基于外泌體的多細胞信號網(wǎng)絡(luò)和藥物載體在調(diào)控腦缺血再灌注損傷中的研究進展*

周 宇，馬 勇，李 斌，柴爾青△

（1蘭州大學第一臨床醫(yī)學院 ，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省人民醫(yī)院腦血管病中心，甘肅省腦血管病重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

腦卒中是全球第二大死因，在多種疾病中卒中的致死率與致殘率總和占據(jù)第三位，其中主要以缺血性腦卒中為主，占全部卒中事件的62.4%，而在我國腦卒中是第一大致死性疾病和致殘性疾病，同時患病率和死亡率在繼續(xù)增加［1-2］。近年來，我國各級醫(yī)院的卒中管理機制在不斷完善，溶栓、顱內(nèi)動脈取栓術(shù)、頸動脈支架植入術(shù)等再灌注策略更多地應用于腦卒中患者，大幅度地改善了患者的住院期間生存率、降低了年齡標準化死亡率，然而接受再灌注治療患者的遠期預后和生存質(zhì)量仍較差，造成上述結(jié)果的原因除了社會老齡化導致的患者平均年齡升高外，由再灌注策略引發(fā)的腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）也發(fā)揮著重要作用［3-4］。

再灌注策略是當前治療缺血性腦卒中的首選方案，然而也具有一定的風險，甚至在一些情況下會給患者帶來更大的損傷［5-6］。其損傷機制主要與再灌注后的NADPH 氧化酶系統(tǒng)活躍、活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生、黏附因子表達增加以及大量細胞炎性因子釋放有關(guān)［7-8］。再灌注條件下，神經(jīng)元細胞中ROS的富集會導致能量代謝細胞器——線粒體的穩(wěn)態(tài)（線粒體分裂和融合）被破壞，線粒體維持神經(jīng)元鈣調(diào)節(jié)和細胞膜電位受損，因而導致神經(jīng)功能障礙［9］。此外，炎性因子的大量釋放能夠使外周的白細胞活化并遷移至腦組織，也導致進一步的腦損傷、血腦屏障破壞和血管源性水腫［10］。雖然當前在全球范圍內(nèi)對于CIRI 的研究日益重視，然而臨床中仍然缺乏有效的抗CIRI 策略，因此仍需從更多的研究角度對CIRI 的發(fā)病機制和治療方案進行探索［11-12］。

外泌體（exosome）是一種直徑在50～150 納米間的細胞外囊泡，其來源于內(nèi)體，通過神經(jīng)酰胺和/或轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分類復合體依賴性途徑衍生，經(jīng)過多囊泡體融合后，幾乎所有類型的細胞以胞吐的方式將外泌體分泌至各種體液中（血液、腦脊液、唾液等）［13-15］。隨后外泌體通過與細胞膜融合、內(nèi)吞、配體-受體相互作用等多種途徑被受體細胞內(nèi)化，將其包含的“貨物”（蛋白、核酸、代謝物等）暴露于受體細胞胞質(zhì)從而發(fā)揮細胞間信息傳遞因子的作用［16-17］（外泌體示意圖見圖1）。近年來的研究表明，外泌體作為同一組織不同細胞甚至不同組織細胞之間的信息傳遞橋梁參與了多種器官損傷的調(diào)節(jié)過程［18-20］。同時根據(jù)已有研究，來源于不同細胞的外泌體在具有共同外泌體特征的同時也存在著一些差異特征（表1）。而外泌體能夠穿過血腦屏障的特性，也使得其有望成為了改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要藥物載體［21-22］。本文將圍繞多細胞基于外泌體對CIRI 的調(diào)控以及外泌體作為藥物載體治療CIRI的研究進展進行綜述，以圖為改善CIRI 的深入研究提供一定的借鑒。

