飛龍掌血通過(guò)調(diào)控大鼠M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化減輕腦缺血再灌注損傷*

高建紅，王 剛，楊 丹，趙方毓，何一多，陳顯兵

（風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000）

缺血性腦卒中是一種急性腦血管疾病，其特征是大腦局部血流突然中斷?，F(xiàn)階段，治療缺血性腦卒中的方法主要包括溶栓和血栓清除，但治療窗口較狹窄，腦血液循環(huán)的恢復(fù)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI），加重神經(jīng)功能的缺損［1-3］。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia）是腦內(nèi)巨噬細(xì)胞類(lèi)型之一，是免疫系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)，維持腦神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。機(jī)體損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生；而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抑炎因子，減輕炎癥反應(yīng)。通過(guò)抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，可以減輕炎癥［4-5］。因此調(diào)控M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化平衡對(duì)于減輕CIRI具有重要意義。

飛龍掌血（Toddaliaasiatica，TA）又名三百棒，為蕓香科植物的根，是一種天然藥物，也是具有地區(qū)的民族特色藥?，F(xiàn)代藥理表明，TA 具有重要的拮抗炎癥作用［6-7］。但是，TA 能否通過(guò)調(diào)控M1/M2型極化來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，尚未得到系統(tǒng)的研究。因此，本研究通過(guò)制備大鼠CIRI模型，探究TA對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞中M1/M2 表型極化的影響，深入探討Toll 樣受體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，以期為T(mén)A 減輕CIRI 的作用機(jī)理提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80 只2 月齡（體重約200～250 g）的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，保持相對(duì)濕度在55%、溫度在24 ℃，由遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。

2 主要試劑與儀器

主要試劑：尼氏染色液、SDS-PAGE 快速配制試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物技術(shù)有限公司；Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體、核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB） p65 抗體、p-NF-κB p65 抗體、NF-κB 抑制因子（NF-κB inhibitory factor，IκB）抗體、p-IκB 抗體、離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1）抗體、精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）抗體和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗體購(gòu)自上海Abmart 醫(yī)藥科技有限公司；IL-4 和IL-10 抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；β-actin 抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：Tanon-5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司、Western blot 電泳裝置購(gòu)自Bio-Rad。

3 主要方法

3.1 藥物配制 TA 購(gòu)自湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院中藥房，經(jīng)中藥實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)家鑒定為蕓香科植物TA的干燥根莖。取飛龍掌血適量，打粉，70%乙醇超聲提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液并真空干燥，得TA 醇提物，稱(chēng)重計(jì)算收得率為15%，使用時(shí)配制成所需濃度。據(jù)記載TA 生藥成人內(nèi)服的劑量為：9～15 g/d，取劑量12 g/d。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體體表面積比例進(jìn)行計(jì)量換算，最終換算為T(mén)A 1.08 g·kg-1·d-1。鹽酸多奈哌齊片的成人用量為5 mg/d，換算得大鼠劑量為0.45 mg·kg-1·d-1。

3.2 動(dòng)物分組及造模 基于課題組前期研究［8］造模組選用線(xiàn)栓法行大腦中動(dòng)脈栓塞術(shù)制備CIRI大鼠模型。具體操作：手術(shù)前所有大鼠禁食不禁水，麻醉，頸部備皮、消毒，逐層分離左側(cè)皮膚、皮下組織、頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎翼腭動(dòng)脈。將魚(yú)線(xiàn)栓（長(zhǎng)為5 cm、直徑為0.4 mm）插入頸總動(dòng)脈，后經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈前端。從頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈Y 型交叉口計(jì)算，保證插入18.5 mm。2 h后將線(xiàn)栓拔出，線(xiàn)栓頭部到頸內(nèi)動(dòng)脈為宜。行為學(xué)評(píng)分1～3 分表明大鼠造模成功，隨機(jī)分為模型（model）組、飛龍掌血（TA）組和鹽酸多奈哌齊（donepezil，DON）組，并增設(shè)假手術(shù)（sham）組（僅分離血管），每組16 只。再灌注24 h 后，各組予以對(duì)應(yīng)藥物灌胃，分為兩個(gè)時(shí)間段取材：（1）給藥7 d，每組6 只大鼠，3只用于病理學(xué)觀(guān)察，3只用于免疫組化檢測(cè)；（2）給藥14 d，每組10 只大鼠，3 只用于病理學(xué)觀(guān)察，3 只用于免疫組化檢測(cè)，4只用于蛋白含量測(cè)定。

