DJ-1通過(guò)保護(hù)線粒體復(fù)合體I活性介導(dǎo)白藜蘆醇減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷*

任建民，劉慧茹，劉 松，李曉琪，何 康，湯 蕾，陳和平

（南昌大學(xué)藥學(xué)院江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006）

缺血性心臟疾病對(duì)全球的公共健康構(gòu)成重大威脅，臨床管理的最佳策略是通過(guò)溶栓方法或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流［1］。然而，當(dāng)阻塞的冠狀動(dòng)脈重新開(kāi)放時(shí)，缺血心肌會(huì)因血液供應(yīng)的突然增加而進(jìn)一步受損，這一過(guò)程被稱為心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［2］。心肌I/R 損傷機(jī)制涉及氧化應(yīng)激損傷、凋亡、線粒體功能障礙等因素［3］。其中氧化應(yīng)激是指正常氧化劑清除酶系統(tǒng)［如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽］和細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生之間的不平衡，會(huì)通過(guò)多種途徑直接引起心肌細(xì)胞的凋亡、自噬、炎癥等損傷［4］。已有研究表明，線粒體復(fù)合體I 是線粒體中ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，心肌I/R 期間ROS過(guò)量產(chǎn)生的主要原因與線粒體復(fù)合體I的氧化損傷有關(guān)［5-6］。DJ-1（又稱帕金森病蛋白7，Parkinson disease protein 7，PARK7）作為一種多功能保護(hù)性蛋白，具有線粒體功能調(diào)節(jié)和促進(jìn)細(xì)胞存活等功能［7-8］。此外，在正常生理狀態(tài)下，DJ-1 定位在細(xì)胞質(zhì)，而在應(yīng)激條件下，DJ-1 會(huì)易位至線粒體［9-10］。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，DJ-1與線粒體復(fù)合體I 的兩個(gè)亞基ND1 （NADH dehydrogenase subunit 1）和NDUFA4 ［NADH dehydrogenase（ubiquinone） 1 alpha subcomplex 4］結(jié)合，有助于復(fù)合體I 的穩(wěn)定性，而DJ-1敲除或突變導(dǎo)致線粒體復(fù)合體I 活性降低，增加對(duì)ROS 和線粒體復(fù)合物I 抑制劑的敏感性，DJ-1 表達(dá)的恢復(fù)緩解了這種現(xiàn)象［9，11］。上述研究表明，DJ-1蛋白在維持線粒體復(fù)合體I活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種天然多酚類化合物，富含于花生、葡萄和漿果等食物中，因其抗炎和抗氧化特性而聞名，同時(shí)具有緩解心肌I/R 損傷的保護(hù)作用［12-13］，還可緩解糖尿病誘導(dǎo)的大鼠心功能障礙［14］。已有研究表明，DJ-1 介導(dǎo)RES 預(yù)處理而減輕缺氧復(fù)氧后H9c2 細(xì)胞損傷［15］；DJ-1 通過(guò)維持線粒體復(fù)合體I的活性參與H9c2 細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)延遲保護(hù)作用［16］。但是DJ-1是否介導(dǎo)RES預(yù)處理對(duì)抗心肌I/R 所誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷機(jī)制尚不完全清楚。因此，本研究擬在整體水平上探討RES對(duì)心肌I/R 誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷及DJ-1蛋白的影響，并明確其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠均購(gòu)自南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重在220～240 g 之間，其中動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（贛）2023-0019。大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室中喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：空氣濕度保持在（50±2）%，溫度保持在（25±2） ℃，12 h 光/暗交替，并提供充足的食物及水。

2 主要試劑

RES 和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；線粒體復(fù)合體I 活性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒和SOD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DJ-1 和ND-1 抗體購(gòu)自Abcam；NDUFA4 抗體購(gòu)自Proteintech；GAPDH 抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；COX IV 抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich；羊抗兔IgG 多克隆抗體購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；組織線粒體分離試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MitoSOXTMRed 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Invitrogen；線粒體復(fù)合體I抑制劑IACS-010759購(gòu)自TargetMol；sh-DJ-1和陰性對(duì)照（negative control，NC）慢病毒構(gòu)建于上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠I/R 模型的構(gòu)建及分組 通過(guò)腹腔注射

10%水合氯醛來(lái)麻醉SD 大鼠。參照文獻(xiàn)［17］，麻醉完成后，將大鼠連接小動(dòng)物專用呼吸機(jī)，通過(guò)用6-0 絲線活結(jié)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支誘發(fā)心肌缺血。心肌缺血30 min 后，解開(kāi)活結(jié)，開(kāi)始2 h 的血流再灌注。大鼠隨機(jī)分為6 組：sham 組（開(kāi)胸后只穿線，不進(jìn)行結(jié)扎）、I/R 組、RES+I/R 組、NC+RES+I/R 組、sh-DJ-1+RES+I/R 組和IACS-010759+RES+I/R 組。心肌I/R 前1 周大鼠接受RES（20 mg/kg）灌胃，每日一次。其中對(duì)IACS-010759+RES+I/R 組大鼠 在I/R 術(shù)前2 d 給予IACS-010759（10 mg/kg）灌胃。此外，sham 和I/R 組大鼠均通過(guò)灌胃接受等體積的生理鹽水。