Figure 1. Schematic representation of exosome release. The multivesicular bodies in the donor cells fuse with the cell membrane to release exosomes through exocytosis，and then，the exosomes are captured by the recipient cells via endocytosis and release signal proteins and RNA in the cytoplasm.圖1 外泌體釋放示意圖

表1 來源于不同細胞外泌體的特點Table 1. Characteristics of exosomes derived from different cells

1 多細胞的外泌體信號對CIRI的調(diào)控

1.1 內(nèi)皮細胞的外泌體信號對CIRI 調(diào)控 內(nèi)皮細胞作為血管的最內(nèi)層細胞群體不僅是血管功能的調(diào)控單元之一直接參與循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，同時作為形成血腦屏障的主要細胞也首先對缺血再灌注影響做出響應，因此內(nèi)皮細胞衍生的外泌體也參與了CIRI 的調(diào)控［28-30］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類位于基因組非編碼區(qū)、長度約為22 個核苷酸的單鏈RNA 分子，其能夠被外泌體攜帶并進入細胞，通過與目標蛋白的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合從而抑制其表達，發(fā)揮調(diào)控多種生物過程的作用［31］。而內(nèi)皮細胞通過分泌含有miRNA 的外泌體參與了對CIRI 的調(diào)控。Gao等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復氧條件下腦血管內(nèi)皮細胞的外泌體中miR-126-3p 的表達量顯著降低，并且接受正常條件培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞外泌體（EC-Exo）顱內(nèi)注射的CIRI模型大鼠運動神經(jīng)功能受損程度被顯著改善，進一步的離體中通過糖氧剝奪/復氧（OGD/R）的PC12 神經(jīng)細胞模型模擬缺血再灌注狀態(tài)并給予EC-Exo 干預，結(jié)果顯示內(nèi)皮細胞可通過EC-Exo 將miR-126-3p 遞送給神經(jīng)細胞，能夠降低OGD/R 條件下神經(jīng)細胞的凋亡率、改善突觸可塑性（提高突觸長度、促進可塑性蛋白表達等），從而發(fā)揮改善神經(jīng)細胞的再灌注損傷。此外，Yue 等［33］的研究表明，miR-1290 在人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）衍生的外泌體（HUVEC-Exo）中顯著富集，而通過對OGD/R 誘導的神經(jīng)元細胞使用miR-1290 模擬物預處理顯著抑制神經(jīng)元細胞的凋亡和損傷，值得注意的是在OGD/R條件下神經(jīng)元細胞自身也通過高表達內(nèi)吞途徑相關(guān)分子Caveolin-1 從而促進了神經(jīng)元細胞對外泌體的內(nèi)化過程，這體現(xiàn)了損傷狀態(tài)下神經(jīng)元細胞也通過自我調(diào)節(jié)促進對外界損傷調(diào)控信號因子的應答機制。同時腦血管內(nèi)皮細胞也能夠通過釋放外泌體對再灌注誘導的內(nèi)皮細胞自身損傷產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。Mohamud Yusuf等［34］通過抑制劑（阿米替林）抑制、小干擾RNA沉默等方法抑制人腦微血管內(nèi)皮細胞（hCMEC）中酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）的表達，發(fā)現(xiàn)能夠顯著改善腦中動脈栓塞術(shù)（MCAO）后再灌注誘導的血腦屏障損傷、組織炎性浸潤和神經(jīng)元死亡，進一步的研究表明ASM 的抑制能夠促進hCMEC以外泌體的形式釋放因再灌注誘使累積的細胞內(nèi)囊泡，而這些外泌體富含與吞噬作用、蛋白質(zhì)輸出等功能相關(guān)蛋白從而促進hCMEC 的管形成、遷移、和血管內(nèi)皮細胞生長因子分泌能力，從而發(fā)揮改善腦血管和腦組織的缺血再灌注損傷。因此，缺血再灌注狀態(tài)下應當重視缺血區(qū)域血管內(nèi)皮功能的改善，從而促進CIRI的恢復。

