三葉青藤葉中總黃酮、葒草苷和異葒草苷提取分離方法及HPLC檢測條件的研究

李卓航，馮志營，陳斌，束成杰，單承鶯，聶韡，萬靜，蔡國強(qiáng)，何一波，馬世宏*

（1.中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 210042；2.浙江省綠色清潔技術(shù)及洗滌用品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 麗水 323000）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又名三葉崖爬藤，為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬［Tetrastigm（Miq.） Planch.］草質(zhì)藤本植物，全草均可入藥［1］，但對于藤葉部分的研究及利用相對較少。三葉青屬于浙江省西南部道地藥材，在麗水當(dāng)?shù)赜小八幫酢钡拿雷u(yù)。相較于一般的清熱解毒類中藥，長期食用三葉青是安全無毒的，并且能通過促進(jìn)干擾素等免疫活性物質(zhì)的合成和釋放增強(qiáng)人體免疫力［2-4］?！墩憬≈兴幣谥埔?guī)范》與《貴州草藥》記載，三葉青性寒，味苦，具有多種藥理活性，尤其是抗炎作用非常廣泛。目前從三葉青中提取分離鑒定出了58種化合物，其中最主要的為黃酮類成分，此外酚酸類、磷脂、糖酯類和苯磺酸類成分含量也較高［5-7］。目前對三葉青的研究多集中在抗腫瘤方面，初步確定了主要的藥效成分為葒草苷和異葒草苷［8-10］。

三葉青全草均可入藥，其藤葉主要成分為黃酮類化合物，具有多種藥理活性。三葉青自古就被作為中藥使用，近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其抗腫瘤功效的發(fā)掘，其利用價(jià)值大大提升［11-12］。目前抗腫瘤研究主要集中于三葉青地下部分，而藤葉部位的化學(xué)成分組成、藥理活性臨床應(yīng)用研究較少，限制了三葉青藤葉部位的開發(fā)，造成了一定的資源浪費(fèi)［13-15］。本研究通過對三葉青藤葉部分的總黃酮、葒草苷以及異葒草苷的提取分離及高效液相色譜測定方法的考察，確定了適用于三葉青中主要有效成分單體測定的參數(shù)指標(biāo)，以期為三葉青組分的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KF-1209 電子天平（中國凱豐集團(tuán)有限公司）；KQ-210A 超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）；DS-1 組織粉碎機(jī)（北京華欣科創(chuàng)科技有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海亞榮生工儀器廠）；SHZ-DⅢ 循環(huán)水式多用真空泵（予華儀器責(zé)任有限公司）。

1.2 試驗(yàn)材料

三葉青購自亳州市弘寶堂商貿(mào)有限公司；葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品 ≥ 99.5%）、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品 ≥ 99.5%）均購自阿拉丁科技有限公司；甲醇、乙醇、丙二醇、丁二醇均購自阿拉丁科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱量適量三葉青藤葉進(jìn)行提取，充分粉碎后過40目篩。依照料液比1 ∶ 15進(jìn)行提取，提取溶液依次選擇不同濃度的乙醇、丙二醇或丁二醇，設(shè)置回流裝置進(jìn)行有效成分提取，提取時(shí)間設(shè)定為3 h。所得的溶液依照4 000 r/min離心15 min后去上清進(jìn)行抽濾，得到濾液即為三葉青黃酮提取液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精確稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品7.200 mg，加入50%乙醇溶液定容至25 mL容量瓶中，混合均勻，制得質(zhì)量濃度為0.288 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

精確稱量葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品1.000 mg，加入50%乙醇溶液定容至25 mL容量瓶中，混合均勻，制得濃度為0.04 mg/mL的葒草苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

精確稱量異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品5.000 mg，加50%乙醇定容至25 mL棕容量瓶中，混合均勻，制得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

