鏈霉素驅(qū)動(dòng)微藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的響應(yīng)研究

何書晗，張洪波，歐陽添，施軍瓊，吳忠興

1. 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715； 2. 重慶第九十五初級中學(xué)校，重慶 400084；3. 武漢中科瑞華生態(tài)科技股份有限公司，武漢 430070

抗生素在農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及保障人們健康方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1].當(dāng)前,漁業(yè)和畜牧業(yè)對抗生素的需求量大幅增加[2].例如,美國每年約使用1.6萬t抗菌化合物,其中約70%用于非藥物治療.澳大利亞、新西蘭、加拿大和歐盟國家也觀察到類似的抗生素使用模式[3].水體中的抗生素通常來源于城市污水、制藥業(yè)廢水、畜牧業(yè)糞便廢水、垃圾處理過程中的滲濾液和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的餌料添加劑等[4].因此,河流、湖泊、地下水和廢水處理廠廢水中抗生素的檢出率較高,其質(zhì)量濃度變化從1 ng/L到1 000 μg/L[1,5].殘留的抗生素不僅會(huì)毒害水生生物,還會(huì)造成耐藥性問題[5-6].當(dāng)前,抗生素污染已引起全球科學(xué)界的關(guān)注．

光合自養(yǎng)型微藻是水生生態(tài)系統(tǒng)中的主要初級生產(chǎn)者[7].水體中藻類物種豐富,密度及生物量龐大,且藻類對污染物敏感性高,常作為重金屬、農(nóng)藥和抗生素等污染物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估的指示性物種[5,8].抗生素是微生物產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物,可以影響藻類的生長和存活[9].其中,鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素,可以用來控制水果、蔬菜、煙草、觀賞植物、池塘和水族箱上的細(xì)菌、真菌和藻類[10].鏈霉素能與原核生物的30S核糖體結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)的生物合成[11],還能阻礙生物的葉綠體發(fā)育,降低原核生物密度并抑制其生長繁殖[12].Harrass等[13]研究發(fā)現(xiàn),水體中的藍(lán)藻類對鏈霉素的敏感性較高,其質(zhì)量濃度變化范圍為0.09～0.86 mg/L,綠藻類對鏈霉素敏感性相對較低,質(zhì)量濃度變化范圍為0.66～37 mg/L.當(dāng)前,有關(guān)抗生素對水體中浮游植物生態(tài)毒性的研究報(bào)道較廣泛[14-17],而關(guān)于抗生素與淡水微藻生理活性的關(guān)系、葉綠素?zé)晒獾捻憫?yīng)機(jī)制報(bào)道較少.有研究發(fā)現(xiàn),葉綠素?zé)晒饪梢苑从彻夂舷到y(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)與環(huán)境脅迫變化的響應(yīng)[15-16].根據(jù)瞬時(shí)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)變化特征,研究人員發(fā)現(xiàn)藻類生理狀態(tài)與光合作用過程中的電子和光子流動(dòng)有明顯的相關(guān)性[15-17].因此,本文通過研究鏈霉素對藍(lán)藻-擬柱孢藻(Raphidiopsisraciborskii)和廣布種綠藻-四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)的生長、葉綠素?zé)晒夂桶胫滤罎舛?EC50)的影響,探究不同門類微藻對鏈霉素的敏感性和耐受性差異,特別是光合系統(tǒng)Ⅱ?qū)︽溍顾氐捻憫?yīng)特征,旨在為藻類毒理學(xué)研究提供新的視角,并為藻類對抗生素等新型污染物的響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)條件

研究使用的藻株擬柱孢藻(Raphidiopsisraciborskii)和四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)購自中國科學(xué)院(FACHB Collection; 中國武漢).在MA培養(yǎng)基[18]中培養(yǎng),光暗比為12 h∶12 h,光照為50 μmol/(m2·s),溫度(25±1) ℃,培養(yǎng)期內(nèi)每天手動(dòng)搖擺3～5次.熒光顯微鏡下監(jiān)測細(xì)菌污染比例不超過藻類生物量的1%[19].擬柱孢藻培養(yǎng)基中鏈霉素(Sigma,USA)處理組的最終質(zhì)量濃度分別為0.05,0.1,0.2,0.5和1.0 mg/L,四尾柵藻培養(yǎng)基中鏈霉素處理組的最終質(zhì)量濃度分別為1,2,5,10和20 mg/L,擬柱孢藻和四尾柵藻培養(yǎng)基對照組無鏈霉素處理,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)．