3.2 慢病毒心肌內(nèi)注射 麻醉完成后，將SD 大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，用止血鉗逐層鈍性分離左側(cè)胸大肌后，正確暴露左心室及心尖部位置，繞過(guò)血管于左心室的上部分取兩點(diǎn)、左心室下部分取兩點(diǎn)及心尖部取一點(diǎn)，用微量注射器分別注射滴度為5×108TU/L的sh-DJ-1 或NC 慢病毒50 μL，針尖于心肌水平面呈60°左右的角度進(jìn)針，進(jìn)針深度約2 mm，緩慢注射完畢后，用棉簽立即止血。術(shù)后1 周內(nèi)，經(jīng)心肌內(nèi)注射的大鼠均腹腔注射8×104U 的青霉素鈉防止感染。1周后，NC+RES+I/R 和sh-DJ-1+RES+I/R 組大鼠均接受RES（20 mg/kg）灌胃7 d，每日一次。

3.3 Western blot 收集心臟組織裂解物，或用組織線粒體分離試劑盒分離線粒體和細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE 分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中，用5%脫脂乳密封2 h。在4 ℃下Ⅰ抗孵育過(guò)夜，將Ⅱ抗在室溫下與膜孵育1 h，然后用ECL 發(fā)光液鑒定印跡，最后用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

3.4 免疫共沉淀法 蛋白提取完成后，將上清液離心分離，并進(jìn)行蛋白定量后備用。取500 μg 蛋白樣品，加入1 μL的DJ-1抗體，在4 ℃下緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜；加入20 μL 的蛋白A/G 瓊脂糖，在室溫下孵育2 h后，進(jìn)行3 次洗滌，離心去除上清液；加入1× SDS 蛋白上樣緩沖液；進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)DJ-1 與ND1和NDUFA4蛋白的相互作用。

3.5 心臟超聲檢查 造模結(jié)束后，使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)計(jì)算各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

3.6 心肌梗死面積測(cè)定 再灌注結(jié)束后，迅速取出大鼠心臟，將其切成大約2 mm 厚的薄片，然后將這些薄片放入2% TTC 染液中處理15 min；用多聚甲醛固定心肌組織，并使用相機(jī)對(duì)其進(jìn)行拍攝；用ImageJ軟件計(jì)算心肌梗死面積。

3.7 心臟組織中線粒體ROS 測(cè)定 心肌組織冰凍切片用MitoSOX 染液在37 ℃條件下避光孵育30 min后，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)激發(fā)和發(fā)射信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)分別為498 和522 nm。最后用ImageJ 軟件計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

3.8 心臟組織中線粒體復(fù)合體I活性測(cè)定 準(zhǔn)備好心肌組織純化分離提取的線粒體待測(cè)樣品，置于冰槽里，通過(guò)酶標(biāo)儀調(diào)整單波長(zhǎng)為340 nm（溫度為30 ℃），根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算出線粒體復(fù)合體I活性。

3.9 血清中LDH 活性、MDA含量和SOD 活性測(cè)定 大鼠造模后，通過(guò)心臟穿刺取血，血液在37 ℃條件下靜置20 min 后，在4 ℃、3000 r/min 離心20 min，收集血清備用。按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)定血清中LDH活性、SOD活性和MDA含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析。P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RES預(yù)處理對(duì)大鼠心功能的影響

心臟超聲結(jié)果顯示，與sham 組相比，I/R 組大鼠LVEF 和LVFS 均顯著下降（P＜0.01）；與I/R 組相比，RES+I/R 組 和NC+RES+I/R 組 大 鼠LVEF 和LVFS 均顯著升高（P＜0.01）；與RES+I/R 組相比，sh-DJ-1+RES+I/R組和IACS-010759+RES+I/R 組大鼠LVEF和LVFS 均顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），即心功能下降，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Comparison of rat cardiac function in each group. LVEF： left ventricular ejection fraction； LVFS： left ventricular fractional shortening. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖1 各組大鼠心功能的比較

2 RES預(yù)處理對(duì)大鼠心肌梗死面積的影響

TTC 結(jié)果顯示，與I/R 組相比，RES+I/R 組和NC+RES+I/R 組大鼠心肌梗死面積顯著減?。≒＜0.01）；與RES+I/R 組相比，sh-DJ-1+RES+I/R組和IACS-010759+RES+I/R 組大鼠心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖2。