3.3 動(dòng)物一般情況觀(guān)察 術(shù)后觀(guān)察各組大鼠的基本情況。

3.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 造模后，對(duì)1、3、7 和14 d的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。

3.5 HE、Nissl 和TUNEL 染色 分別給藥7 和14 d后，各組隨機(jī)取3 只大鼠。麻醉，依次進(jìn)行生理鹽水灌注、多聚甲醛灌注，取材后腦組織進(jìn)行多聚甲醛24 h固定、脫水、石蠟包埋、4 μm 切片，分別進(jìn)行HE、Nissl和TUNEL染色。

3.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Iba1、Arg1 和TLR4 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況 分別給藥7、14 d 后，各組隨機(jī)取3只大鼠。麻醉，依次進(jìn)行生理鹽水灌注、多聚甲醛灌注，取材后腦組織進(jìn)行多聚甲醛24 h 固定、脫水、包埋、4 μm 切片，烤片過(guò)夜，二甲苯、無(wú)水乙醇梯度脫蠟、水化。檸檬酸抗原修復(fù)20 min，PBS 清洗3 min、3次。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，滴加試劑1 和試劑2，滴加I抗Iba1抗體、Arg1抗體、TLR4抗體（比例均為1∶300）靜置1.5 h，PBS 清洗3 min、3 次，然后滴加試劑3 靜置15 min，PBS 清洗3 min 3 次，滴加試劑4 靜置20 min，滴加DAB 顯色液避光靜置3 min，純水洗滌后蘇木精復(fù)染1 min，純水洗滌1 min，醋酸15 s，純水洗滌1 min，碳酸鋰15 s，純水洗滌1 min，無(wú)水乙醇2 min，二甲苯透明化處理2 min，中性樹(shù)膠固定。

3.7 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白含量的表達(dá) 給藥14 d 后，每組取4 只大鼠。麻醉，取海馬置于-80 ℃冰箱備用；稱(chēng)取20 mg組織放入EP管中，加入200 μL裂解混合液，裂解液與PMSF 比例100∶1，依次進(jìn)行剪碎、研磨、超聲、裂解、離心、取上清液、配平每組蛋白，再依次配制凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后加入抗體TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB、IL-6、Arg1（比例均為1∶1 000），IL-4、IL-10、Iba1（比例均為1∶750），NF-κB p65（比例為1∶7 500），孵育Ⅰ抗過(guò)夜，孵育Ⅱ抗1 h，顯影并計(jì)算灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)性分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TA對(duì)CIRI大鼠一般情況的影響

術(shù)后大鼠左側(cè)眼瞼呈半張開(kāi)狀態(tài)，眼瞼瘀血結(jié)痂，嚴(yán)重者左眼不睜，并伴有不同程度的肢體運(yùn)動(dòng)障礙，活動(dòng)量減少，部分大鼠尾尖出現(xiàn)瘀血青紫甚至枯萎。

2 TA對(duì)CIRI大鼠神經(jīng)功能評(píng)分影響

CIRI 術(shù)后1 d、3 d、 7 d 及14 d 的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均較sham 組升高（P＜0.01）；與model組相比，給藥后3 d、7 d、14 d TA 組及DON 組評(píng)分顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Figure 1. Comparison of neurological function scores of the rats in each group. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vs sham group； ##P＜0.01 vs model group.圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

