CD138蛋白在軟組織肉瘤中的表達(dá)

張良，張鵬鵬，龐鈺文，李真真，劉倩倩，商浩，王曉萌，李倩茹，劉春霞，李鋒，2

（1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子832002；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院病理科，北京100020）

CD138（SDC1/Syndecan-1）蛋白是Syndecan 家族中成員之一，在成熟組織中主要在上皮細(xì)胞表達(dá)，對(duì)促進(jìn)上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及與生長(zhǎng)因子反應(yīng)的相互作用占據(jù)著不可或缺的地位。在血液淋巴系統(tǒng)中，特異性的表達(dá)于前體B 細(xì)胞和漿細(xì)胞。同時(shí)其作為一種細(xì)胞表面蛋白多糖，在細(xì)胞增殖和分化以及細(xì)胞間粘附中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，CD138 蛋白表達(dá)高低可能參與上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程，與組織學(xué)分級(jí)和預(yù)后不良相關(guān)[1，2]。

CD138 蛋白在多種腫瘤中表達(dá)，但表達(dá)水平不一，在乳腺癌、卵巢癌和尿路上皮癌等腫瘤中高表達(dá)；但是在肝細(xì)胞癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和前列腺癌中卻呈低表達(dá)。CD138 蛋白可作為多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要指標(biāo)[3]，也通常作為漿細(xì)胞分化標(biāo)志物運(yùn)用于未分化惡性腫瘤的診斷中。

近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD138 蛋白可表達(dá)于纖維肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤[4]，同時(shí)研究表明在脂肪肉瘤中CD138 基因可調(diào)節(jié)脂肪形成，但相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道還不多。因此，本研究旨在通過免疫組織化學(xué)來研究CD138 在軟組織肉瘤中的表達(dá)情況，并運(yùn)用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析肉瘤患者無病生存率和總體生存率狀況與CD138 基因表達(dá)高低之間的關(guān)系，為了解軟組織肉瘤的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集1972-2016年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科軟組織肉瘤213 例，其中包括42 例平滑肌肉瘤，38 例隆突性皮膚纖維肉瘤，34 例未分化多形性肉瘤，31 例脂肪肉瘤，24 例橫紋肌肉瘤，18 例尤文肉瘤，18 例纖維肉瘤和8 例上皮樣肉瘤，同時(shí)收集到21 例正常脂肪組織。所有樣本由多年從事軟組織腫瘤病理診斷的高年資醫(yī)師復(fù)診，參與研究的所有患者均提供書面知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 制備組織芯片

核對(duì)選取的 8 種軟組織肉瘤，在HE 切片上選出樣本所需典型區(qū)域并圈記，同時(shí)在蠟塊上相應(yīng)區(qū)域標(biāo)記為組織芯片構(gòu)造位置，使用組織芯片制作儀（MiniCore，Mitogen 公司）構(gòu)建組織芯片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判讀

CD138 蛋白在軟組織肉瘤中的表達(dá)采用EnVision 二步法免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行檢測(cè)，CD138一抗（鼠抗，Santa Cruz Biotechnology，USA）工作濃度1∶50，采用Ph6.0 枸櫞酸煮沸15 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗4℃冰箱孵育過夜，后續(xù)經(jīng)過二抗孵育、DAB顯色、水洗、中性樹膠封片等步驟。漿細(xì)胞作為陽性內(nèi)部對(duì)照，當(dāng)不存在漿細(xì)胞時(shí)，使用人小腸組織切片作為陽性對(duì)照，磷酸鹽緩沖鹽水作為空白對(duì)照。

結(jié)果判讀采用雙盲法：由兩位高年資病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲閱片，結(jié)果取平均值。CD138 蛋白陽性表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比分為：0 分（≤5%），1 分（6% -25%），2 分（26%-50%），3 分（51%-75%）和4 分（＞ 75%）；根據(jù)著色強(qiáng)度分為無著色0 分，弱黃色1 分，黃色2 分和棕黃色3 分；二者乘積來進(jìn)行半定量評(píng)分。得分0或1 分為陰性組，2-4 分為+ 弱陽性組，5-12 分為2+ 強(qiáng)陽性組。結(jié)果使用陽性細(xì)胞所占百分比和著色強(qiáng)度的乘積作為陽性強(qiáng)弱的判斷標(biāo)準(zhǔn)，來判斷陽性強(qiáng)度。

