發(fā)酵羊糞氨氮降解菌的篩選及鑒定

劉蕓 羅曉建，2 阮傳清 徐慶賢

（1 福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所 福建福州 350003 2 福州理工學院 福建福州 350504 3 福建省農業(yè)科學院農產品加工研究所 福建福州 350003）

畜牧業(yè)已經成為我國農業(yè)經濟生產中的支柱產業(yè)，畜牧業(yè)養(yǎng)殖過程中產生的污染已經引起廣泛的關注［1］。畜禽糞便分解會產生氨氣，這是畜禽養(yǎng)殖場惡臭的主要來源，超過一定量會損害人與畜禽健康。我國畜禽糞便已給生態(tài)環(huán)境造成了很大壓力，其年產量于2000 年以后一直穩(wěn)定在21.21 億t 以上，為工業(yè)廢棄物的2.7 倍［2］。畜禽糞便的處理方法主要分為化學法、物理法和微生物發(fā)酵法。相比較化學法和物理法，微生物發(fā)酵法簡單、有效、成本低廉、可持續(xù)發(fā)展和資源化利用。但同時，畜禽糞便在微生物作用下產生的CH4、CO2和N2O 等氣體會帶來溫室效應［3］。

微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術利用稻殼、鋸末、秸桿等作物廢棄物做成發(fā)酵床，將動物放養(yǎng)在發(fā)酵床上。動物糞便排放于發(fā)酵床上，被墊料吸附、消解。這種養(yǎng)殖方法不需要建設沼氣池、污水池和糞場，也無需沖洗畜禽舍，并降低了畜禽舍的NH3、H2S的排放量，是解決畜禽養(yǎng)殖污染的有效措施。微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖技術在養(yǎng)豬業(yè)得到了廣泛使用，衍化出原位發(fā)酵床和異位發(fā)酵床［4］。隨著國家《畜禽規(guī)模養(yǎng)殖污染防治條例》和《水污染防治行動計劃》的實施，發(fā)酵床在雞、鴨養(yǎng)殖業(yè)的應用研究日益受到重視［5］。

優(yōu)良的發(fā)酵床復合菌劑，能促進發(fā)酵床正常運行，降低NH3等臭氣，減少病原菌，有利于動物的健康養(yǎng)殖。開發(fā)禽類發(fā)酵床復合菌劑有助于推廣發(fā)酵床養(yǎng)殖技術，減少禽糞污染，保障養(yǎng)禽產業(yè)發(fā)展。發(fā)酵床上使用的菌種還存在適應性不廣、南北效果差異大的問題［6］。本研究從發(fā)酵羊糞便中分離氨氮降解菌，通過室內活性比較篩選各類優(yōu)良氨氮降解菌株，為進一步研發(fā)發(fā)酵床復合菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 樣品來源與樣品采集樣品采集自福建省泉州市某養(yǎng)羊場發(fā)酵羊糞。將采集到的樣品用實驗冰袋冷凍保存，迅速帶回實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

氨氮降解菌選擇性培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、硫酸銨2.5 g、氯化鈉2 g、七水硫酸亞鐵0.4 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、瓊脂17 g，調節(jié)pH 值至7.2～7.4，加入蒸餾水至1 L，121 ℃滅菌20 min 后倒平板。

氨氮降解菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g、硫酸銨2.5 g、氯化鈉2 g、七水硫酸亞鐵0.4 g、磷酸氫二鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g，調節(jié)pH 值至7.2～7.4，加入蒸餾水至1 L，121 ℃滅菌20 min 后倒平板。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白酶10 g、酵母提取液5 g、氯化鈉10 g，加入蒸餾水至1L，調節(jié)pH 值至7.4，121 ℃滅菌20 min。

Biospin 細菌基因組DNA 提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR 擴增試劑（上海生工生物工程服務有限公司）；16S rDNA 擴增引物（正向引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，上海生物工程有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設備

ZHJH-C1209C 超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；Bluepard 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（德國耶拿分析儀器股份公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 氨氮降解菌菌株的篩選

將從試驗基地采集回來的泉州羊糞樣品中取5 g 裝入到氨氮液體培養(yǎng)基中，之后將培養(yǎng)基放置到搖床上，30 ℃、180 r/min搖24～48 h。取10 mL 樣品用90 mL 無菌水稀釋10 倍，震蕩均勻后在超凈工作臺中進行梯度稀釋，得到濃度為10-1～10-5的稀釋液，并將10-3、10-4、10-5稀釋液分別涂布于與之對應的培養(yǎng)基的平板上，每種濃度涂布2 塊平板，30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h。