3 TA對(duì)CIRI大鼠形態(tài)學(xué)影響

分別給藥7、14 d，與sham 組大鼠相比，model 組海馬CA1 區(qū)和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，神經(jīng)元和尼氏小體排列較松散紊亂，尼氏小體減少甚至溶解，細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的核固縮、空泡化現(xiàn)象；與model組相比，TA 組及DON 組大鼠神經(jīng)元增多，細(xì)胞排列的相對(duì)整齊緊密，空泡化及核固縮現(xiàn)象減輕，尼氏小體較多，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2. Pathological changes of the brain tissue of rats in each group at 7 d after CIRI （HE and Nissl staining，scale bar=100 μm）.CA1： hippocampal CA1 region； CTX： cortex.圖2 各組大鼠術(shù)后7 d腦組織病理變化

Figure 3. Pathological changes of the brain tissue of rats in each group at 14 d after CIRI （HE and Nissl staining，scale bar=100 μm）. CA1： hippocampal CA1 region； CTX： cortex.圖3 各組大鼠術(shù)后14 d腦組織病理變化

4 TA對(duì)CIRI大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

給藥14 d，與sham 組大鼠相比，model 組的神經(jīng)元凋亡增多（P＜0.01）；與model 組相比，TA 組及DON組大鼠神經(jīng)元凋亡降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4. Neuronal apoptosis in rats of each group （TUNEL staining，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs model group.圖4 各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況

5 TA 對(duì)CIRI大鼠Iba1、Arg1和TLR4陽(yáng)性表達(dá)的影響

5.1 TA 對(duì)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 和M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Arg1 的影響 給藥7、14 d，與sham組相比，model組大鼠Iba1陽(yáng)性細(xì)胞在皮質(zhì)區(qū)表達(dá)較為顯著，胞體明顯增大，突起回縮，呈現(xiàn)出阿米巴樣；Arg1 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量增加。與model 組相比，TA組及DON 組大鼠Iba1 表達(dá)減少，胞體較小，突起較長(zhǎng)；Arg1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)有所增加，見(jiàn)圖5、6。

Figure 5. Localization and expression of Iba1 protein in the brain tissue of rats at 7 and 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CA3： hippocampal CA3 region； CTX： cortex.圖5 各組大鼠7、14 d腦組織Iba1蛋白定位表達(dá)

Figure 6. Localization and expression of Arg1 protein in the brain tissue of rats at 7 and 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CTX： cortex.圖6 各組大鼠腦組織Arg1蛋白定位表達(dá)

5.2 TA 對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB 通路中TLR4 的陽(yáng)性表達(dá)的影響 給藥14 d，與sham 組相比，model 組大鼠TLR4 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加；與model 組相比，TA 組及DON組大鼠TLR4表達(dá)有所降低，見(jiàn)圖7。

Figure 7. Localization and expression of TLR4 protein in the brain tissue of rats at 14 d after CIRI in each group （scale bar=100 μm）. CTX： cortex.圖7 各組大鼠14 d腦組織TLR4蛋白定位表達(dá)

6 Western blot法測(cè)定結(jié)果

6.1 TA 對(duì)CIRI 大鼠Iba1、Arg1、IL-6、IL-4 和IL-10蛋白表達(dá)的影響 與sham 組相比，model 組大鼠海馬Iba1、IL-6 和Arg1 表達(dá)量升高（P＜0.01），IL-4 和IL-10 表達(dá)量降低（P＜0.05）；與model 組相比，TA 組和DON 組Iba1 和IL-6 表達(dá)顯著降低（P＜0.01），Arg1、IL-4和IL-10蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖8。

Figure 8. Protein expression in hippocampal tissue of rats in each group. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖8 各組大鼠海馬組織相關(guān)蛋白的表達(dá)

6.2 TA 對(duì)CIRI 大鼠TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與sham 組相比，model 組大鼠海馬的TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65和p-IκB表達(dá)量增多（P＜0.05）；與model 組相比，TA 組和DON組各指標(biāo)表達(dá)量降低（P＜0.05），見(jiàn)圖9。

