犬弓首蛔蟲超氧化物歧化酶的分子特性及原核表達

吳天樂，王磊，王冰楠，孫雪，楊曉偉，周榮瓊

西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 榮昌 402460

犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis,T.canis)是一種廣泛分布于世界各地的人獸共患寄生線蟲.T.canis生活史復雜,其蟲卵隨糞便排出后,在適宜的自然環(huán)境下發(fā)育為感染性蟲卵[1-3].終末宿主攝入感染性蟲卵后,幼蟲經循環(huán)系統(tǒng)移行至腸道發(fā)育為成蟲.非特異宿主攝入感染性蟲卵后,幼蟲不能發(fā)育為成蟲,而是移行到神經、肌肉、內臟等組織器官,成為滯育的感染性L3幼蟲[4-5].人(特別是兒童)因污染的水、土壤、水果和蔬菜中的感染性蟲卵或食入來自非特異性宿主如牛、羊、兔、雞等未煮熟的肉/內臟中滯育的感染性幼蟲而感染.根據(jù)侵入器官、感染強度、遷移持續(xù)時間及年齡和宿主的免疫反應,可以導致多種臨床綜合征[6-7].此外,感染性蟲卵還可引起心肌內膜炎、腦膜炎、眼內炎、哮喘及癲癇等疾病,因此研究犬弓首蛔蟲在獸醫(yī)學及公共衛(wèi)生學上都具有重要意義．

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是一種廣泛存在于動物、植物和微生物體內的金屬酶類[8-10].根據(jù)輔基所結合的金屬離子不同,SOD可分為4種類型,分別為Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD及Ni-SOD[11],只在某些極少數(shù)原核細菌中報道有NiSOD存在[12].SOD是維持抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成過氧化氫(H2O2)和氧(O2),在保護機體細胞免受氧自由基毒害中起到至關重要的作用,且與很多疾病的發(fā)生和發(fā)展緊密相關[13].寄生蟲SOD在抗氧化、免疫逃避和蟲體存活等過程中起著重要的作用.據(jù)報道,大片吸蟲(Fasciolagigantica)分泌排泄蛋白SOD誘導的抗氧化作用與蟲體逃避中性粒細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞產生活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的免疫反應有關[14]; 瘧原蟲(Plasmodiumvinckei) SOD通過降解宿主紅細胞的血紅蛋白產生ROS,以利于紅細胞內瘧原蟲的存活[15]; 克氏錐蟲(Trypanosomacruzi) MnSOD缺乏會加劇線粒體電子傳遞鏈的功能障礙,并造成患病動物心臟的過度氧化損傷[16]．

目前,對于犬弓首蛔蟲超氧化物歧化酶的研究較少.本研究運用分子生物學技術,首先克隆Tc-sod基因并進行序列分析; 隨后構建Tc-sod/pET-32a原核表達載體并制備多克隆抗體,以期為進一步研究Tc-SOD的生物學功能奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 材料

T.canis蟲體采自于西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)院的患病犬.蟲體經過洗滌及形態(tài)學鑒定后冷凍于液氮中.從T.canis雌蟲卵巢收集蟲卵,放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周獲得L2幼蟲; 新西蘭大白兔購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心．

PremixTaq DNA聚合酶、pMD19-T (simple)Vector、限制性內切酶XhoⅠ、BamHI、PrimeScriptTMRT reagent Kit購自TaKaRa公司; Trizol試劑購自Invitrogen(賽默飛)公司; HRP標記的山羊抗兔IgG購自Sangon Biotech公司、Ni-NTA純化樹脂預裝柱、Protein A+G Agarose抗體純化試劑盒購自碧云天生物技術公司、EasyPure?膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京TransGen Biotech(全式金)公司．

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據(jù)T.canis基因組數(shù)據(jù)(GenBank: AAB00227.1),利用Primer-Premier 6.0對Tc-sod進行引物設計.基因克隆引物(F1: 5’-ATGACAGGATTGTTATTGGC-3’; R1: 5’-TTACGGTGCGCCTGAGCTC-3’)和原核表達引物(F2: 5’-CGCGGATCCATGCAAAGACCAAATTCA-3’,引入酶切位點BamHI; R2: 5’-CCGCTCGAGTTACGGTGCGCCTGAGCT-3’,引入酶切位點XhoⅠ),送至重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司進行合成．