記錄涂布平板上生長出的全部菌落，依次將每種菌標記序號，并逐個進行挑取反復劃線純化培養(yǎng)。純化后挑取出每一種菌落，用含有20%甘油（滅菌）的LB 液體培養(yǎng)基懸浮，放置于-72 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的分子鑒定

將劃線純化所得的單菌落進行提取DNA 與PCR 擴增。

16S rDNA 序列的PCR 擴增：取1.2.1 中純化的培養(yǎng)物，采用Biospin 細菌基因組DNA 提取試劑盒提取細菌基因組DNA，作為PCR 擴增的模板，利用16S rDNA 引物進行PCR 擴增。

PCR 反應體系（25 μL）：ddH2O 18.7 μL、10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL、dNTP（10 mmol/L each）0.5 μL、引物各1 μL、Taq DNA Polymerase 0.3 μL、Temple 1 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增結果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并保存。

PCR 產物測序及序列對比分析：將擴增成功的PCR 產物送交福州鉑尚生物技術有限公司測序。將測序結果通過網站GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對分析，選擇相關的參考菌株序列，再經Clustal X［7］對齊后，用軟件Mega 5.0［8］進行聚類分析（方法為Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor），構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹［9～11］。

1.2.3 氨氮降解菌脫氨效果檢驗

將之前放置于-72 ℃冰箱中保存?zhèn)溆玫陌钡淙〕?，用氨氮降解菌選擇性培養(yǎng)基進行劃線純化，培養(yǎng)48 h。之后將純化好的菌株接種到氨氮液體培養(yǎng)基中，接種3 瓶培養(yǎng)基，并設立3 組添加無菌水的對照組，30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。然后將培養(yǎng)的菌液取5%重新接入新的氨氮液體培養(yǎng)基中，對照組也取5%重新接入新培養(yǎng)基中，繼續(xù)做空白對照，30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)96 h，并在培養(yǎng)的過程中依據(jù)《水質 銨的測定 水楊酸分光光度法》（HJ 536—2009），檢測并記錄0、24、48、72、96 h 的液體培養(yǎng)基的氨氮含量，并計算氨氮降解率。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及分子鑒定結果分析

通過平板劃線的方法從羊糞樣品中共分離獲得4 株菌株，編號分別為FJAT-56391、FJAT-56392、FJAT-56393 和FJAT-56394。

將4 種菌株樣品測序結果通過網站GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行序列比對分析，菌株樣品序列比對結果見表1，并以軟件NJ 法（Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor），構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖1。從表1 和圖1 中可以看出，芽孢桿菌屬的占比最大，占全部菌株的50%。4 株氨氮篩選菌菌株序列相似度均＞99%。一般認為，16Sr DNA 序列同源性＞99%，可以認為同屬［12］。

圖1 菌株基于16S rDNA 序列構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 同源菌株比對

2.2 氨氮降解菌脫氨效果檢驗

對篩選獲得的4 株氨氮篩選菌株進行去除氨氮能力的檢測，表2 是以氨氮（水楊酸）法檢測每一種氨氮篩選菌每一天的氨氮剩余量及其范圍的檢測結果。如表2 所示，4 株菌株對氨氮均有一定的去除能力，F(xiàn)JAT-56394 在剛接入時的氨氮起始濃度為3.0 mg/L，72～96 h 后氨氮濃度變成0 mg/L；而FJAT-56391 在剛接入時的氨氣的起始濃度為2.97 mg/L，范圍±0.06 mg/L，96 h 過后氨氮的剩余濃度為2.56 mg/L，范圍±0.07 mg/L，僅下降了約0.41 mg/L。所以各菌株對氨氮的去除效果有較大差異，其中有些菌株檢測的剩余量相比于前一天呈斷崖式減少或上漲。FJAT-56394 和FJAT-56392 這2 株除氨能力最強，降解率高達100%，而FJAT-56391 的除氨能力最弱，降解率為12%。

表2 氨氮降解菌脫氮效果

3 結論與討論

本試驗通過重復平板劃線法純化分離，從發(fā)酵羊糞中篩選到4 株降解氨氮的菌株，并通過16S rDNA 基因分子鑒定，菌株序列相似度均＞99%，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的菌株有2 株，數(shù)量占比50%。

通過氨氮水楊酸檢測法檢測液體培養(yǎng)基中氨氮的含量變化，驗證4 株氨氮降解菌對氨氮的去除能力。4 株氨氮菌對氨氮均有一定的去除能力，可以為研制氨氮除臭菌劑提供優(yōu)良的菌種資源，但各菌株對氨氮的去除效果有較大差異。在4 種氨氮降解菌株中，F(xiàn)JAT-56394 和FJAT-56392 這2 株除氨能力最強，降解率高達100%，而FJAT-56391 的除氨能力最弱，降解率僅為12%。