潤楠葉片多糖提取工藝、結(jié)構(gòu)表征與生物活性研究

梁思琪，祁小艷，肖強

（湖北民族大學(xué) 林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000）

潤楠［Machilus nanmu（Oliv.） Hemsley］為樟科（Lauraceae）潤楠屬植物，廣泛分布于亞洲東南部和東部的熱帶、亞熱帶地區(qū)，資源十分豐富。潤楠植物中富含多種活性代謝產(chǎn)物［1-2］，在皮膚炎癥、足腫、腹瀉等醫(yī)療方面頗有效果。湖北民族大學(xué)植物園內(nèi)種植許多潤楠，潤楠的管理過程中有大量的葉片缺乏利用，應(yīng)對其進行開發(fā)，提高其綜合效益。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，潤楠葉片中多糖含量較高，而植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)［3-4］、抗腫瘤［5-6］、抗衰老［7-9］、降血糖［10］以及抗凝血［11］等功效。目前關(guān)于潤楠葉片多糖的研究還未見報道，其結(jié)構(gòu)如何、在抗氧化、抗腫瘤活性方面是否同其它植物多糖一樣發(fā)揮作用？為此，本研究以潤楠葉片為材料，采用超聲輔助復(fù)合酶法提取多糖，以得率為指標，探究pH、超聲溫度、超聲功率、超聲時間對多糖提取率的影響；并采用正交試驗設(shè)計［12］確定最佳工藝參數(shù)。進一步，利用紅外光譜法分析其官能團，掃描電鏡觀察其表觀形貌，液相色譜法測定其單糖組成［13-15］；最后采用體外抗氧化實驗和細胞實驗考查潤楠葉片多糖的生物活性［16-17］。通過以上研究，探究潤楠葉片多糖的功能并為其綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料與試劑

潤楠葉片，采摘于湖北民族大學(xué)植物園，經(jīng)湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院易詠梅教授鑒定；健康、無病蟲害的葉片用清水沖洗干凈，50℃熱泵式烘箱中烘干、粉碎后過40目篩，得潤楠葉片粉末。

果膠酶（酶活力 ≥ 500 000 U/g，福州飛凈生物科技有限公司）；纖維素酶（酶活力 ≥ 400 000 U/g，福州飛凈生物科技有限公司）；無水乙醇（武漢市中天化工有限責(zé)任公司）；D-無水葡萄糖（生工生物工程股份有限公司）；苯酚（阿拉丁試劑有限公司）；濃硫酸（武漢市中天化工有限責(zé)任公司）；檸檬酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），磷酸氫二鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；溴化鉀（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；三氯甲烷（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮（PMP，阿拉?。灰译妫ㄉV純，DIKMA）；乙酸銨（阿拉?。?；D-葡萄糖，D-甘露糖，L-鼠李糖，D-半乳糖，D-阿拉伯糖，L-巖藻糖，D-葡萄糖醛酸，D-半乳糖醛酸均為標準品（純度 ≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH（阿拉?。唤剐詻]食子酸（天津市博迪化工有限公司）；Tris-HCl（阿拉丁）；L-抗壞血酸（Vc，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；HCCLM（人肝癌細胞）；A549（人肺癌細胞）；胎牛血清（E510002-0100生工生物）；RPMI培養(yǎng)基（E600028-0500生工生物）；PBS（AG29714106 cytiva公司）；DMEM培養(yǎng)基（AG29714106 cytiva公司）；1640培養(yǎng)基（AG29714106 cytiva公司）；青霉素鏈霉素溶液（源葉生物）；CCK-8試劑盒（100T，大連美侖公司）。

1.2 儀器設(shè)備

流水式高速中藥粉碎機（LG-20，瑞安市百信制藥機械有限公司）；循環(huán)式水式多用真空泵（SHBIII，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；高速大容量冷凍離心機（H2050R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；超聲波細胞破碎儀（950E，寧波新芝生物科技股份有限公司）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電子天平（ALB-124，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）； Nicolet iS50 FT-IR紅外光譜儀；JSM-6510LV掃描電鏡；HPLC高效液相色譜儀（Thermo公司）；潔凈工作臺（JJ-CJ-1FD，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）；多功能酶標儀（Thermo公司）；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（Olympus）。

