器官形成的蛋白質(zhì)[25],此時(shí)胚胎開(kāi)始形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,競(jìng)爭(zhēng)力弱的胚胎因死亡而被淘汰,因而此階段也成為了胚胎第二個(gè)死亡高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)期。在妊娠的中后期,胚胎還會(huì)經(jīng)歷發(fā)育過(guò)程中的第三個(gè)死亡高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)期,由于胚胎快速發(fā)育,子宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布不均,導(dǎo)致一些胚胎死亡[25]。

2.2 外泌體miRNA對(duì)胚胎發(fā)育的影響

胚胎外泌體RNA中最豐富的是miRNA。miRNA約由22個(gè)核苷酸組成,在細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因表達(dá)調(diào)控作用[26-28]。外泌體miRNA主要通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)來(lái)增加胚胎粘附能力,促進(jìn)胚胎附植的作用。如Vilella等[5]通過(guò)微陣列分析顯示母體來(lái)源的外泌體miRNA可能起到附植前胚胎的轉(zhuǎn)錄修飾作用,其中在附植窗口期的子宮內(nèi)膜上皮表達(dá)水平上調(diào)最顯著的是由腺上皮主動(dòng)產(chǎn)生的miR-30d,其通過(guò)外泌體分泌到子宮內(nèi)膜腔內(nèi)并被胚胎內(nèi)化并上調(diào)Itgb3、Itga7和Cdh5等粘附分子的表達(dá)來(lái)增加胚胎粘附。Gurung等[29]發(fā)現(xiàn),與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌的其他成分相比較,外泌體對(duì)早期胚胎的發(fā)育和附植過(guò)程有更為顯著的作用,尤其是外泌體中的miRNA能有效提升細(xì)胞黏附等相關(guān)基因的表達(dá),從而讓子宮與胚胎的黏附更加穩(wěn)固,使胚胎附植率顯著增加。外泌體中的miRNA不僅能夠通過(guò)外泌體運(yùn)輸至胚胎中發(fā)揮作用[30],也能作為預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量和判斷胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的指標(biāo)[31]。Hu等[32]發(fā)現(xiàn),在豬中不同大小的卵泡所產(chǎn)生的外泌體中的miRNA的表達(dá)也存在差異,并確定了豬卵母細(xì)胞的成熟十分重要的miRNA:miR-125b、let-7d-5p、miR-200b、miR-26a和miR-92a。因此,這些外泌體miRNAs可作為分子生物標(biāo)志物來(lái)選擇高質(zhì)量的卵母細(xì)胞,同時(shí)也可猜測(cè)這些外泌體miRNAs有可能與胚胎的高質(zhì)量發(fā)育有一定的關(guān)系。此外少量miRNA與組織器官的形成和發(fā)育有關(guān)。Bidarimath等[30]收集并鑒定豬子宮內(nèi)膜、絨毛膜、尿囊膜、滋養(yǎng)外胚層和主動(dòng)脈壁細(xì)胞釋放的外泌體,發(fā)現(xiàn)外泌體中的miRNA與血管形成有關(guān)。據(jù)此推測(cè),外泌體miRNA能通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)影響卵泡發(fā)育、胚胎黏附能力和組織器官形成,進(jìn)而影響胚胎發(fā)育。與胚胎發(fā)育相關(guān)的外泌體miRNA見(jiàn)表1。

表1 與胚胎發(fā)育相關(guān)的外泌體miRNA

2.3 外泌體lncRNA對(duì)胚胎發(fā)育的影響

lncRNA是生物體中重要的生物活性物,由200多個(gè)核苷酸組成,不具有或只具有有限的蛋白質(zhì)編碼能力[38]。早期對(duì)lncRNA的研究主要集中在胚胎發(fā)育過(guò)程中的基因印記和劑量補(bǔ)償效應(yīng)方面[39-40]。研究表明,lncRNA還參與了許多其他的生理過(guò)程,例如細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[41-42],由此猜測(cè)外泌體中的lncRNA在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞分裂和分化也有一定的影響。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)有大量的lncRNAs在胎盤(pán)組織和外周組織存在差異表達(dá)。Wang等[43]和Kelemen等[44]也發(fā)現(xiàn),一些外泌體中富含特定的lncRNA,同時(shí)也存在其他很少見(jiàn)的lncRNA,這證明lncRNAs也可以選擇性地分泌到外泌體中。這些lncRNAs可以多維調(diào)節(jié)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的生理功能和參與血管生成的調(diào)控,從而影響胚胎的發(fā)育情況[45]。也有報(bào)道稱,外泌體衍生的lncRNA可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、遷移并誘導(dǎo)血管生成[46-47]。Gong等[48]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能通過(guò)分泌外泌體運(yùn)輸lncRNA H19,從而分別下調(diào)和上調(diào)胎盤(pán)組織中的miRNA let-7b和轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的表達(dá),使細(xì)胞的侵襲和遷移增多,同時(shí)也抑制滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。因此,子宮腔液外泌體中的lncRNAs是否能正常表達(dá)對(duì)胚胎發(fā)育以及滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能具有重要的影響。