1.3.3 三葉青藤葉部位有效成分含量測定

三葉青藤葉部分總黃酮含量測定：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液中加入0.3 mL的5% NaNO2溶液，靜置6 min后加入0.3 mL的10% Al（NO3）3溶液混合均勻，靜置6 min后，加入4% NaOH溶液4 mL，最后用50%乙醇溶液定容至10 mL，靜置20 min后高速離心6 min，取上清液作為顯色后的樣品溶液。空白對照中加入0.3 mL的5% NaNO2溶液、0.3 mL的10% Al（NO3）3溶液和4 mL 的4% NaOH 溶液，最后用50%乙醇溶液定容至10 mL，于500 nm處檢測吸光度。

三葉青藤葉部分葒草苷及異葒草苷含量測定：取異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各0.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇補(bǔ)足至6 mL，精密加入5%NaNO2溶液1 mL，混合均勻，靜置 6 min；加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，混合均勻，靜置6 min；加入4%NaOH溶液10 mL，加水稀釋至刻度，混合均勻，靜置15 min，于400 nm處檢測吸光度。

1.3.4 色譜條件

三葉青藤葉部分總黃酮含量測定：色譜柱選擇Aglient C18柱（250 mm × 4 .6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）- 0.5%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～ 10 min，20% A；10 ～ 15 min，20% → 25% A；15 ～ 20 min，25% →33.5% A；20 ～ 23 min，33.5% → 33.5% A；23 ～ 30 min，33.5% → 40% A；30 ～ 40 min，40% → 20% A）。檢測波長為340 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青總黃酮含量檢測

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成0.028 80、0.0230 4、0.017 28、0.011 52、0.005 76 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3方法進(jìn)行定量，以進(jìn)樣液中蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出蘆丁的線性關(guān)系方程為Y= 6.319 4X+ 0.000 6，R2=0.999 2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同提取溶劑提取得到的三葉青藤葉部分中的黃酮含量，結(jié)果見表 1。結(jié)果表明，40%乙醇作為溶劑提取得到總黃酮含量較高。

表1 不同提取溶劑提取三葉青藤葉樣品中總黃酮含量Tab.1 Content of total flavonoids in the ground parts of T.hemsleyanum samples with different extract solvents

2.2 三葉青藤葉黃酮單體檢測方法確定

2.2.1 三葉青藤葉黃酮色譜條件分析

按照色譜條件，對稀釋為2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試樣品溶液分別進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖1和圖2所示。由檢測結(jié)果可知，葒草苷和異葒草苷具有明顯的特征性吸收峰，特征峰的出峰時(shí)間分別為24.834 min和25.774 min，供試樣品溶液中的葒草苷和異葒草苷在此色譜條件下，實(shí)現(xiàn)了與其它物質(zhì)的分離，特征峰明顯，出峰時(shí)間分別為24.765 min和25.61 min。表明該色譜條件適于三葉青中葒草苷和異葒草苷的測定。

圖1 葒草苷和異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of orientin and isoorientin reference substance

圖2 三葉青藤葉供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of ground parts of T. hemsleyanum test article

2.2.2 線性關(guān)系考察

將葒草苷和異葒草苷混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成4、2、1、0.5、0.4 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次檢測。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中葒草苷和異葒草苷的濃度為橫坐標(biāo)，以特征峰的峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出葒草苷的線性關(guān)系方程為Y= 1.052 4X- 0.508 6，R2= 0.999 7；異葒草苷的線性回歸方程為Y= 1.665 0X- 0.826 4，R2= 0.999 6。結(jié)果表明，葒草苷和異葒草苷的濃度在4～0.4 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與進(jìn)樣液中葒草苷和異葒草苷濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度考察

按照相同檢測方法，再次對供試樣品溶液進(jìn)行檢測，并根據(jù)特征峰峰面積計(jì)算得出供試樣品中葒草苷的平均含量為3.58 ± 0.04 μg/mL，RSD為1.04%（n= 6），小于3.0%；異葒草苷的平均含量為1.47 ±0.02 μg/mL，計(jì)算出RSD為1.01%（n= 6），小于3.0%，表明該方法的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性考察

取同一三葉青樣品分成6份，分別按照試驗(yàn)方法提取制成供試樣品溶液，按色譜條件分別進(jìn)樣分析，計(jì)算測定結(jié)果，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出RSD為 1.44%（n= 6），小于3.0%，表明其重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率測定