1.2 比生長率、丙二醛含量和抗氧化酶活性

比生長率(μ)根據(jù)公式(1)計(jì)算．

μ=(InCt2-InInCt1)/(t2-t1)

(1)

式中,Ct2和Ct1分別是t2和t1時(shí)的藻密度[19]．

培養(yǎng)96 h后,在8 000 rpm和4 ℃離心條件下收集所有藻類.藻類樣品放在5 mL,50 mmol/L磷酸緩沖溶液(pH=7.8)中保存.丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性根據(jù)Bai等[19]的測定方法進(jìn)行測定．

1.3 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線和葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析(JIP-test)

使用植物效率分析儀(PEA,Hansatech Instrument Ltd.,英國)測量葉綠素?zé)晒?進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y試前,將2 mL的藻液暗處理30分鐘,然后利用植物效率分析儀進(jìn)行分析.葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線參考Kautsky效應(yīng),JIP-test參數(shù)由葉綠素?zé)晒獬跏贾涤?jì)算獲得[15-17,20]．

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究的統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示,使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和T檢驗(yàn),p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2.1 比生長率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性

鏈霉素質(zhì)量濃度為0.05,0.1,0.2,0.5和1 mg/L培養(yǎng)基中的擬柱孢藻的比生長率(μ)分別是對照組(0.00 mg/L)的0.75,0.64,0.34,0.33和0.25倍(p<0.05),詳見圖1a.鏈霉素質(zhì)量濃度為1,2,5,10和20 mg/L培養(yǎng)基中的四尾柵藻的比生長率分別是對照組(0.00 mg/L)的1.19,1.10,0.66,0.63和0.51倍(p<0.05),質(zhì)量濃度為1和2 mg/L的鏈霉素處理組中微藻比生長率明顯較對照組高(p<0.05),詳見圖1b.擬柱孢藻和四尾柵藻處理組葉綠素a含量與鏈霉素質(zhì)量濃度的變化特征與比生長率相似,詳見圖1c和圖1d.擬柱孢藻和四尾柵藻的EC50分別為(0.11±0.03)和(12.32±2.73) mg/L．

鏈霉素質(zhì)量濃度為0.05,0.1,0.2,0.5和1 mg/L的培養(yǎng)基中,擬柱孢藻的丙二醛(MDA)含量分別是對照組的0.95,0.83,0.71,0.69和0.65倍,超氧化物歧化酶(SOD)活性分別是對照組的0.93,0.77,0.23,0.21和0.10倍,過氧化氫酶(CAT)活性分別是對照組的1.15,1.69,2.46,2.54和2.41倍(p<0.05),詳見圖1e.鏈霉素質(zhì)量濃度為5,10和20 mg/L的處理組中,四尾柵藻的MDA含量、SOD和CAT活性發(fā)生了顯著變化,明顯與擬柱孢藻相異,詳見圖1f.當(dāng)鏈霉素質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí),四尾柵藻的MDA含量和SOD活性明顯升高,分別為對照組的2.81和2.24倍,而四尾柵藻的CAT活性顯著下降,是對照組的0.76倍.鏈霉素質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí),四尾柵藻的MDA含量、CAT和SOD活性與對照組相比變化不顯著(p>0.05)．

**: 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)圖1 鏈霉素作用96 h后,擬柱孢藻(R. raciborskii)和四尾柵藻(S.quadricauda)的比生長率、 葉綠素a含量和MDA含量及酶活性變化情況

2.2 光合系統(tǒng)Ⅱ的能量流動(dòng)

葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)最大光化學(xué)效率(TR0/ABS=ΦP0,t=0,下同),光合系統(tǒng)Ⅱ活性反應(yīng)中心捕獲的激子驅(qū)動(dòng)電子傳遞的比率(ET0/TR0=Ψ0),電子從QA-轉(zhuǎn)移到電子傳遞鏈的量子效率(ET0/ABS=ΦE0) 和熱耗散量子比率 (ΦD0)變化特征見圖2a和2b.擬柱孢藻和四尾柵藻中的ΦP0和ΦE0顯著低于對照組(p<0.05),而ΦD0顯著增加(p<0.05).由圖2a和2b可知,擬柱孢藻中Ψ0增加,而四尾柵藻的Ψ0減少.擬柱孢藻和四尾柵藻反應(yīng)中心耗散的能量(DI0/RC)、單位光面積吸收的能量(ABS/CS0)和單位反應(yīng)中心吸收的能量(ABS/RC)變化特征見圖2c和2d.不同質(zhì)量濃度鏈霉素處理組的DI0/RC,ABS/CS0和ABS/RC顯著高于對照組(p<0.05).鏈霉素質(zhì)量濃度為1 mg/L的處理組培養(yǎng)96 h后,擬柱孢藻的DI0/RC,ABS/CS0和ABS/RC均出現(xiàn)增加,分別是對照組的3.36,1.24和2.63倍(p<0.05),20 mg/L鏈霉素的處理組中,四尾柵藻的DI0/RC,ABS/CS0和ABS/RC分別比對照組增加了54.02,7.03和16.24倍(p<0.05).與對照組相比,不同質(zhì)量濃度鏈霉素培養(yǎng)的擬柱孢藻的TR0/RC明顯受到抑制,而不同質(zhì)量濃度鏈霉素培養(yǎng)的四尾柵藻的TR0/RC均得到激活．

