內(nèi)源性大麻素2-AG對海人藻酸誘導(dǎo)損傷的大鼠尾狀核神經(jīng)元A型鉀通道電流的調(diào)制作用*

朱時鈺，陸永利，李自成，楊紅衛(wèi)△

［1三峽大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)），湖北 宜昌 443002；3三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)系，湖北 宜昌 443002；4宜昌市三峽中心人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 宜昌 443002］

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)由內(nèi)源性大麻素、與之結(jié)合的大麻素受體、負(fù)責(zé)內(nèi)源性大麻素合成和降解的酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)體組成，廣泛參與人體多種生理或病理生理過程的調(diào)節(jié)［1］。其中大麻素受體主要包括CB1 受體和CB2 受體：CB1 受體主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)；CB2 受體主要分布在外周免疫系統(tǒng)［1］。2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol，2-AG）作為人體內(nèi)含量最豐富的內(nèi)源性大麻素，是CB1 和CB2 受體的完全激動劑［1-2］。越來越多的證據(jù)證明2-AG 可以調(diào)節(jié)相關(guān)離子通道（如鉀、鈣等離子通道）的電學(xué)活性，在神經(jīng)興奮毒性損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而這種保護(hù)機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未被完全闡明［3］。

A 型鉀通道是一種電壓依賴性鉀通道，又稱瞬時外向型鉀通道，能產(chǎn)生快速激活和失活的瞬時外向鉀電流（A-type potassium current，IA），參與動作電位的起始并且是復(fù)極化早期外向電流的主要成分，顯著調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性和動作電位形態(tài)及復(fù)極化［4］。抑制A 型鉀通道會導(dǎo)致去極化加速和興奮性增加；A 型鉀通道功能障礙可能導(dǎo)致神經(jīng)損傷和一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)性疼痛、帕金森病和癲癇等［5-7］。但其在神經(jīng)元興奮性毒性損傷或相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制目前還未完全闡明。如前所述，內(nèi)源性大麻素2-AG 可以通過調(diào)節(jié)包括A 型鉀通道在內(nèi)的鉀離子通道參與各種機(jī)能調(diào)節(jié)，但其相關(guān)機(jī)制目前知之甚少。

尾狀核（caudate nucleus，CN）是基底神經(jīng)節(jié)的一部分，也是大鼠顱內(nèi)最大的核團(tuán)，與大腦的其他部分具有豐富而多樣的解剖連接，在認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動等復(fù)雜任務(wù)的設(shè)計(jì)和執(zhí)行中發(fā)揮重要作用；其功能障礙見于多種疾病中，包括亨廷頓病、帕金森病和各種形式的癡呆等［8］。

海人藻酸（kainic acid，KA）是從海人藻中提取的興奮性神經(jīng)毒性氨基酸類似物，通過激活α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）/KA 受體，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性毒性和興奮性氨基酸毒性作用，誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病、癲癇持續(xù)狀態(tài)、學(xué)習(xí)和記憶障礙等，被廣泛用于建立神經(jīng)毒性和癲癇的動物或細(xì)胞模型［9］。因此本研究采用膜片鉗技術(shù)，觀察KA 的興奮性神經(jīng)毒性對大鼠原代培養(yǎng)CN 神經(jīng)元形態(tài)和膜上A 型鉀通道電學(xué)特性的影響；觀察2-AG 能否抑制KA 的神經(jīng)興奮性毒性作用并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為內(nèi)源性大麻素治療相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供有效的病理生理學(xué)和藥理學(xué)依據(jù)，同時為進(jìn)一步探究CN 在神經(jīng)變性疾病中的診療作用及機(jī)制提供新證據(jù)和思路。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

新生（出生后24 h 內(nèi)）SD 大鼠，體重5～6 g，雌雄不限，SPF級，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供［許可證號為SCXK（鄂）2017-0061］。所有實(shí)驗(yàn)規(guī)程均遵循三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會制定的標(biāo)準(zhǔn)。