Figure 2. Comparison of rat myocardial infarction size in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖2 各組大鼠心肌梗死面積的比較

3 RES 預(yù)處理對(duì)大鼠血清中氧化應(yīng)激水平及LDH的影響

與sham 組相比，I/R 組血清中LDH 活性和MDA含量均升高，SOD活性降低（P＜0.01）；與I/R組相比，RES+I/R 組和NC+RES+I/R 組血清中LDH 活性和MDA 含量均降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；與RES+I/R組相比，sh-DJ-1+RES+I/R 組 和IACS-010759+RES+I/R 組血清中LDH 活性和MDA 含量均升高，SOD活性降低（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖3。

Figure 3. Comparison of MDA content （A），LDH activity （B） and SOD activity （C） in the serum of rats in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖3 各組大鼠血清中MDA含量、LDH活性和SOD活性的比較

4 RES預(yù)處理對(duì)大鼠心肌組織線粒體復(fù)合體I和線粒體ROS的影響

與sham組相比，I/R組心肌組織中線粒體復(fù)合體I活性顯著降低，伴隨著線粒體ROS的釋放水平顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組相比，RES+I/R 組和NC+RES+I/R 組心肌組織中線粒體復(fù)合體I 活性顯著升高，伴隨著線粒體ROS 的釋放水平顯著下降（P＜0.01）；與RES+I/R組相比，sh-DJ-1+RES+I/R 組和IACS-010759+RES+I/R 組心臟組織線粒體復(fù)合體I活性均顯著下降，線粒體ROS 的釋放水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Figure 4. Comparison of mitochondrial complex I activity （A） and mitochondrial ROS level （B； MitoSOX staining，scale bar=20 μm） in the myocardial tissue of rats in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖4 各組大鼠心肌組織中的線粒體復(fù)合物I活性和線粒體ROS水平的比較

5 RES 預(yù)處理對(duì)大鼠心肌組織中DJ-1 表達(dá)及線粒體轉(zhuǎn)位的影響

接下來(lái)通過(guò)觀察敲減DJ-1表達(dá)對(duì)RES誘導(dǎo)的心肌保護(hù)作用的影響，敲減效率如圖5A 所示（P＜0.01）。Western blot 結(jié)果顯示，與sham 組相比，I/R組大鼠心肌組織中總DJ-1 蛋白水平顯著升高，且RES 預(yù)處理進(jìn)一步升高總DJ-1 蛋白水平（P＜0.01），見(jiàn)圖5B。

Figure 5. Comparison of DJ-1 expression in the myocardium of rats in each group. A： the knockdown efficiency of sh-DJ-1 in myocardial tissue assessed by Western blot； B： total protein level of DJ-1 detected by Western blot. Mean±SD. n=5. △△P＜0.01 vs sham+NC group； ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖5 各組大鼠心肌組織中DJ-1表達(dá)的比較

與I/R 組相比，RES 預(yù)處理顯著促進(jìn)DJ-1蛋白在線粒體的轉(zhuǎn)位，這通過(guò)DJ-1 在線粒體與胞漿的DJ-1蛋白水平比值升高所證實(shí)（P＜0.01），而sh-DJ-1+RES+I/R 組 和IACS-010759+RES+I/R 組DJ-1 蛋 白在線粒體的轉(zhuǎn)位均受到抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

Figure 6. Comparison of the mitochondrial translocation of DJ-1 in the myocardial tissue of rats in each group. COX IV and GAPDH were used as mitochondrial and cytoplasmic loading controls，respectively. The ratio of mitochondrial DJ-1 protein level to cytoplasmic one was used to assess the translocation of DJ-1 into mitochondria. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs I/R group； ▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖6 各組大鼠心肌組織中DJ-1在線粒體轉(zhuǎn)位的比較

6 RES 預(yù)處理對(duì)大鼠心肌組織中DJ-1 與線粒體復(fù)合體I核心亞基ND-1和NDUFA4相互作用的影響

免疫共沉淀結(jié)果顯示，與sham 組相比，I/R 組心肌組織中DJ-1 與ND-1/NDUFA4 的相互作用增強(qiáng)，且RES 預(yù)處理進(jìn)一步增強(qiáng)這種相互作用；與RES+I/R組相比，sh-DJ-1+RES+I/R 組和IACS-010759+RES+I/R 組DJ-1 與ND/NDUFA4 的相互作用均顯著減弱，見(jiàn)圖7。

Figure 7. Evaluation of the interaction between DJ-1 and ND-1/NDUFA4 in the myocardial tissue of rats in each group.The representative images from five independent experiments were obtained by co-immunoprecipitation assay.圖7 各組大鼠心肌組織中DJ-1與ND-1/NDUFA4的相互作用