1.3 CD138 基因表達(dá)與肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

為了解CD138 基因表達(dá)高低與肉瘤患者預(yù)后之間關(guān)系，我們使用基因表達(dá)譜分析交互式分析（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/）[5]網(wǎng)站進(jìn)行分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，以此來了解CD138 基因表達(dá)與肉瘤患者之間的臨床預(yù)后意義。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0 軟件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Pearson’sχ2檢驗(yàn)來分析各組CD138 表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software，CA，United States）作圖。

2 結(jié)果

2.1 CD138蛋白在軟組織肉瘤亞型中的表達(dá)

在八種軟組織肉瘤中，CD138 蛋白呈現(xiàn)出不同程度的表達(dá)（染色結(jié)果總結(jié)見表1），CD138 蛋白在軟組織肉瘤中，18.8%呈現(xiàn)1+ 弱陽性，12.2% 呈現(xiàn)2+ 強(qiáng)陽性。在8 種軟組織肉瘤中，CD138 蛋白均有不同程度的著色，除了特異性的細(xì)胞膜染色，在細(xì)胞質(zhì)中也出現(xiàn)著色。CD138 蛋白在橫紋肌肉瘤中主要著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜（圖1A）；在未分化多形性肉瘤主要著色于細(xì)胞質(zhì)中（圖1B）；在纖維肉瘤主要著色于細(xì)胞質(zhì)中（圖1C）；在隆突性皮膚纖維肉瘤主要著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中（圖1D）；在平滑肌肉瘤主要著色于細(xì)胞膜中（圖1E）；在尤文氏肉瘤主要著色于細(xì)胞質(zhì)（圖1F）；在上皮樣肉瘤主要著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中（圖1G）。進(jìn)一步分析染色數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其中一種肉瘤與其他七種肉瘤相比時(shí)，脂肪肉瘤差異性高表達(dá)（χ2=30.01，P＜0.001）。

表1 CD138 蛋白在軟組織肉瘤亞型中的表達(dá)Tab.1 Expression of CD138 protein in soft tissue sarcoma subtypes

圖1 CD138 蛋白在軟組織肉瘤和正常脂肪組織中的免疫組織化學(xué)染色（×200）Fig,1 Immunohistochemical staining of CD138 protein in soft tissue sarcoma and normal adipose tissue （×200）

2.2 CD138 蛋白在脂肪肉瘤各亞型中的表達(dá)

通過對(duì)脂肪肉瘤亞型染色分析，CD138 蛋白主要在去分化脂肪肉瘤中表達(dá)（圖2A），在分化良好的脂肪肉瘤中陰性染色率為63.3%（9/14），而在去分化脂肪肉瘤中為5.9%（1/17）；2+ 陽性染色率在分化良好的脂肪肉瘤中為0，而在去分化脂肪肉瘤中為70.6%（12/17）。CD138 蛋白在分化良好的脂肪肉瘤中主要著色于細(xì)胞膜（圖2B），而在去分化脂肪肉瘤主要著色于細(xì)胞質(zhì)（圖2C）。CD138 蛋白在正常脂肪組織中鮮有表達(dá)，陽性著色于細(xì)胞膜（圖1H）。

與正常脂肪組織相比，CD138 蛋白在脂肪肉瘤中差異性高表達(dá)（χ2=12.668，P=0.002），提示CD138蛋白可能作為脂肪肉瘤的特異性標(biāo)記物。與分化良好的脂肪肉瘤相比，CD138 蛋白在去分化脂肪肉瘤中顯著性高表達(dá)（χ2=18.393，P＜0.001）。