2 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)液、Neurobasal A 神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清、B27（神經(jīng)營養(yǎng)因子）和0.25%胰蛋白酶溶液購自Gibco；KA、URB602［一種單酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MAGL）選擇性拮抗劑］、左旋多聚賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、阿糖胞苷、EGTA、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、腺苷5'-三磷酸二鈉鹽（adenosine 5'-triphosphate disodium salt，Na2-ATP）、HEPES、氫氧化銫和氟化銫購自Sigma-Aldrich；2-AG和SR141716（SR1；選擇性CB1受體拮抗劑）購自Cayman Chemical；天冬氨酸鉀、四乙基氯化銨（tetraethyl ammonium chloride，TEA-Cl）、氯化鈉、氯化鎂、氯化銫、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化鉻、氯化鈣和D-葡萄糖均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠CN 神經(jīng)元原代培養(yǎng) 大鼠CN 神經(jīng)元提取按照先前的描述進(jìn)行［10］：（1）取新生（24 h內(nèi)）SD大鼠數(shù)只，于75%乙醇中浸泡消毒3～5 s，斷頭取腦（盡量保持腦組織完整性，勿破壞皮層），取出腦組織置于盛有DMEM 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；（2）在超凈臺中用眼科鑷鈍性分離皮層下尾狀核，置于另一盛DMEM培養(yǎng)液的皿中，用刀片將尾狀核切成小碎塊（以上步驟均在冰上操作）；（3）將尾狀核組織置于含0.25%胰酶和0.02% EDTA 的消化液中（37 ℃）中，用不同管徑的巴斯德滴管依次輕柔吹打碎塊，使液體渾濁無組織塊，于37 ℃中消化15 min，第7 min搖勻一次；（4）消化結(jié)束后用與EDTA 等體積的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，混合均勻后，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，加神經(jīng)元原代細(xì)胞培養(yǎng)液，緩慢輕柔地吹打細(xì)胞，使其呈細(xì)胞懸浮液；（5）將細(xì)胞懸浮液用200 目濾網(wǎng)過濾，得到濾過的細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞密度為（0.5～1）×109L-1；（6）將濾后細(xì)胞懸浮液種植于提前用多聚賴氨酸鋪板的塑料培養(yǎng)皿（35 mm）中，前后左右晃動培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布；（7）將含細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2、濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

細(xì)胞換液：提取的大鼠CN 神經(jīng)元培養(yǎng)1 d（24 h內(nèi)）、3 d 和5 d 用神經(jīng)元培養(yǎng)液全量換液。第5 天添加阿糖胞苷（終濃度為2.5 mg/L），目的是為了抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長。加阿糖胞苷24 h后用神經(jīng)元培養(yǎng)液全量換液。

實(shí)驗(yàn)中使用的CN 神經(jīng)元的培養(yǎng)時間為7～12 d。實(shí)驗(yàn)分組為vehicle （VEH）組、KA（10 mg/L）組、2-AG （10 μmol/L）+KA 組、SR1 （10 μmol/L）+2-AG+KA組、URB602 （10 μmol/L）+KA 組和SR1+URB602+KA組。所有試劑按上述分組加入培養(yǎng)液中處理12 h，其中2-AG/URB602+KA 組和SR1+2-AG/URB602+KA組中的KA 在添加2-AG、SR1 和（或）URB602 30 min后加入，SR1、2-AG和（或）URB602同時添加。

3.2 電生理記錄 在室溫（22～25 ℃）下進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞外液沖洗培養(yǎng)液2～3 次，加入氧飽和的細(xì)胞外液，在倒置顯微鏡（IX-71，Olympus）尋找狀態(tài)良好、膜干凈和折光度強(qiáng)的CN 神經(jīng)元。玻璃電極毛胚（直徑1.5 mm；南京六合泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠），由P-97 電極拉制儀（Sutter Instrument）多步拉制成玻璃微電極，入水電阻為5～8 MΩ。實(shí)驗(yàn)過程中保持電位的鉗制及測試脈沖程序的設(shè)定、信號采集與儲存均由EPC10 膜片鉗放大器和計(jì)算機(jī)運(yùn)行PATCHMASTER軟件（HEKA Elektronik）完成。

IA細(xì)胞外液：TEA-Cl 70.0 mmol/L，氯化膽堿70.0 mmol/L，D-葡萄糖10.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，CaCl22.0 mmol/L，MgCl2·6H2O 1.0 mmol/L，CdCl20.1 mmol/L。NaOH 調(diào)pH 至7.4，4 ℃保存。TEA-Cl 阻斷延遲整流性鉀離子通道，氯化膽堿阻斷鈉離子通道，CdCl2阻斷電壓依賴性鈣離子通道。