2 實驗方法

2.1 多糖的提取

稱取一定質(zhì)量潤楠葉片粉末于燒杯中，加入2%復(fù)合酶（纖維素酶 ∶ 果膠酶 = 1 ∶ 1），按照料液比1 ∶ 20（g/mL）添加不同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，置于已設(shè)定好溫度、時間、功率的超聲細胞破碎儀中進行提取，超聲結(jié)束后，立刻抽濾，向收集的濾液中加入無水乙醇使其達80%濃度（v/v），于4℃冰箱中醇沉12 h，醇沉結(jié)束后于8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，除去上清液，向沉淀加入蒸餾水復(fù)溶，冷凍干燥后得潤楠葉片多糖粉末。取一定質(zhì)量的潤楠葉片多糖粉末，參照覃錢等［18］方法用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量。

多糖得率=C×V×N/m×10-6×100%

式中C為待測液的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為待測液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

2.2 單因素試驗

以0.5 g潤楠葉片粉末為提取對象，對體系pH、超聲溫度、超聲功率、超聲時間4個因素進行單因素試驗，討論提取因素對潤楠葉片多糖得率的影響。體系pH為3、4、5*、6、7，超聲溫度為30、40*、50、60、70℃，超聲功率為100、150、200*、250、300 W，超聲時間為5、10*、15、20、25 min（*代表在做某一單因素實驗中，其它因素的取值）。

2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以體系pH（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）和超聲時間（D）為自變量，以多糖得率（R）為因變量。確定潤楠葉片多糖提取的最佳參數(shù)。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factor level table of orthogonal experiment

2.4 結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 紅外光譜

潤楠葉片多糖粉末與溴化鉀按照1 ∶ 100（mg）研磨混勻，利用傅里葉變換紅外光譜儀，在400 ～4 000 cm-1波長下進行掃描分析。

2.4.2 掃描電鏡

取微量潤楠葉片多糖粉末黏在帶有導(dǎo)電膠帶的處理片上，經(jīng)噴金處理后，利用掃描電鏡掃描分析，觀察潤楠葉片多糖的微觀形貌。

2.4.3 單糖組成

樣品水解及樣品和標準品的衍生參考林曉燕［19］方法。

色譜條件：色譜柱（Diamonsil Plus，5 μm，C18-B，250 mm × 4.6 mm）；流動相A：乙腈，流動相B：50 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序：0 ～ 60 min，85% ～ 75% A，15% ～ 25% B，在線脫氣，流速1.0 mL/min，柱箱溫度30℃，檢測波長250 nm，進樣量10 μL。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 DPPH自由基清除效果的測定

參照胡玲華等［20］方法略作修改：將潤楠葉片多糖粉末配制成不同濃度溶液，各取2 mL置于試管中，加入0.4 mmol/L DPPH無水乙醇溶液2 mL，搖勻，室溫條件下置于黑暗處放置30 min。在波長517 nm處分別測定吸光度Ai，另分別測定參比溶液吸光度Ab和空白溶液吸光度A0。以同濃度的Vc溶液做陽性對照，清除率計算公式為：

2.5.2 羥基自由基清除效果的測定

參照胡玲華等［20］方法略作修改：將潤楠葉片多糖粉末配制成不同濃度溶液，各取1 mL置于試管中，然后加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液1 mL，振蕩均勻，最后加入6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，搖勻，靜置37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min。在波長510 nm處分別測定其吸光度Ai；另用蒸餾水代替過氧化氫溶液重復(fù)上述試驗，測得參比吸光度Ab；另用蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述試驗，測得空白吸光度A0。以同濃度的Vc溶液做陽性對照，清除率計算公式為：

2.6 抗腫瘤活性研究

2.6.1 腫瘤細胞培養(yǎng)

將購買的HCCLM（人肝癌細胞）、A549（人肺癌細胞）進行復(fù)蘇，復(fù)蘇完成后分別將其轉(zhuǎn)移至裝有DEME、RPMI-1640培養(yǎng)基的T25瓶中，放入37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞培養(yǎng)到密度為70% ～ 80%時，用于后續(xù)實驗。

2.6.2 CCK-8法檢測潤楠葉片多糖細胞活力

參照程婷婷等［21］方法略作修改：在96孔培養(yǎng)板中，分別接種對數(shù)生長期的HCCLM、A549細胞，每孔0.1 mL（約1 × 104個細胞），培養(yǎng)24 h后，倒掉細胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖溶液沖洗后，分別加入0.1 mL不同濃度的多糖提取溶液，每濃度平行6孔，培養(yǎng)24 h后，倒掉多糖提取液，加入0.1 mL的CCK-8，置于37℃，5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)0.5 h后，以450 nm為檢驗波長，用MK3型酶標儀測定吸光度。以細胞的存活率和藥物的不同濃度作圖，計算細胞存活率。

2.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均設(shè)3組平行，利用軟件SPSS 23進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2021進行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗

體系pH：當pH為5時，潤楠葉片多糖得率最高，當pH過高或過低時，使得纖維素酶和果膠酶處于不適pH下，影響活性基團的解離，酶促反應(yīng)降低，導(dǎo)致得率下降；故選取最佳體系pH為5。

超聲溫度：隨著溫度的不斷提高，潤楠葉片多糖的得率逐漸增加，在60℃時達到最大值，60℃后，隨著溫度繼續(xù)增高，得率反而下降。這是因為一方面加熱可以促進酶活性，增大反應(yīng)速度；另一方面當溫度過高，可能分解其有效成分，影響多糖得率；所以選擇60℃作為最佳超聲溫度。

提取功率：當功率從100 W上升時，潤楠葉片多糖得率也在不斷增加，在250 W時達到最大，此后，隨著功率的增加，得率反而下降，這可能是由于一定程度的超聲波對植物細胞有破碎作用，有利于提取物的釋放，但隨著超聲波功率不斷增大，對細胞的破碎程度增大，溶解雜質(zhì)增多，有效成分溶解量減少，得率呈下降趨勢；所以選擇200 W作為最佳超聲功率。

超聲時間：當超聲時間過短時，一方面超聲波的氣穴效應(yīng)和熱效應(yīng)沒有充分發(fā)揮，另一方面酶與底物反應(yīng)不充分，從而導(dǎo)致得率偏低；當超聲時間大于15 min時，隨著超聲時間延長，會導(dǎo)致多糖降解，使得潤楠葉片多糖得率下降；故選取最佳超聲時間為15 min。

圖1 各因素對潤楠葉片多糖提取率的影響Fig.1 Effects of various factors on polysaccharide yield from leaves of M.nanmu

3.2 正交試驗

根據(jù)3.1中單因素試驗結(jié)果，設(shè)計四因素三水平L9（34）正交試驗優(yōu)化提取潤楠葉片多糖的工藝條件。結(jié)果見表2。各因素影響多糖提取率順序為D（超聲時間） ＞ B（超聲溫度） ＞ C（超聲功率） ＞ A（體系pH），由各因素水平結(jié)果分析可知，最佳提取參數(shù)組合為A2B1C2D3，即體系pH = 5、超聲溫度50℃、超聲功率250 W、超聲時間20 min。對多糖最佳提取工藝進行驗證：多糖優(yōu)化工藝的提取率平均值為7.23%，RSD小于3.57%，表明潤楠葉片多糖的優(yōu)化提取工藝穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Experimental design and results of orthogonal tests

3.3 潤楠葉片多糖的結(jié)構(gòu)表征

3.3.1 紅外光譜分析

潤楠葉片多糖在3 420 cm-1處的吸收譜帶寬而強，為O-H伸縮振動和N-H伸縮振動疊加，主要貢獻物為蛋白質(zhì)和核酸；在1 649 cm-1的特征峰COO-的非對稱伸縮振動；1 411 cm-1為C-H鍵的變角振動吸收峰；1 200 ～ 900 cm-1范圍多為多糖吸收區(qū)（圖2）。

圖2 潤楠葉片多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of polysaccharides from leaves of M.nanmu

3.3.2 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡對潤楠葉片多糖進行形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察（見圖3）。在500倍鏡頭下可見潤楠葉片多糖呈不規(guī)則的塊狀形態(tài)，棱角分明且存在一些微小的空隙，隨著放大倍數(shù)的增大，在800和2 000倍的鏡頭下，可以看到其表面光滑、立體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)疏松，這可能與經(jīng)過酶解處理后引起潤楠葉片多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)。

圖3 潤楠葉片多糖的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy of polysaccharides from leaves of M.nanmu

3.3.3 單糖組成分析

通過對單糖標準品衍生化后HPLC圖譜（圖4）保留時間綜合分析可知：16.050 min為甘露糖，19.817 min為鼠李糖，22.353 min為葡萄糖醛酸，24.343 min為半乳糖醛酸，27.837 min為葡萄糖，30.200 min為半乳糖，31.647 min為阿拉伯糖，34.080 min為巖藻糖。

圖4 混合單糖標準品色譜圖Fig.4 Color spectrum of mixed monosaccharide standard

潤楠葉片多糖水解產(chǎn)物經(jīng)PMP衍生化的HPLC色譜圖見圖5，幾種單糖的分離效果好，經(jīng)過和標準單糖的保留時間比對，可以知道潤楠多糖的單糖主要包括D-甘露糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖，和L-阿拉伯糖，其摩爾比為Man ∶ GalA ∶ Glc ∶ Ara =2.87 ∶ 0.45 ∶ 0.94 ∶ 3.09。

圖5 潤楠葉片多糖液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of polysaccharide from leaves of M.nanmu