分別精密吸取葒草苷和異葒草苷對照品溶液2、3、4 mL，靜置于20 ml容量瓶中，揮干，取6份已知含量的供試樣品溶液于容量瓶中并加入甲醇溶液稀釋至刻度，按照1.3.4檢測條件進(jìn)行HPLC檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算葒草苷和異葒草苷的含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2和表3。

表2 葒草苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Test results of sample recovery of orientin

表3 異葒草苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Test results of sample recovery of isoorientin

2.3 提取方法考察

取同一批三葉青藥材藤葉，按1.3.1所述方法分別用40%乙醇、70%乙醇、10%丙二醇、30%丙二醇、10%丁二醇和30%丁二醇制成供試品溶液，按照1.3.4檢測條件進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藤葉葒草苷和異葒草苷的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，30%丙二醇作為溶劑所測葒草苷含量較高；40%乙醇作為溶劑所測異葒草苷含量較高。

表4 不同提取溶劑提取三葉青藤葉部分樣品中黃酮單體樣品含量Tab. 4 Extraction of flavonoid monomer content in the ground parts of T. hemsleyanum samples with different extract solvents

3 討論

3.1 有效成分分離鑒定

近年來，對三葉青中有效成分及其藥理活性的研究主要以黃酮或未標(biāo)明成分的提取物為研究對象，發(fā)現(xiàn)其可有效抑制各類癌癥細(xì)胞的增殖和遷移?！吨参锩麑?shí)圖考》《浙江民間常用草藥》以及《全國中草藥匯編》記載了三葉青具有清熱解毒、消腫止痛、化痰散結(jié)、抗炎解毒等功效［17-19］，針對這些功效及其對應(yīng)的有效成分研究較為單一而淺顯，難以為三葉青的全面發(fā)展提供理論基礎(chǔ)，故此本研究對三葉青中葒草苷及異葒草苷的含量進(jìn)行分離鑒定，以求為三葉青多方位發(fā)展提供有力支持。

3.2 提高三葉青利用度

我國對三葉青的研究起步較晚，研究方向較為單一，因此，直至目前三葉青仍未被收錄進(jìn)《中華人民共和國藥典》，目前，僅在《浙江省中藥材炮制規(guī)范》［20］中對三葉青進(jìn)行了描述，這一點(diǎn)極大限制了三葉青的應(yīng)用與推廣。未來對三葉青的研究應(yīng)加強(qiáng)深度和廣度，以求推進(jìn)三葉青產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，為三葉青產(chǎn)品深度研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過對三葉青藤葉部分的葒草苷、異葒草苷及總黃酮的高效液相色譜測定方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的考察，確定了適于三葉青中化學(xué)成分HPLC測定的條件?？疾觳煌崛∪軇S酮提取效率的影響，可知30%丙二醇作為溶劑，所測葒草苷含量較高；40%乙醇作為溶劑，所測異葒草苷含量較高。通過該方法測定三葉青藤葉葒草苷和異葒草苷含量分別為3.58 μg/mL和1.47 μg/mL。

近年來，許多研究表明三葉青具有很好的抗腫瘤功效，引起了廣泛關(guān)注。三葉青的種植和加工產(chǎn)業(yè)也逐漸興起，于2018年被列為“新浙八味”之一，也證實(shí)了其具有極大的開發(fā)利用潛力［16］。但是，短時(shí)間的快速發(fā)展也暴露出很多問題，目前對三葉青的理論研究還不夠全面，尤其存在提取工藝落后、特征性成分不明的問題，這也極大的限制了三葉青的開發(fā)與推廣，為了更好地開發(fā)利用三葉青資源，提高其綜合價(jià)值，本文對三葉青中有效成分的提取及檢測方法進(jìn)行了探究。

綜上所述，隨著三葉青相關(guān)研究的加深，其藥用效益與經(jīng)濟(jì)價(jià)值也將進(jìn)一步提高，必將帶動(dòng)我國三葉青產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、快速發(fā)展。在新興技術(shù)高度發(fā)展發(fā)達(dá)的今天，三葉青的開發(fā)應(yīng)用也將走向工業(yè)化、大眾化，以充分開發(fā)利用我國豐富的三葉青資源。