IA電極內(nèi)液：K-ASP 118.0 mmol/L，KCl 20.0 mmol/L，EGTA 10.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，Tris-ATP 5.0 mmol/L，MgCl2·6H2O 2.0 mmol/L，CaCl21.0 mmol/L。KOH調(diào)pH至7.3，-20 ℃保存。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

為消除細(xì)胞大小的影響，電流值以電流密度（pA/pF）表示。數(shù)據(jù)和圖片由軟件SigmaPlot 11.2（Jandel Scientific）和CorelDRAW 9.0 分析處理獲得。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩組間比較采用Student-Newman-Keuls （SNK）-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KA 對培養(yǎng)CN 神經(jīng)元IA密度的影響及2-AG 和URB602對該作用的調(diào)制

在全細(xì)胞膜片鉗記錄中，我們首先觀察KA 對CN 神經(jīng)元上A 型鉀通道電流的影響。建立全細(xì)胞膜片鉗記錄模式，給予鉗制電壓-70 mV，施予1 000 ms、階躍10 mV、-70～+80 mV 的方波脈沖刺激，頻率0.2 Hz，在峰值處測量IA的幅值，記錄各組IA變化。這些向外電流的最大值被指定為Imax。圖1A 是根據(jù)上述脈沖刺激記錄得到的電流圖（來源于各組具有相似膜電容的CN 神經(jīng)元）。圖1B、C 為各種處理因素下IA的電流-電壓關(guān)系圖。（1）原代培養(yǎng)的大鼠CN神經(jīng)元經(jīng)KA （10 mg/L）處理12 h 后，觀察到從去極化脈沖-20 mV開始，KA誘導(dǎo)的IA密度明顯降低。與VEH 組［（162.01±3.32） pA/pF （n=16）］相比，KA 組（n=14）IA密度峰值顯著降低到（34.32±2.07） pA/pF（P＜0.01），見圖1D。這表明KA 顯著減弱CN 神經(jīng)元上的IA。（2）我們前期實(shí)驗(yàn)表明，單獨(dú)使用2-AG 對原代培養(yǎng)大鼠CN 神經(jīng)元IA無影響［10］。本實(shí)驗(yàn)中直接應(yīng)用2-AG 預(yù)處理后（2-AG+KA 組），IA密度峰值回到（113.91±3.29） pA/pF （n=18；P＜0.01vsKA 組），見圖1D。這表明2-AG 可有效拮抗KA 對CN 神經(jīng)元上IA的抑制效應(yīng)。（3）如前所述，2-AG 是CB1 受體的完全激動劑，且CB1 受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CB1 受體是否參與了2-AG的上述作用。SR1 是CB1 受體拮抗劑，我們前期實(shí)驗(yàn)表明單獨(dú)給予SR1 對原代培養(yǎng)大鼠CN 神經(jīng)元IA無影響［10］。本實(shí)驗(yàn)中給予SR1+2-AG預(yù)處理后（SR1+2-AG+KA 組），IA密度峰值降至（43.54±2.67）pA/pF （n=12；P＜0.01vs2-AG+KA 組），見圖1D。這表明2-AG 拮抗KA 對IA的抑制效應(yīng)是通過CB1 受體發(fā)揮作用的。（4）MAGL是一種參與2-AG生物失活的絲氨酸水解酶，能夠水解大腦中約85%的2-AG；抑制MAGL 會提高細(xì)胞內(nèi)2-AG 水平［11］。因此我們使用MAGL 抑制劑URB602 間接上調(diào)2-AG 水平。之前本實(shí)驗(yàn)室證實(shí)單獨(dú)使用URB602對原代培養(yǎng)大鼠CN神經(jīng)元IA無影響［10］。在本實(shí)驗(yàn)中使用URB602 預(yù)處理后（URB602+KA 組），IA密度峰值回到（103.56±3.59） pA/pF （n=17；P＜0.01vsKA 組）；給予SR1+URB602 預(yù)處理（SR1+URB602+KA 組），IA密度峰值降至（43.54±2.67） pA/pF （n=12；P＜0.01vsURB602+KA 組），見圖1E。這表明，與直接使用2-AG 預(yù)處理相似，URB602 拮抗KA 對IA的抑制效應(yīng)，該效應(yīng)是通過CB1受體介導(dǎo)的。