1.2.2 總RNA的提取與反轉錄

采用TRIzol法提取T.canis雄蟲、雌蟲和L2幼蟲的總RNA,并用核酸蛋白測定儀檢測其濃度和純度; 以提取的總RNA為模板,按PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書反轉錄合成cDNA．

1.2.3Tc-sod全長基因克隆和序列分析

以反轉錄的T.canis雄蟲、雌蟲和L2幼蟲cDNA為模板進行PCR擴增.PCR反應條件為: 94 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)掃描并記錄結果．

按照EasyPure?膠回收試劑盒說明書切膠回收PCR產物,將回收產物與pMD19-T (simple)Vector載體進行連接,全部連接產物轉化至100 μL大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞中,涂布于含IPTG和X-gal的LB/Amp+瓊脂平板中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)30 min,再倒置培養(yǎng)12～16 h.挑取單菌落接種于含LB/Amp+液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12～24 h,將菌液PCR鑒定為陽性的重組菌液送至重慶擎科興業(yè)生物技術有限公司測序.測序結果利用Clustal Omega軟件進行多重序列比對; 采用MEGA 7.0的鄰接法(Neighbour-joining,NJ法)構建系統(tǒng)進化樹,并用Bootstrap進行進化樹可靠性分析,共1 000個重復．

1.2.4 原核表達載體的構建

按質粒提取試劑盒說明書提取陽性重組質粒Tc-sod/pMD19-T和pET-32a質粒,經限制性內切酶XhoⅠ和BamHI雙酶切,切膠回收目的基因Tc-sod與pET-32a質粒、DNA Ligation Kit進行連接反應.在冰上配制連接反應液: Digested pET-32a DNA 1 μL、Tc-sod4 μL、Ligation Mix 5 μL; 16 ℃反應 1 h.重組表達質粒轉化至DH5α感受態(tài)細胞,經藍白斑篩選后挑取白色單個菌落接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 185 r/min培養(yǎng)12～14 h.利用北京TransGen Biotech(全式金)質粒小提試劑盒提取質粒,進行PCR、雙酶切及測序鑒定．

1.2.5 目的蛋白的表達與純化

挑選陽性菌,經PCR鑒定后提取質粒,并將其轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞,挑單菌落接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 185 r/min振蕩培養(yǎng)3 h,OD600值約為0.8,加入0.4 mmol/L的IPTG 37 ℃誘導8 h; 將菌液置于15 ℃離心機,4 500 r/min離心10 min,收集菌體沉淀,用PBS洗滌離心2～3次后,再用Washing Buffer重懸菌體,并進行超聲破碎、離心,分別取破碎上清液和破碎沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測; 采用Ni-NTA純化目的蛋白,并選擇不同濃度梯度的咪唑洗脫液對目的蛋白進行洗脫,利用SDS-PAGE電泳檢測純化結果．

1.2.6 多克隆抗體的制備及特異性鑒定

利用透析法去除重組蛋白中的咪唑,對蛋白進行濃縮以達到免疫濃度.以新西蘭大白兔(體質量2～2.5 kg)為免疫動物,首免將250 μg重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合,乳化后在頸背部皮下以多點注射的方式對兩只健康新西蘭大白兔進行首免; 初次免疫后每隔2周加強免疫1次,共加強免疫3次.采用250 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1混合,乳化后免疫.末次免疫7 d后采血,離心取血清.將純化后的重組蛋白用包被液稀釋為5 μg/mL,4包被過夜,利用ELISA法檢測抗體效價,酶標儀檢測OD450值,當檢測孔與陰性孔的比值大于(等于)2.1時的最大稀釋倍數(shù)為該血清最高的抗體效價.達到所需效價后采血制備、純化多克隆抗體,以兔抗Tc-SOD多克隆抗體1∶10 000稀釋作為一抗,并用辣根過氧化氫酶(HRP)、標記的羊抗兔IgG(1∶5 000)稀釋作為二抗,進行Western Blot檢測．