鏈霉素應(yīng)激能量流動(dòng)的管道模型如圖3所示,擬柱孢藻單位反應(yīng)中心捕獲的用于電子傳遞的能量(在t=0時(shí))(ET0/RC)和單位反應(yīng)中心捕獲的用于還原QA的能量(TR0/RC)明顯隨鏈霉素質(zhì)量濃度的增加而減少,DI0/RC和ABS/RC則隨鏈霉素質(zhì)量濃度的增加而增加.四尾柵藻的ET0/RC,TR0/RC和ABS/RC在鏈霉素質(zhì)量濃度較低(<2 mg/L)時(shí)顯著增加,而DI0/RC在鏈霉素質(zhì)量濃度較高時(shí)顯著增加．

圖2 不同質(zhì)量濃度鏈霉素處理對擬柱孢藻(R. raciborskii)和四尾柵藻(S. quadricauda)的 量子產(chǎn)率及比活性相關(guān)參數(shù)的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度鏈霉素處理下擬柱孢藻(R. raciborskii)和四尾柵藻(S. quadricauda) 類囊體膜光合結(jié)構(gòu)的能量通路模式圖

3 討論

3.1 鏈霉素對生長、抗氧化機(jī)制和膜系統(tǒng)的影響

水環(huán)境中抗生素的檢出率較高,這與抗生素大量用于人類和動(dòng)物的傳染病治療有關(guān)[14].有研究發(fā)現(xiàn),抗生素對水體中的革蘭氏陰性菌菌群、藍(lán)藻的物種多樣性和生物量有明顯的抑制作用[21-24],這表明殘留在水體中的抗生素能通過改變水體環(huán)境中的細(xì)菌、原生動(dòng)物、藻類和浮游動(dòng)物的數(shù)量破壞水體生態(tài)系統(tǒng)[25].本研究發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)量濃度的鏈霉素均可抑制擬柱孢藻和四尾柵藻的比生長率(μ),鏈霉素質(zhì)量濃度越高,抑制作用越明顯,且藍(lán)藻對鏈霉素的敏感性比綠藻更強(qiáng),表明殘留在水體中的低質(zhì)量濃度抗生素對微藻及其生物量有抑制作用.鏈霉素對念珠藻(Nostocales)的最小抑制質(zhì)量濃度是0.28 mg/L,對斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的最小抑制質(zhì)量濃度為21 mg/L[13],對銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)的96 hEC50值為0.28 mg/L,對普通小球藻(Chlorellavulgaris)的96 hEC50值為20.08 mg/L[6].本研究發(fā)現(xiàn),鏈霉素對擬柱孢藻的96 hEC50值為(0.11±0.03) mg/L,四尾柵藻為(12.32±2.73) mg/L,這與前人研究結(jié)果相近,表明較低質(zhì)量濃度的鏈霉素能影響藻類種群的生長繁殖,且藍(lán)藻較綠藻敏感.另有研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)藻的雙分子脂膜系統(tǒng)缺少抗菌層細(xì)胞膜,而綠藻的雙分子脂膜系統(tǒng)能減少鏈霉素向真核藻類的轉(zhuǎn)運(yùn),因此,綠藻對抗生素的敏感性低于藍(lán)藻[6]．