Figure 1. Effects of pretreatment with 2-arachidonoylglycerol （2-AG） or URB602 on the density of A-type potassium channel current（IA） in caudate nucleus （CN） neurons exposed to kainic acid （KA）. A： representative IA traces in CN neurons with similar capacitance in vehicle （VEH），KA，2-AG+KA，SR141716 （SR1）+2-AG+KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA groups； B： current-voltage relationships of IA in CN neurons treated with VEH，KA，2-AG+KA and SR1+2-AG+KA； C：current-voltage relationships of IA in CN neurons treated with VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA； D： maximum density of IA at +80 mV in CN neurons treated with VEH，KA，2-AG+KA and SR1+2-AG+KA； E： maximum density of IA at +80 mV in CN neurons treated with VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA. Mean±SEM. **P＜0.01 vs VEH group； ##P＜0.01 vs KA group； △△P＜0.01 vs 2-AG+KA or URB602+KA group.圖1 2-花生四烯酰甘油或URB602預(yù)處理通過CB1受體對海人藻酸損傷尾狀核神經(jīng)元A型鉀通道電流密度的影響

2 KA 對培養(yǎng)CN 神經(jīng)元A 型鉀通道激活動力學(xué)的影響及2-AG、SR1和URB602對該作用的調(diào)節(jié)

根據(jù)圖1 得到的各組電流數(shù)據(jù)，通過Boltzmann方程I/Imax=1/｛1+exp［-（V-V1/2）/k］｝擬合得到A型鉀通道激活曲線及各組半激活電壓（V1/2）和斜率（k），見圖2。（1）VEH、KA、2-AG+KA 和SR1+2-AG+KA 組A 型鉀通道激活曲線的V1/2值分別為（32.45±2.34） mV（n=16）、（29.10±2.06） mV （n=14）、（31.27±1.98）mV （n=18）和（28.50±1.65） mV （n=12），各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）；以上4組激活曲線的k值分別 為19.04±1.28 （n=16）、20.19±1.61 （n=14）、20.93±1.89（n=18）和22.84±1.97 （n=12），各組間差異亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2C）。這表明KA 或（和）2-AG 不影響A 型鉀通道激活曲線的V1/2值和k值。（2）使用URB602 在KA 處理的CN 神經(jīng)元中觀察到與直接給與2-AG 有相似效果：VEH、KA、URB602+KA 和SR1+URB602+KA 組A 型鉀通道激活曲線的V1/2值和k值也均無顯著差異（圖2E、F），提示使用URB602 內(nèi)源性上調(diào)2-AG，也不影響A 型鉀通道激活曲線的V1/2值和k值。以上結(jié)果表明，無論是直接應(yīng)用2-AG 還是通過URB602 提高細(xì)胞內(nèi)2-AG 水平，2-AG的增加都不影響A型鉀通道的激活過程。

Figure 2. Effects of pretreatment with 2-arachidonoylglycerol （2-AG） or URB602 on activation kinetics of A-type potassium channels in caudate nucleus （CN） neurons exposed to kainic acid （KA）. A： steady-state activation curves for A-type potassium channel current（IA） in CN neurons treated with vehicle（VEH），KA，2-AG+KA and SR141716（SR1）+2-AG+KA； B：the semi-activated voltage（V1/2） of IA in CN neurons treated with VEH，KA，2-AG+KA and SR1+2-AG+KA was obtained from the activation curves； C： the slope （k） of IA activation curves in VEH，KA，2-AG+KA and SR1+2-AG+KA groups；D： steady-state activation curves for IA in VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA groups； E： the V1/2 value of IA in CN neurons treated with VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA was obtained from the activation curves； F：the k value of IA activation curves in VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA groups. Mean±SEM.圖2 2-花生四烯酰甘油或URB602預(yù)處理通過CB1受體對海人藻酸損傷尾核神經(jīng)元A型鉀通道激活動力學(xué)的影響