討 論

近年來(lái)，再灌注療法是治療缺血性心臟病最常見(jiàn)和最有效的方法，然而，它也是臨床治療中心肌I/R 損傷的主要原因［18］。心肌I/R 損傷的主要原因已被廣泛研究，包括鈣超載、炎癥、氧化應(yīng)激等［19］。其中氧化應(yīng)激在心肌I/R 損傷扮演著越來(lái)越重要的角色，心肌I/R 期間ROS的過(guò)度生成對(duì)心肌細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害，從而加劇心功能障礙［20］。已有研究表明，線粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致I/R 損傷的特殊驅(qū)動(dòng)因素，包括誘導(dǎo)線粒體功能障礙和對(duì)其他分子的氧化損傷［21］。值得注意的是，在心肌I/R 期間，線粒體復(fù)合體I生成過(guò)度的線粒體ROS，從而致使ROS的過(guò)度釋放［22］。這正如預(yù)期，本研究中，心肌I/R 后，線粒體復(fù)合體I 活性下降，氧化應(yīng)激水平增加，表現(xiàn)為血清中MDA 含量增多、SOD 活性下降以及線粒體ROS 的大量釋放。許多研究已經(jīng)表明，RES 作為一種天然多酚化合物，具有多種藥理活性，如抗炎和抗氧化作用等，更重要的是，RES 預(yù)處理可視為干預(yù)心肌I/R損傷的一種重要措施，并且治療效果顯著［23-24］。本研究表明，給予RES 后，上述I/R 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷現(xiàn)象全部被逆轉(zhuǎn)，同時(shí)可改善心功能，縮小心肌梗死面積，有效證實(shí)RES可減輕大鼠I/R 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，但是其深入機(jī)制尚不明確。

DJ-1 在幾乎所有生物中均有表達(dá)且高度保守，具有伴侶蛋白、氧化還原傳感和線粒體穩(wěn)態(tài)活性［25］。敲減DJ-1表達(dá)，可明顯增加心力衰竭的易損性，從而加劇心功能障礙［26］。有報(bào)道稱，RES 通過(guò)增強(qiáng)DJ-1的表達(dá)進(jìn)而減輕腦I/R 損傷［27］。值得注意的是，之前的研究已經(jīng)表明，DJ-1作為一種內(nèi)源性保護(hù)蛋白，在H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后顯著上調(diào)，并參與缺氧預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的延遲心臟保護(hù)作用［28-29］。在這項(xiàng)研究中，RES 顯著促進(jìn)DJ-1 在心肌I/R 后的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)DJ-1 在線粒體的亞定位。值得注意的是，據(jù)報(bào)道DJ-1在維持線粒體復(fù)合體I活性和減輕氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮重要作用［30-31］。此外，DJ-1 蛋白可以直接與ND1 和NDUFA4 結(jié)合，有助于復(fù)合體I的組裝和功能維持［32］。基于以上報(bào)道，可以假設(shè)RES的抗氧化應(yīng)激作用可能是通過(guò)DJ-1保持復(fù)合體I 活性并隨后防止線粒體ROS 產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)的。本研究發(fā)現(xiàn)，RES增加心肌I/R 后DJ-1在線粒體的易位，之后與ND1/NDUFA4的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)一步支持DJ-1 在RES 在保護(hù)線粒體復(fù)合體I 活性的潛在作用。隨后，與RES+I/R 組相比，心肌內(nèi)敲減DJ-1表達(dá)會(huì)使線粒體復(fù)合體I活性下降，伴隨著氧化應(yīng)激水平增加，更重要的是，心肌梗死面積擴(kuò)大，加劇心功能障礙。接下來(lái)，為了探討線粒體復(fù)合體I在DJ-1介導(dǎo)RES 預(yù)處理的保護(hù)作用，對(duì)大鼠線粒體復(fù)合體I活性進(jìn)行抑制，結(jié)果顯示，與RES+I/R 組相比，IACS-010759+RES+I/R 組線粒體復(fù)合體I 活性急劇下降，削弱了RES減輕心肌I/R 所致氧化應(yīng)激損傷的作用，同時(shí)加劇心功能障礙。這些數(shù)據(jù)表明RES 通過(guò)DJ-1保護(hù)線粒體復(fù)合體I 的活性，減弱I/R 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而具有心臟保護(hù)作用。

綜上所述，RES 通過(guò)上調(diào)DJ-1的表達(dá)，促進(jìn)DJ-1在線粒體的亞定位后，與線粒體復(fù)合體I的兩個(gè)亞基ND-1/NDUFA4 的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而保護(hù)線粒體復(fù)合體I 的活性，產(chǎn)生對(duì)抗I/R 導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷的心肌保護(hù)作用。