藻類膜系統(tǒng)受到脅迫后會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),活性氧的增加會(huì)引起清除活性氧的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性增加,且活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致丙二醛(MDA)含量上升[6,26].MDA被認(rèn)為是生物對環(huán)境壓力的反應(yīng)產(chǎn)物[6].本研究發(fā)現(xiàn),不同質(zhì)量濃度鏈霉素培養(yǎng)條件下的擬柱孢藻MDA含量顯著降低(p<0.05).而暴露在鏈霉素環(huán)境中的四尾柵藻的MDA含量和SOD活性顯著升高,CAT活性明顯下降(p<0.05).SOD可以將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,過氧化氫可以被過氧化氫酶和過氧化物酶分解[27].顯然,四尾柵藻的SOD活性增加、CAT活性降低有利于抵御ROS帶來的氧化壓力,這與前人的研究一致[28].本研究發(fā)現(xiàn),低質(zhì)量濃度鏈霉素處理擬柱孢藻時(shí),MDA含量顯著降低(p<0.05),表明鏈霉素暴露下沒有引起擬柱孢藻膜脂的嚴(yán)重?fù)p傷.鏈霉素質(zhì)量濃度提高到5 mg/L時(shí),四尾柵藻的MDA含量表現(xiàn)出顯著升高(p<0.05),表明細(xì)胞因脂質(zhì)過氧化受到的損害越來越嚴(yán)重.主要原因可能是鏈霉素對原核與真核生物的影響機(jī)制不同,鏈霉素影響原核生物蛋白質(zhì)的合成,干擾真核生物葉綠體蛋白質(zhì)的合成,并導(dǎo)致脅迫后產(chǎn)生大量ROS[29]．

3.2 鏈霉素對光合系統(tǒng)Ⅱ的影響

光合色素吸收的太陽能在通過電子傳遞鏈時(shí)不斷被損耗[30].本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,擬柱孢藻和四尾柵藻的ΦP0和ΦE0顯著減少,ΦD0,DI0/RC,ABS/CS0和ABS/RC顯著增加.鏈霉素脅迫對光合系統(tǒng)Ⅱ的影響主要是維持能量同化和增強(qiáng)能量消耗[15,31-32].擬柱孢藻和四尾柵藻的Ψ0和TR0/RC變化規(guī)律有明顯差異,這表明四尾柵藻光合系統(tǒng)Ⅱ受體側(cè)的電子傳輸效率較低,因?yàn)椴东@能量而被大量耗散[32].因此,本研究認(rèn)為,當(dāng)擬柱孢藻暴露在鏈霉素環(huán)境時(shí),從QA到QA-的電子傳遞是一個(gè)潛在的抑制靶點(diǎn),容易受到影響.相反,四尾柵藻的抑制靶點(diǎn)在QA-的下游,受影響較小.有研究表明,不同質(zhì)量濃度的污染物對藻類光合系統(tǒng)Ⅱ的影響與藻類QA到QA-的電子傳遞有較大的相關(guān)性,也可能與污染物暴露時(shí)間對藻類的發(fā)育和光合作用等的間接影響有關(guān)[33-35]．

通過反應(yīng)中心的基本能量通量合并到管道模型中的研究發(fā)現(xiàn),ABS/RC和DI0/RC的相關(guān)性明顯增強(qiáng)(圖3),這是因?yàn)閿M柱孢藻和四尾柵藻光合系統(tǒng)Ⅱ?qū)饽艿慕邮漳芰Πl(fā)生了變化[36],本研究認(rèn)為,主要原因是不同光合系統(tǒng)Ⅱ中單位反應(yīng)中心的捕光復(fù)合物的數(shù)量發(fā)生了明顯變化,這與前人的研究一致[37].與擬柱孢藻相比,四尾柵藻的優(yōu)勢在于它可以更好地以熱能形式耗散電子傳遞鏈中的能量.隨著鏈霉素對這兩個(gè)物種作用時(shí)間的增加,微藻的光合結(jié)構(gòu)遭到破壞,單位面積上有活性的反應(yīng)中心數(shù)量減少,光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞受阻,抑制光合作用,導(dǎo)致微藻的生長受阻,這與前人的研究相近[38].主要原因可能是光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致不參與電子傳遞的封閉反應(yīng)中心數(shù)量增加,進(jìn)而引起光合系統(tǒng)Ⅱ供體側(cè)的電子傳遞被抑制[13,39]．

本研究認(rèn)為,擬柱孢藻和四尾柵藻都暴露于鏈霉素環(huán)境時(shí),它們的生長受到抑制,抗氧化機(jī)制和膜系統(tǒng)受到損害.與四尾柵藻相比,擬柱孢藻對鏈霉素更敏感.原核生物和真核生物在光合系統(tǒng)Ⅱ上的生理差異是引起擬柱孢藻和四尾柵藻對鏈霉素敏感性差異的主要原因.深層原因是鏈霉素在光合系統(tǒng)Ⅱ中定位了不同的靶點(diǎn),這可用于區(qū)分原核生物和真核生物光合作用的異質(zhì)性.本研究為進(jìn)一步探討鏈霉素等抗生素壓力下自然生態(tài)系統(tǒng)中藻類群落的組成提供了理論依據(jù)．