3 KA 對培養(yǎng)CN 神經(jīng)元A 型鉀通道失活動力學(xué)的影響及2-AG、SR1和URB602對該作用的調(diào)節(jié)

A 型鉀通道穩(wěn)態(tài)失活曲線由雙脈沖刺激法獲得：鉗制電壓-70 mV，條件脈沖為持續(xù)時間160 ms、階躍10 mV、-120～+50 mV 的方波脈沖刺激；每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至+50 mV、160 ms 的測試脈沖。根據(jù)上述雙脈沖刺激記錄各組CN 神經(jīng)元A 型鉀通道失活的電流曲線，圖3A 顯示各組具有相似膜電容CN 神經(jīng)元的電壓-電流原始圖。各組電流數(shù)據(jù)通過Boltzmann 方程I/Imax=1/｛1+exp［（V-V1/2）/k］｝擬合得到A 型鉀通道失活曲線圖（圖3B、E）及各組半失活電壓（V1/2）和k值（圖3C、D、F、G）。（1）VEH 組、KA 組、KA+2-AG 組和KA+2-AG+SR1 組的V1/2值分別為（-37.03±3.94） mV（n=16）、（-41.75±4.85） mV（n=14）、（-38.81±3.24） mV （n=18）和（-40.82±3.68） mV （n=12），4 組之間沒有顯著差異（圖3C）。但KA 使失活曲線的k值由11.97±0.95 （n=16）增加到20.81±1.24 （n=14），差異顯著（P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)表明KA 不影響V1/2值，但增大了失活曲線的k值，提示KA 使A 型鉀通道失活的電壓敏感性降低［12］。（2）使用2-AG 預(yù)處理之后，失活曲線的k值降低至14.20±1.02 （n=18；P＜0.05vsKA 組）；SR1 和2-AG預(yù)處理則將k值提高到17.86±1.37 （n=12；P＜0.05vs2-AG+KA 組），見圖3D。這提示2-AG 可通過CB1受體抑制KA 對A 型鉀通道失活的影響。（3）與2-AG相似，應(yīng)用URB602 不影響A 型鉀通道失活V1/2的均值（圖3F），但使失活曲線的k值回降到13.55±0.86（n=17；P＜0.05vsKA 組）；而SR1+URB602 使k值又回升 到16.34±1.42 （n=14；P＜0.05vsURB602+KA組），見圖3G。這提示通過URB602 間接增加內(nèi)源性2-AG 水平，也可通過CB1 受體抑制KA 對A 型鉀通道失活的影響。

4 KA 對培養(yǎng)CN 神經(jīng)元A 型鉀通道恢復(fù)動力學(xué)的影響及2-AG、SR1和URB602對該作用的調(diào)節(jié)

A 型鉀通道恢復(fù)曲線的記錄：鉗制電位-70 mV，施加+50 mV、80 ms的條件脈沖使A 型鉀通道完全失活；分別間隔2、4、8、16、32、64、128、256 和512 ms 后再施予第2 次緊接著給予+50 mV、80 ms 的方波刺激（測試脈沖），得到各組A 型鉀通道失活后恢復(fù)的電流圖（圖4A）。以測試脈沖電流與峰值電流的比值對時間間隔作圖，通過單指數(shù)函數(shù)I/Imax=1-exp（-t/τ）擬合，其中τ是通道恢復(fù)的時間常數(shù)，繪制電流恢復(fù)曲線（圖4B、D）。（1）KA 使τ值從VEH 組的（29.13±2.60） ms（n=14）顯著提高到（49.83±4.18） ms（n=11；P＜0.01）；在2-AG 存 在的情況下，τ值回到（30.90±2.89） ms （n=12；P＜0.01vsKA組）；此外，當(dāng)2-AG 和SR1 存在時，τ值顯著增加至（48.75±3.67）ms （n=10；P＜0.01vs2-AG+KA 組），見圖4C。這表明KA 延長了A 型鉀通道失活后恢復(fù)過程；2-AG 則通過CB1 受體阻止KA 對A 型鉀通道恢復(fù)過程的影響。（2）與2-AG 類似，當(dāng)URB602 預(yù)處理后，KA 對IA恢復(fù)曲時間的影響顯著減弱，URB602+KA 組τ值回降到（32.87±3.01） ms （n=13；P＜0.01vsKA 組）；當(dāng)KA、URB602 和SR1 聯(lián)合處理CN 神經(jīng)元時，URB602的作用被抑制：SR1+URB602+KA 組τ值上升到（46.28±3.86） ms （n=11；P＜0.01vsURB602+KA組），見圖4E。這表明，通過抑制2-AG的水解增加內(nèi)源性2-AG 水平也通過CB1 受體顯著阻止了KA 誘導(dǎo)的A型鉀通道τ值的增加。