1.2 神經(jīng)膠質(zhì)細胞的外泌體信號對CIRI 調(diào)控 神經(jīng)膠質(zhì)細胞包括星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，三者均參與了缺血性腦病的諸多病理生理過程［12］。當前對于膠質(zhì)細胞的外泌體信號調(diào)控CIRI 的研究主要集中于小膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的天然免疫細胞，其可因多種疾病狀態(tài)的誘導由靜息狀態(tài)向激活狀態(tài)改變，且激活的小膠質(zhì)細胞又因不同的特征和功能被分類為M1 樣（促炎性和神經(jīng)毒性）和M2 樣（抑炎性）兩種表型［35］。二者分別通過多種信號途徑參與了神經(jīng)炎性損傷的發(fā)生和修復過程，因此兩種表型之間的平衡也決定了神經(jīng)功能損傷的方向［36-37］。Li 等［37］使用白介素4（IL4）成功誘導獲得M2小膠質(zhì)細胞，隨后提取其外泌體（M2-Exo）并通過體內(nèi)注射干預MCAO 術(shù)后再灌注的小鼠，結(jié)果顯示與PBS 和未處理的小膠質(zhì)細胞來源外泌體（M0-Exo）相比，體內(nèi)注射M2-Exo 能夠減少MCAO 后再灌注導致的腦萎縮、改善感覺運動和認知功能、并促進小鼠腦白質(zhì)在再灌注28 d 后的結(jié)構(gòu)重塑和功能修復，進一步轉(zhuǎn)錄組學和熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱉2-Exo 攜帶的miR-23a-5p 通過直接靶向少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子3 從而促進少突膠質(zhì)細胞的生成，因而發(fā)揮改善再灌注誘導的腦萎縮并促進白質(zhì)重塑［。同時M2 小膠質(zhì)細胞來源的外泌體信號能夠保護神經(jīng)元細胞免于再灌注損傷誘導的細胞凋亡。研究顯示M2-Exo 能夠抑制OGD/R 誘導的神經(jīng)元細胞凋亡增加和神經(jīng)源性位點Notch 同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）的高表達，而在使用miR-137 的抑制劑后這種效應顯著減弱，進一步的熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱊otch1 是miR-137 的直接靶標，既往研究已經(jīng)表明Notch 信號通路在多種生理系統(tǒng)的缺血損傷機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此可知M2小膠質(zhì)細胞能夠通過釋放攜帶miR-137的M2-Exo直接抑制神經(jīng)元細胞Notch1 的表達從而發(fā)揮改善神經(jīng)元細胞的再灌注損傷作用［38-39］。此外Song 等［40］的研究表明，當M2 小膠質(zhì)細胞的miR-124 被慢病毒敲低時，M2-Exo 中的miR-124 水平也顯著降低，此時M2-Exo 改善大鼠在MCAO 再灌注下的腦梗死面積和神經(jīng)元細胞在OGD/R 條件下細胞凋亡的能力被顯著抑制，然而當加入泛素特異性肽酶14（ubiquitin-specific protease 14，USP14）的抑制劑時，大鼠腦梗死面積和神經(jīng)元細胞的損傷再次被減弱，隨后的熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C明USP14是miR-124 的直接靶點，因此M2-Exo 中的miR-124 通過直接靶向神經(jīng)元細胞的USP14改善了神經(jīng)元細胞的再灌注損傷。由上述可見，小膠質(zhì)細胞通過外泌體對腦再灌注損傷的調(diào)控具有多信號因子、多靶點、多效應的特點，這值得進一步的研究，以構(gòu)建一個復合的外泌體干預再灌注損傷策略。此外既往研究表明：與神經(jīng)元相比星狀膠質(zhì)細胞具有更強的抗缺血能力，星形膠質(zhì)細胞的存活具有恢復神經(jīng)元完整性和促進功能改善的潛力（特別是在缺血半暗帶）［41］。有研究報道，側(cè)腦室接受星狀膠質(zhì)細胞外泌體注射的MCAO/R 模型大鼠的腦梗死面積顯著減小，且隨著干預時間的推移，與正常星狀膠質(zhì)細胞外泌體干預相比，接受缺氧預處理的星狀膠質(zhì)細胞外泌體注射的大鼠表現(xiàn)出更顯著的大腦結(jié)構(gòu)和神經(jīng)功能恢復、更快地清除的腦細胞水腫和壞死，并修復軸突損傷［42］。可見，星形膠質(zhì)細胞對缺血狀態(tài)的應激信號能夠發(fā)揮保護神經(jīng)元的作用。