2 結果及分析

2.1 Tc-sod全長基因的PCR擴增

經PCR擴增后1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示Tc-sod在雄蟲、雌蟲和L2幼蟲的全長CDS(Coding Sequence)序列大小約為573 bp(圖1A).將凝膠回收產物與pMD19-T(simple)連接,經菌液PCR鑒定后,電泳結果顯示在573 bp處有特異性條帶,陰性對照沒有出現(xiàn)條帶(圖1B)．

圖1 Tc-sod全長基因的PCR擴增

2.2 Tc-SOD蛋白氨基酸多重序列比對及種系發(fā)育進化分析

將陽性克隆的菌液進行測序,并對從雄蟲、雌蟲、L2幼蟲獲得的堿基序列進行分析,結果顯示Tc-sod全長基因的序列長度為573 bp,含有1個完整的CDS,共編碼190個氨基酸殘基; 功能結構域分析結果顯示Tc-SOD蛋白的1～19位氨基酸為信號肽區(qū)域,含有一個跨膜區(qū),46～184位為SOD-Cu保守結構域.將測序獲得的Tc-SOD氨基酸序列與曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni; GenBank NO. AAA29934.1)、異尖線蟲(Anisakissimplex; GenBank NO. AXS78294.1)、美洲板口線蟲(Necatoramericanus; GenBank NO. ETN83232.1),馬來絲蟲(Brugiamalayi; GenBank NO. AAR06638.1)、犬鉤口線蟲(Ancylostomacaninum; GenBank NO. RCN48093.1)的SOD蛋白氨基酸序列進行多重序列比對,結果顯示均含有SOD-Cu保守結構域(圖2紅色方框標記)．

圖2 Tc-SOD蛋白氨基酸序列多重序列比對

將Tc-sod編碼的氨基酸序列與GenBank收錄的馬來絲蟲(B.malayi,GenBank NO. AAR06638.1)、曼氏血吸蟲(S.mansoni,GenBank NO. AAA29934.1)、家鼠(Musmusculus,GenBank NO. CAA59335.1)、膜殼絳蟲(Hymenolepismicrostoma,GenBank NO. CUU99344.1),盤尾絲蟲(Onchocercavolvulus,GenBank NO. CAA57657.1)、犬鉤口線蟲(A.caninum,GenBank NO.RCN48093.1)、李斯特菌(Listeriaivanovii,GenBank NO. PZG50121.1)、豬帶絳蟲(Taeniasolium,GenBank NO.AEL75047.1)、豬蛔蟲(Ascarissuum,GenBank NO. ADY46004.1)、異尖線蟲(A.simplex,GenBank NO.AXS78294.1)、有齒食道口線蟲(Oesophagostomumdentatum,GenBank NO. KHJ97909.1)氨基酸序列進行比對并構建進化樹(圖3),結果顯示Tc-SOD與馬來絲蟲(B.malayi,GenBank NO. AAR06638.1)處于同一分支,表明其進化關系較近．

圖3 蛋白Tc-SOD氨基酸種系發(fā)育進化分析

2.3 Tc-sod/pET-32a表達質粒構建

將測序成功的Tc-sod序列亞克隆至pET-32a,經菌液PCR檢測,可見1%瓊脂凝膠電泳結果具有清晰明亮的條帶,且大小與預期相符(圖4B); 經雙酶切鑒定,結果表明已成功連接至pET-32a(圖4C)．

圖4 Tc-sod/pET-32a表達質粒構建

2.4 Tc-SOD重組蛋白的誘導表達及純化

將陽性重組質粒轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞后挑取單個菌落培養(yǎng),于37 ℃經IPTG誘導后進行SDS-PAGE分析,結果顯示表達產物大多數(shù)都是以可溶性蛋白的形式存在于上清液中,只有少量存在于包涵體內(圖5A); 重組蛋白Tc-SOD大小約為37 ku; 利用Ni-NTA對重組蛋白進行純化,結果表明純化后的蛋白經SDS-PAGE檢測無明顯雜帶(圖5B),蛋白具有較高的濃度和純度; 且在篩選純化條件時,選擇70 mmol/L咪唑洗脫液進行洗脫的蛋白濃度更高,效果更好(圖6A)．