Figure 4. Effects of pretreatment with 2-arachidonoylglycerol （2-AG） or URB602 on recovery kinetics of A-type potassium channels in caudate nucleus （CN） neurons exposed to kainic acid （KA）. A： representative A-type potassium channel current（IA）traces in CN neurons under different treatments for the recording recovery kinetics； B： steady-state recovery curves for IA in CN neurons treated with vehicle （VEH），KA，2-AG+KA and SR141716 （SR1）+2-AG+KA； C： the recovery time constant（τ） of IA in CN neurons treated with VEH，KA，2-AG+KA and SR1+2-AG+KA was obtained from the recovery curves； D：steady-state recovery curves for IA in VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA groups； E： the τ value of IA in CN neurons treated with VEH，KA，URB602+KA and SR1+URB602+KA was obtained from the recovery curves. Mean±SEM.**P＜0.01 vs VEH group； ##P＜0.01 vs KA group； △△P＜0.01 vs 2-AG+KA or URB602+KA group.圖4 2-花生四烯酰甘油或URB602預(yù)處理通過CB1受體對海人藻酸損傷尾核神經(jīng)元A型鉀通道失活后恢復(fù)動力學(xué)的影響

討 論

興奮性毒性是很多神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病的重要病理生理機(jī)制，用于解釋這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病背后的共同的病理基礎(chǔ)，如阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、中風(fēng)和癲癇等［［13］。

作為鉀通道超家族中的主要成員，A 型鉀通道參與了神經(jīng)細(xì)胞膜電位穩(wěn)定的維持。當(dāng)A 型鉀通道被啟動，細(xì)胞膜再次去極化而興奮時，可以延遲去極化達(dá)閾電位的時間［4，13］；通道產(chǎn)生的IA是參與神經(jīng)細(xì)胞動作電位復(fù)極化早期的主要外向電流，影響動作電位的閾值、形態(tài)和時程，是神經(jīng)元興奮性的重要決定因素［14］。A 型鉀通道功能異常或缺失則會表現(xiàn)出神經(jīng)元過度興奮性，導(dǎo)致神經(jīng)損傷和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾?。豪鏘A的降低使CA1 神經(jīng)元的興奮性增加，導(dǎo)致顳葉癲癇［15］；而IA的上調(diào)可抑制癲癇小鼠模型中的神經(jīng)元過度興奮，并降低了癲癇發(fā)作頻率［16］。Shinoda 等［17］發(fā)現(xiàn)，第5 腰椎脊神經(jīng)結(jié)扎所致神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠α神經(jīng)纖維IA密度顯著降低，表現(xiàn)出更高的去極化靜息膜電位和興奮性；神經(jīng)營養(yǎng)因子治療則逆轉(zhuǎn)了IA的減弱，發(fā)揮出鎮(zhèn)痛作用。因此我們推測KA 所致CN 神經(jīng)元興奮性損傷中可能有IA的改變，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)觀察到KA 預(yù)處理可以明顯降低CN 神經(jīng)元IA峰值，這與上述IA和神經(jīng)損傷相關(guān)疾病研究的實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示CN 神經(jīng)元中IA的抑制與KA 所致的CN 神經(jīng)元興奮性毒性之間存在聯(lián)系。進(jìn)一步研究表明，KA 對CN 神經(jīng)元A 型鉀通道激活動力學(xué)特性和失活V1/2沒有影響，但使失活曲線k值增大，失活的電壓敏感性降低［12］；KA 能顯著增大CN 神經(jīng)元A 型鉀通道失活后的τ值，意味著A型鉀通道在失活后需要更長的時間才能再次打開［12］。這些結(jié)果提示，KA 通過影響A型鉀通道的失活和失活后的恢復(fù)致使CN 神經(jīng)元IA減弱。鑒于IA的變化與神經(jīng)元興奮性密切相關(guān)，IA的減弱可增加細(xì)胞興奮性甚至引起細(xì)胞的興奮性毒性，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或死亡［18］，因此結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為KA 通過影響A 型鉀通道失活曲線的k值和τ值等電學(xué)活性導(dǎo)致IA密度降低，繼而引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞興奮性增高，是KA 造成CN神經(jīng)元興奮性毒性損傷的機(jī)制之一。