1.3 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的外泌體信號對CIRI 的調(diào)控 MSCs 是多種不同的多功能干細胞的統(tǒng)稱，其能夠從包括脂肪、臍帶和骨髓等在內(nèi)的多種組織中分離出，已有的研究表明MSCs 除了能夠向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等分化外還通過直接相互作用和旁分泌（直接分泌、細胞外大囊泡、外泌體等）等形式參與了免疫調(diào)節(jié)和再生等生理過程，而當前MSCs的外泌體信號對器官損傷的調(diào)控成為了重要的再灌注研究靶點［43-45］。在Li等［46］的研究中，研究人員通過體內(nèi)注射骨髓MSCs來源的外泌體（BMSC-Exo）能夠顯著緩解MCAO 術(shù)后再灌注誘導大鼠的神經(jīng)元細胞凋亡、神經(jīng)功能損傷、以及組織炎性因子的富集，進一步研究發(fā)現(xiàn)BMSCExo將攜帶的miR-150-5p輸送至神經(jīng)元細胞中，miR-150-5p 能夠與Toll 樣受體5 基因（TLR5）的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合，抑制缺血再灌注條件下由TLR5蛋白上調(diào)誘導的神經(jīng)元細胞凋亡和炎性因子釋放從而發(fā)揮改善再灌注損傷的作用。不僅是骨髓MSCs，脂肪MSCs（ASC）來源的外泌體（ASC-Exo）也能夠減輕OGD/R 誘導的神經(jīng)元細胞損傷。ASC-Exo 中攜帶的miR-22-3p 能夠靶向神經(jīng)元細胞的賴氨酸特異性脫甲基酶6B（KDM6B）基因，KDM6B 蛋白與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的啟動子區(qū)域結(jié)合并耗竭組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化修飾（H3K27me3）進而激活BMP2/BMF（Bcl2 蛋白修飾因子）信號通路發(fā)揮促細胞凋亡的作用，因此ASC-Exo 通過miR-22-3p 抑制了神經(jīng)元細胞的KDM6B/BMP2/BMF 信號通路發(fā)揮改善神經(jīng)元再灌注損傷的作用［47-48］。此外，MSCs 來源外泌體可能會通過引起多細胞的連鎖反應發(fā)揮抗再灌注損傷的作用。Hu 等［49］發(fā)現(xiàn)，人臍帶來源的MSCs（UMSC）的外泌體（UMSC-Exo）能夠顯著改善OGD/R誘導的小膠質(zhì)細胞活力降低，抑制細胞焦亡的表達，并上調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達，表明UMSC-Exo能夠抑制小膠質(zhì)細胞因OGD/R誘導的的焦亡并促進線粒體自噬過程，此外OGD/R 條件下小膠質(zhì)細胞的無細胞培養(yǎng)基（OGD/R-CM）能夠誘導SH-SY5Y 神經(jīng)細胞的凋亡和細胞損傷，而UMSC-Exo 干預小膠質(zhì)細胞后，這種神經(jīng)損傷能力被抑制，進一步的機制研究表明UMSC-Exo 通過促進小膠質(zhì)細胞叉頭框蛋白O3依賴性線粒體自噬過程從而抑制其在再灌注條件下的細胞焦亡，繼而保護因小膠質(zhì)細胞再灌注損傷誘導的神經(jīng)細胞損傷。