圖5 Tc-SOD重組蛋白的誘導表達及純化

2.5 多克隆抗體的特異性鑒定

將純化后的重組蛋白Tc-SOD包被96孔板,免疫前的血清為陰性對照,利用間接ELISA法測定兔抗Tc-SOD多克隆抗體的效價,結果顯示抗體滴度>1∶320 000,具有較高的效價,可用于后續(xù)試驗.Western Blot檢測結果顯示兔抗Tc-SOD多克隆抗體較高,能和重組Tc-SOD蛋白特異性結合,表明其具有較好的特異性．

圖6 Tc-SOD蛋白純化及多克隆抗體的特異性鑒定

3 討論

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內普遍存在的一類重要金屬抗氧化酶,在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用,其經典功能是清除體內超氧陰離子并參與活性氧自由基代謝.研究表明,SOD與抗氧化、心血管疾病、腫瘤及免疫逃避等密切相關[17-19].此外,SOD還參與生物機體的多種生理/病理反應.在小鼠體內SOD參與調節(jié)乳腺發(fā)育所需的蛋白質和轉錄因子對氧化應激的不同敏感反應,被證明與小鼠的乳腺發(fā)育及哺乳有關[20].在微生物中ROS細胞水平由抗氧化酶和小分子抗氧化劑控制,當細菌被免疫效應細胞吞噬后暴露在氧化應激環(huán)境下,細菌將能量從細胞質NADPH轉移到抗氧化酶中,從而增強其毒力作用[21]．

寄生蟲SOD具有抗氧化、免疫逃避和蟲體存活等多種生物學功能.寄生蟲在寄生過程中既有宿主作為防御系統(tǒng)產生的ROS,也有蟲體代謝產生的ROS,因此清除這雙重來源的ROS成為寄生蟲能夠建立長期寄生的重要前提,而ROS的產生被認為是蟲體針對宿主產生免疫逃避的一個重要防御機制.盤尾絲蟲(Onchocercavolvulus)微絲蚴和成蟲在人體遷移和寄居過程中通過SOD清除有毒自由基,以利于蟲體存活[22].Lalrinkima等[14]報道大片吸蟲SOD誘導的抗氧化作用與蟲體逃避巨噬細胞產生活性氧(ROS)的免疫反應有關．

本研究發(fā)現(xiàn)犬弓首蛔蟲SOD含有保守的SOD-Cu結構域.SOD-Cu作為銅伴侶能介導特定細胞內信號分子的傳遞途徑,其主要功能是將Cu2+輸送到Cu/Zn SOD不同細胞內的特定靶點,對其功能的發(fā)揮至關重要.Cu2+與酶活性水平也有密切關系.在哺乳動物中缺乏銅伴侶的小鼠組織SOD基因活性明顯減少,對氧化應激敏感程度更高[23].銅伴侶在介導氧化應激反應過程中參與激活SOD活性調節(jié)機制,通過調節(jié)其表達水平以應對氧化環(huán)境的變化[24].Feng等[25]證明甲殼動物的SOD被Cu2+激活后,在免疫調節(jié)反應中發(fā)揮重要作用．

在重組蛋白表達系統(tǒng)中,大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最為成熟的原核表達系統(tǒng).本研究所選擇的pET-32a載體表達的目的蛋白帶有組氨酸標簽,能通過鎳柱有效純化重組蛋白.對表達條件進行優(yōu)化,在37 ℃誘導8 h,能得到大量的可溶性重組蛋白; 通過鎳柱親和層析純化,最終在70 mmol/L咪唑濃度洗脫時得到的目的蛋白條帶單一,表明重組蛋白具有較高的濃度和純度.將純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,通過間接ELISA法對制備的抗Tc-SOD多克隆抗體效價及抗原特異性進行鑒定.結果顯示本研究成功制備出了抗Tc-SOD多克隆抗體,效價高達1>320 000.Western Blot檢測顯示制備的多克隆抗體能夠識別Tc-SOD,具有較好的特異性．

4 結論

犬弓首蛔蟲Tc-sod基因全長序列為573 bp,共編碼190個氨基酸; 成功構建了Tc-sod/pET-32a原核表達載體,得到了可溶性重組蛋白,免疫新西蘭大白兔并得到了高效價的多克隆抗體; Western Blot檢測顯示抗體特異性較高.本試驗為后續(xù)Tc-SOD的生物學功能研究奠定了基礎．