既往實(shí)驗(yàn)研究包括我們自己的研究已經(jīng)表明，內(nèi)源性大麻素可以調(diào)節(jié)相關(guān)離子通道發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［19-20］，而CB1受體激活也可以打開鉀離子通道引起鉀的涌入［10，21］。據(jù)此我們推測對IA的調(diào)節(jié)可能是2-AG 抑制KA 誘導(dǎo)的CN 神經(jīng)元興奮性毒性的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過膜片鉗技術(shù)記錄顯示2-AG 顯著增加KA 興奮性神經(jīng)毒性損傷CN 神經(jīng)元上IA電流幅度，并有效拮抗KA 所致的A 型鉀通道失活后τ值和失活曲線k值的增大，加快了通道失活后恢復(fù)過程。隨后選取了CB1 受體拮抗劑SR1 為研究藥物，實(shí)驗(yàn)顯示SR1 抵消了2-AG 的上述作用。以上結(jié)果表明，2-AG 通過CB1 受體調(diào)節(jié)CN 神經(jīng)元A 型鉀通道的功能來實(shí)現(xiàn)對IA的調(diào)制，從而減輕KA 對IA的影響。如前所述，IA的降低可以導(dǎo)致神經(jīng)元過度興奮，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的興奮性毒性［18］。因此，對KA 所致IA減小的拮抗意味著減輕CN 神經(jīng)元的過度興奮。以上結(jié)果說明2-AG 通過CB1 受體拮抗KA 所致CN 神經(jīng)元IA的減小可能是2-AG 對抗KA 的神經(jīng)興奮性毒性作用、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)研究中使用2-AG 降解酶MAGL 抑制劑URB602得到了與內(nèi)源性大麻素2-AG類似的效果，提示直接增加內(nèi)源性大麻素2-AG，或者抑制MAGL 使2-AG 水解減少而間接升高細(xì)胞內(nèi)2-AG 水平，在KA所致神經(jīng)興奮性細(xì)胞模型中同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是人類機(jī)體中一個非常重要的內(nèi)源性系統(tǒng)，參與了包括情緒調(diào)節(jié)、疼痛管理、認(rèn)知功能、獎賞、食欲、脂肪和葡萄糖代謝、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)保護(hù)、炎癥和免疫功能等在內(nèi)的大量生理過程［22］。因此，以包括2-AG 和MAGL 在內(nèi)的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)相關(guān)蛋白為目標(biāo)的化合物已被用于或研究用于疼痛、癲癇、精神疾病、代謝疾病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等的治療［23-24］；大麻素相關(guān)藥物及其機(jī)制的研究也因此成為近幾十年來的研究熱點(diǎn)，也給上述難治性疾病的治療帶來希望。但目前對其作用機(jī)制的有限理解限制了該類藥物的臨床應(yīng)用。本研究首次提供了KA 的神經(jīng)毒性作用和2-AG 的神經(jīng)保護(hù)作用與IA直接相關(guān)的證據(jù)，提示A 型鉀通道可能成為治療興奮性神經(jīng)毒性所致神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的有效靶點(diǎn)；也對理解內(nèi)源性大麻素對人體的調(diào)節(jié)機(jī)制和探索其臨床應(yīng)用途徑開拓了新視角。

此外，帕金森病、亨廷頓病和阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病目前尚無有效治療手段，但越來越多研究證實(shí)CN與這些疾病的病理及病理生理機(jī)制密切相關(guān)：CN 萎縮是亨廷頓病一個已經(jīng)證實(shí)的神經(jīng)影像學(xué)特征［25］；研究還發(fā)現(xiàn)亨廷頓病患者癥狀發(fā)作前CN 就已經(jīng)受到顯著影響［26］；與主觀和輕度認(rèn)知障礙患者相比，阿爾茨海默病患者的尾狀核體積更大［27］；多數(shù)帕金森病患者中存在CN 多巴胺功能障［28］；有氧運(yùn)動誘發(fā)CN多巴胺釋放增加則與帕金森病患者的運(yùn)動治療效果相關(guān)［29］。由此可見，CN 在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療中具有重要的研究價值。本實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)CN神經(jīng)元上A型鉀通道參與了2-AG對KA損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用，也為上述難治性神經(jīng)退行性疾病的研究提供了新思路。