上述研究表明，多細胞間的信息網(wǎng)絡(luò)參與了再灌注條件下的微環(huán)境病理和修復過程（圖2）。

Figure 2. Regulation of exosome signals in cerebral ischaemia reperfusion injury. A： endothelial cells secrete exosomes containing miR-126-3p and miR-1290 to protect neurons and secrete exosomes containing angiogenic factors to promote microvascular formation； B： astrocytes secrete exosomes to protect neurons； C： resting microglia are activated into M2 microglia and secrete exosomes containing miR-137 and miR-124 to protect neurons and secrete exosomes containing miR-23-5p to protect oligodendrocytes； D： bone mesenchymal stem cells secrete exosomes containing miR-150-5p to protect neurons； E： adipose-derived mesenchymal stem cells secrete exosomes containing miR-22-3p to protect neurons； F： umbilical cord mesenchymal stem cells inhibit neuronal pyroptosis and promote mitochondrial autophagy to protect neurons through exosomes.圖2 外泌體信號在腦缺血再灌注損傷中的調(diào)控

2 作為藥物載體的外泌體在CIRI中的應用

2.1 外泌體作為基因藥物載體在CIRI 中的應用基因治療作為一種治療手段已經(jīng)被研究多年，其除了具有高特異性的特點外，并且一些基因藥物因基因的持續(xù)表達而具有更久的治療效果［50］。此外通過施加小干擾RNA 靶向沉默組織細胞中的某些蛋白的基因表達也是基因治療的一種方法［51］。外泌體因其具有生物兼容性、無毒、可透過血腦屏障等特點成為了基因藥物的有效載體。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）是I/R 損傷的病理生理學關(guān)鍵因素之一，病理狀態(tài)下?lián)p傷分子與RAGE 的結(jié)合激活RAGE 介導的信號通路能夠引發(fā)一系列的嚴重炎癥反應導致組織損傷［52］。RAGE 拮抗肽（RAGE-binding peptide，RBP）能夠抑制RAGE 的表達減輕I/R 損傷，Kim 等［58］使用重組DNA 技術(shù)將RBP 的cDNA 插入外泌體膜蛋白Lamp 2b 表達質(zhì)粒的5'末端，獲得了外部連接有RBP的外泌體（RBP-Exo），并用其裝載抗miR-181a 的寡核苷酸（AMO181a，能夠與miR-181a 結(jié)合抑制其功能，裝載劑量與外泌體重量比為1∶5），將該藥物載體外泌體（RBP-Exo-AMO181a）通過鼻內(nèi)給藥干預MACO再灌注大鼠模型，結(jié)果表明RBP-Exo-AMO181a的干預能夠減少腦梗死面積并抑制神經(jīng)細胞的凋亡，機制研究顯示RBP-Exo-AMO181a 中的AMO181a 通過與mi-181a 結(jié)合減弱了mi-181a 對凋亡抑制蛋白Bcl-2 的敲低能力，從而改善了再灌注下腦細胞凋亡誘導的腦損傷。Zhao等［54］通過使用慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞獲得了富含miR-223-3p的外泌體（Exo-miR-223-3p）并用于干預MCAO/R 模型大鼠，Exo-miR-223-3p 顯著減少了再灌注損傷大鼠的腦梗死面積、改善了神經(jīng)功能損傷程度，細胞研究揭示其機制：miR-223-3p 能夠靶向半胱氨酰白三烯受體2（CysLT2R），抑制由半胱氨酰白三烯（CysLTs）誘導的小膠質(zhì)細胞向炎性表型M1 轉(zhuǎn)化并促進小膠質(zhì)細胞向抗炎表型M2轉(zhuǎn)化，因此抑制了大腦微環(huán)境的炎癥反應進展進而改善再灌注損傷。上述研究均證明了基因載體外泌體作為抗CIRI治療的潛在價值。