Figure 9. The levels of TLR4/MyD88/NF-κB pathway-related proteins in the hippocampal tissue of rats in each group. Mean±SD. n=4. *P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs model group.圖9 各組大鼠海馬組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

討 論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，通常處于靜態(tài)。小膠質(zhì)細(xì)胞具有三個(gè)基本功能，參與并不斷監(jiān)測(cè)內(nèi)環(huán)境變化，促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)，以及必要的防御功能，從而為神經(jīng)提供保護(hù)作用［9］。當(dāng)有神經(jīng)元損傷或其他損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞將被激活，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)成為一把雙刃劍，具有鮮明表型變化的神經(jīng)損害型M1 和神經(jīng)保護(hù)型M2。M1 型將損害周?chē)慕】瞪窠?jīng)組織，并且通過(guò)死亡或正在死亡的神經(jīng)元反過(guò)來(lái)加劇M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，引起神經(jīng)元的漸進(jìn)性喪失［10-11］。而M2型可以減少局部組織的損傷，并促進(jìn)損傷區(qū)域的修復(fù)和再生。因此，促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞到M2型的極化形式，已然成為一種新的治療策略。研究表明調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化對(duì)于減輕腦缺血后神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和功能恢復(fù)至關(guān)重要［12］。本研究中CIRI大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，神經(jīng)功能評(píng)分降低，病理?yè)p傷嚴(yán)重，TA可有效緩解這一狀態(tài)，說(shuō)明TA 有明確的保護(hù)腦神經(jīng)功能作用，具有抗凋亡功能。

為明確TA 對(duì)M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響，我們進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。機(jī)體損傷后，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，胞體變大，出現(xiàn)不規(guī)則突起，呈阿米巴狀，并且釋放TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子，參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致病情加重。Iba1 作為小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可判斷小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況［13-15］。小膠質(zhì)細(xì)胞的另一種狀態(tài)M2 型，以Arg1 為標(biāo)志物，產(chǎn)生IL-4 和IL-10 等抑炎因子，可促進(jìn)組織的修復(fù)及再生，具有神經(jīng)保護(hù)作用［16-17］。本研究中，CIRI 大鼠M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，炎癥因子IL-6 表達(dá)升高，抑炎因子IL-4 和IL-10 表達(dá)降低；TA降低了炎癥因子分泌，促進(jìn)了抑炎因子釋放，同時(shí)，抑制了M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，激活了M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。這提示TA對(duì)CIRI炎癥損傷具有一定的治療作用，可能是通過(guò)抑制促炎M1型，促進(jìn)抗炎M2型極化，從而發(fā)揮抗炎作用。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Toll樣受體是一類(lèi)模式識(shí)別受體的重要成員，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Toll樣受體表達(dá)最豐富的細(xì)胞類(lèi)型，其中TLR4具有特異性識(shí)別病原體分子的作用。TLR4 的激活可以通過(guò)MyD88 依賴(lài)和非依賴(lài)途徑，磷酸化并降解IκB 蛋白，繼而激活NF-κB 通路，增加炎癥因子的表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15，18-19］。有研究表明，降低小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4 和MyD88 的表達(dá)可以有效抑制NF-κB 的激活，減輕炎癥反應(yīng)，并減少神經(jīng)功能損傷［18］。本研究指標(biāo)中，CIRI 大鼠TLR4、MyD88、NFκB p65、p-NF-κB p65 等蛋白含量顯著升高，TA 顯著降低了各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)。這提示TA 可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，TA 對(duì)腦缺血再灌注大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，減少神經(jīng)元的凋亡，降低炎癥因子IL-6 的分泌，增強(qiáng)抑炎因子IL-4、IL-10 釋放，其機(jī)制可能與調(diào)控M1/M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞、抑制TLR4/MyD88/NF-κB介導(dǎo)的炎性通路有關(guān)。