3.4 潤楠葉片多糖抗氧化活性

3.4.1 DPPH自由基清除能力

當多糖濃度在1 ～ 5 mg/mL時，潤楠葉片多糖各濃度對DPPH自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現(xiàn)出明顯的量效依賴線性關(guān)系，當濃度為5 mg/mL時，潤楠葉片多糖對DPPH自由基的最大清除率為68.34%，其清除率可達Vc的71.89%，表明潤楠葉片多糖對DPPH自由基有一定的清除作用（圖6）。

圖6 潤楠葉片多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on DPPH free radical

3.4.2 羥基自由基清除能力

不同濃度的潤楠葉片多糖對羥基自由基均具有較好的清除能力，在0.2、0.4、0.6 mg/mL時，潤楠葉片多糖對羥基自由基的清除率為70.47%、72.81%、78.51%，均高于Vc。顯示潤楠葉片多糖對羥基自由基具有清除作用（圖7）。

圖7 潤楠葉片多糖對羥基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on hydroxyl radical

3.5 潤楠葉片多糖抗腫瘤活性

當多糖濃度在1.25 ～ 10 mg/mL時，潤楠葉片多糖對HCCLM、A549細胞沒有顯著抑制作用。在多糖濃度為20 mg/mL時，對HCCLM、A549細胞抑制作用效果顯著，幾乎無細胞存活；該結(jié)果表明高濃度的潤楠葉片多糖具有一定的抗腫瘤活性（圖8， 9）。

圖8 潤楠葉片多糖對HCCLM細胞活力的影響Fig.8 Effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on cell viability

圖9 潤楠葉片多糖對A549細胞活力的影響Fig.9 Effect of polysaccharides from leaves of M.nanmu on cell viability

4 討論與結(jié)論

目前多糖提取方式主要有熱水浸提法、超聲法、酶解法及超聲輔助酶法等［22］，其含量一般采用苯酚-硫酸法測定。對于富含果膠類粘性物質(zhì)的潤楠葉片，若仍采用熱水浸提法再通過苯酚-硫酸法測定其多糖含量，往往會使測定的多糖含量偏高。為此，該文采用纖維素酶和果膠酶復(fù)合對潤楠葉片多糖進行超聲酶解，在單因素基礎(chǔ)上進行正交試驗設(shè)計，得出潤楠葉片多糖的最佳提取工藝：體系pH = 5、超聲溫度50℃、超聲功率250 W、超聲時間20 min。在此工藝條件下，多糖得率為7.18%。豆佳媛等［23］通過正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取銀杏葉多糖，在最佳條件下，銀杏葉多糖提取率為4.60%，顯示了超聲法提取植物葉片多糖的的良好效率；該文通過超聲輔助復(fù)合酶方式，提高了潤楠葉片多糖得率。潤楠葉片多糖紅外光譜圖主要以蛋白質(zhì)、核酸和糖類等吸收帶組成，并顯示多糖的典型特征吸收峰。潤楠葉片多糖掃描電鏡圖呈現(xiàn)出分裂的塊狀結(jié)構(gòu)，可能是酶解引起多糖聚集體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分裂成不規(guī)則的塊狀或小顆粒碎片等［24］。機體代謝過程中會產(chǎn)生具有破壞性作用的自由基，清除機體內(nèi)過量自由基，有助于維持機體氧化應(yīng)激水平和代謝的平衡有序。潤楠葉片多糖在羥基自由基清除方面效果顯著，并且在0.2、0.4、0.6 mg/mL時，清除率均高于Vc，說明其具有良好的抗氧化活性，可為今后潤楠葉片多糖的研究提供實驗依據(jù)；潤楠葉片多糖在低濃度時對HCCLM、A549細胞抑制作用不顯著，在高濃度20 mg/mL時才表現(xiàn)出對HCCLM、A549細胞的顯著抑制效果，表明其具有一定的抗腫瘤活性。潤楠葉片多糖具有一定的生物活性，可能與酶解破壞葉片細胞壁結(jié)構(gòu)使得多糖充分溶出，有一定關(guān)系。魏晴等［25］采用超聲波輔助法提取大果木姜子多糖，體外抗氧化實驗表明其具有一定的抗氧化能力。也有文獻顯示多糖的生物活性與多糖的純度及其單糖組成和含量有關(guān)［26-27］。該文對潤楠葉片多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)表征和生物活性進行了初步探究，可為進一步開發(fā)潤楠葉片的利用價值提供理論參考和數(shù)據(jù)支撐。有關(guān)潤楠葉片多糖純化后結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變、生物活性是否提高有待于后續(xù)研究。