2.2 外泌體作為天然藥物載體在CIRI 中的應用天然化合物是全球范圍內(nèi)難治性疾病治療的研究熱點，目前已經(jīng)有天然化合物作為缺血性血管疾病的治療藥物被應用于臨床［55-56］。已有研究通過體外培養(yǎng)基中加入高劑量（3 μg/mL）的姜黃素（curcumin，Cur）連續(xù)撫育巨噬細胞成功獲得加載Cur 的巨噬細胞源外泌體（Cur-Exo），由于外泌體的包裹顯著降低了Cur 的血清降解效率并提高了其在腦組織中的積累，用于體內(nèi)干預后發(fā)現(xiàn)該外泌體繼承了巨噬細胞趨炎癥特性能夠在再灌注條件下的腦組織損傷區(qū)域中富集（與神經(jīng)炎癥有關(guān)），藥理研究結(jié)果顯示在MACO/R 大鼠模型中Cur-Exo 能夠抑制ROS 誘導的神經(jīng)元細胞線粒體損傷、降低神經(jīng)細胞的凋亡率、保護血腦屏障的完整性、降低腦梗死面積，從而改善再灌注誘導的神經(jīng)功能損傷［57］。表明通過構(gòu)建攜帶天然化合物的外泌體作為藥物能夠提高天然化合物的穩(wěn)定性和溶解性，此外通過修飾外泌體的膜蛋白還可實現(xiàn)針對特定器官的靶向用藥［58］。Guo 等［59］梯度分離法獲得大鼠血清外泌體并與槲皮素（quercetin，Que）在超聲震蕩下賦予構(gòu)建了加載Que 的外泌體（Que-Exo），此過程使Que 的溶解度從游離狀態(tài)的30.15 mg/L 提升至86 mg/L，并碳二亞胺法將生長相關(guān)蛋白43（growth-associated protein 43，GAP43）的單克隆抗體（mAb GAP43）偶聯(lián)在Que-Exo 表面獲得表面修飾的載藥外泌體（Que/mAb GAP43-Exo），GAP43是一種神經(jīng)元特異性蛋白且在缺血再灌注損傷條件下過表達，因此偶聯(lián)mAb GAP43 的外泌體能夠靶向作用于受損的神經(jīng)元，進一步的體內(nèi)和體外實驗顯示Que/mAb GAP43-Exo 能夠通過上調(diào)神經(jīng)元核因子E2 相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1 信號通路從而抑制再灌注條件下ROS誘導的神經(jīng)元細胞損傷。這些研究為構(gòu)建具有精準靶向特性且能夠穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)環(huán)境的天然藥物載體外泌體奠定了基礎(chǔ)。

3 總結(jié)

腦缺血再灌注損傷是當前溶栓或介入治療廣泛應用于缺血性腦疾病背景下的另一個臨床難題。其主要涉及了神經(jīng)炎癥、氧化應激、細胞自噬等多種病理過程誘導的神經(jīng)元損傷，同時也受到了來自腦血管內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、間充質(zhì)細胞等多種細胞的調(diào)控，其中由多細胞的外泌體構(gòu)建的信號網(wǎng)絡(luò)在其中發(fā)揮著重要作用，因此對于通過調(diào)控外泌體信號改善CIRI 成為了CIRI 治療的關(guān)鍵研究焦點。此外，因其獨特的生物學特性和功能使得外泌體也成為了促進藥物靶向作用于損傷器官的有效載體，且在研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了一定的進展。然而，基于外泌體信號以及藥物載體的抗CIRI研究仍然處于實驗階段，同時藥物載體外泌體的制備工序復雜并且負載藥物占比有限從而限制了其在CIRI領(lǐng)域的廣泛研究，因此仍需進一步完善外泌體和藥物載體外泌體的獲取工序、探索并開發(fā)出能夠應用于臨床的外泌體信號調(diào)控藥物或藥物載體外泌體，以達到改善和治療CIRI的目的。