2.4 外泌體蛋白對(duì)胚胎發(fā)育的影響

外泌體中的蛋白質(zhì)通常可分為胞內(nèi)蛋白和膜蛋白。外泌體中的不同蛋白質(zhì)執(zhí)行不同的功能[49-50]。已經(jīng)證實(shí),在胚胎附植期間,外泌體蛋白在母體和胚胎之間的信息傳遞中起作用[51]。外泌體蛋白中沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核相關(guān)蛋白[52],主要蛋白為CD81、CD63、CD9、溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMOP1)、凋亡轉(zhuǎn)移基因-2-相互作用蛋白X(Alix)和腫瘤易感基因101蛋白 (TSG101)[53-56]。外泌體中主要蛋白及功能見(jiàn)表2。

表2 外泌體中主要蛋白及其功能[57]

研究發(fā)現(xiàn),在泛素化修飾過(guò)程中,轉(zhuǎn)運(yùn)必需核內(nèi)體復(fù)合體 (Endosomal complex requned for transport,ESCRT) 通過(guò)介導(dǎo)并調(diào)節(jié)Fas配體進(jìn)入外泌體,這一過(guò)程對(duì)于保持外泌體蛋白水平和功能具有重要意義[58]。由于ESCRT機(jī)制在外泌體產(chǎn)生過(guò)程中的作用以及在外泌體中存在的一些ESCRT的亞單位,人們才能通過(guò)操縱ESCRT來(lái)調(diào)節(jié)外泌體的形成。同時(shí)外泌體中的蛋白質(zhì)與外泌體的形成和功能密切相關(guān)。例如,小的GTP結(jié)合蛋白家族 (Rab27a,Rab11b,ARF6) 參與外泌體的形成和釋放[59]。外泌體的蛋白不僅與外泌體自身有關(guān),還與胚胎發(fā)育過(guò)程中胚胎的孵化和附植有密切關(guān)系。Gurung等[29]在外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究中確定了外泌體中蛋白酶的存在,包括水解酶(酯水解酶(Ester hydrolase)、二甲氨基水解酶1(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1)、酯酶D(Esterase D)、博萊霉素水解酶(Bleomycin hydrolase)外切核苷三磷酸二磷酸水解酶2(Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2))和金屬蛋白酶(ADAM金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1型15(ADAM-TS15)),這些蛋白酶都可以促進(jìn)透明帶裂解和提高胚胎孵化,同時(shí)通過(guò)分析特異性差異蛋白譜還表明,外泌體具有與細(xì)胞遷移、粘附和ECM相關(guān)的獨(dú)特因子。此外,外泌體還可以在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[60]。據(jù)此推理,外泌體中絕大多數(shù)蛋白都是直接以信號(hào)分子的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中,從而調(diào)控胚胎的發(fā)育過(guò)程。綜合上述分析表明,外泌體所含的蛋白種類對(duì)母胚交流與胚胎發(fā)育具有深遠(yuǎn)的影響,而通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析其表達(dá)的差異及具體調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

3 小結(jié)與展望

綜上所述,外泌體中一些RNA、蛋白質(zhì)及信號(hào)分子主要通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)、胚胎-母體通訊、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、先天免疫反應(yīng)和胚胎附植等方式來(lái)發(fā)揮對(duì)胚胎發(fā)育的調(diào)控作用,但其調(diào)控機(jī)制目前尚未有系統(tǒng)的解析。因此,可在胚胎發(fā)育時(shí)期進(jìn)一步分析外泌體內(nèi)容物的功能,并通過(guò)有效的分析技術(shù)獲得表達(dá)譜,尤其是存在差異表達(dá)的內(nèi)容物,這對(duì)研究外泌體對(duì)胚胎的調(diào)控作用機(jī)制,尤其是在胚胎死亡高峰時(shí)期的調(diào)控機(jī)制具有重要研究意義。通過(guò)不斷發(fā)現(xiàn)外泌體對(duì)胚胎發(fā)育的作用機(jī)制,進(jìn)一步提高妊娠繁殖效率、促進(jìn)遺傳育種學(xué)科發(fā)展,從而更好地為畜牧行業(yè)服務(wù)。