圖2 CD138 蛋白在脂肪肉瘤亞型中的免疫組織化學(xué)染色（×200）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD138 protein in liposarcoma subtypes （×200）

2.3 CD138 基因表達(dá)與肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

由于軟組織肉瘤病例數(shù)少，本研究通過GEPIA生物信息學(xué)網(wǎng)站分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中肉瘤患者生存狀況與CD138 基因表達(dá)高低之間的關(guān)系，結(jié)果圖3顯示不論是無病生存率還是總體生存率均與CD138基因表達(dá)無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

圖3 CD138 基因在肉瘤患者中的生存分析Fig.3 Survival analysis of CD138 gene in sarcoma patients

3 討論

軟組織肉瘤是一類間葉源性的惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的1%，兒童惡性腫瘤的15%，最常見的軟組織肉瘤包括纖維肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤[4，5]。雖然近年來分子生物學(xué)研究飛速發(fā)展，但軟組織肉瘤病因機(jī)制仍未明了，遺傳學(xué)及基因改變?cè)谌饬霭l(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著很大的作用。MDM2 和p53 基因可作為軟組織肉瘤獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，N-myc、SAS 和CDK4 基因擴(kuò)增也是軟組織肉瘤所特有的指標(biāo)，免疫組織化學(xué)已在軟組織肉瘤診斷和治療方面表現(xiàn)出了重要的價(jià)值。

CD138 蛋白是Syndecan 跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的一員，作為一種細(xì)胞表面蛋白多糖通常參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。在諸多腫瘤中發(fā)揮著重要作用，其中包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞間粘附作用，同時(shí)與腫瘤分期、分級(jí)存在相關(guān)性，表明其在腫瘤中重要的研究?jī)r(jià)值[6，7]。CD138 蛋白在上皮組織中廣泛表達(dá)，而在前B 淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞上選擇性表達(dá)，在乳腺癌、膀胱、卵巢、前列腺以及血液系統(tǒng)惡性腫瘤中參與腫瘤生物學(xué)進(jìn)程作用研究廣泛。惡性腫瘤的特征在于浸潤(rùn)和擴(kuò)散，該過程的發(fā)展涵蓋了細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的粘附減少，腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜滲透擴(kuò)散到血管、淋巴管或周圍組織。該過程涉及包括CD138 這一因子，從而與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和歸巢轉(zhuǎn)移相關(guān)。CD138 蛋白在許多惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，引起細(xì)胞接觸性抑制，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖力，并促使其侵襲性缺失[8]。CD138 蛋白在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可抑制腫瘤細(xì)胞間與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性，進(jìn)而引起接觸性抑制的缺失，增強(qiáng)增殖能力和侵襲性；這些過程都有可能與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[9，10]。沉默CD138 基因表達(dá)可影響子宮內(nèi)膜癌[11]和骨髓瘤[2]的細(xì)胞凋亡，提示CD138 基因在腫瘤中可能發(fā)揮著重要的作用。

CD138 蛋白在軟組織腫瘤中也有少量報(bào)道，包括纖維肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、隆突性皮膚纖維肉瘤、尤文肉瘤、上皮樣肉瘤和平滑肌肉瘤[12-17]。在一項(xiàng)對(duì)包括正常組織和各種良惡性上皮和間葉性腫瘤共1754 個(gè)樣本的CD138 蛋白表達(dá)研究中，發(fā)現(xiàn)CD138 蛋白在正常組織和大多數(shù)上皮腫瘤中廣泛表達(dá)，而在很少數(shù)的間葉性腫瘤中表現(xiàn)出弱膜或細(xì)胞質(zhì)染色，包括尤文肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤及橫紋肌肉瘤[12]。這與本研究中，尤文肉瘤16.7%（3/18）、纖維肉瘤16.7%（3/18）、橫紋肌肉瘤8.3%（2/24）較少數(shù)的樣本也表現(xiàn)出弱膜或細(xì)胞質(zhì)染色的結(jié)果是一致的。先前研究發(fā)現(xiàn)在尤文肉瘤中，CD138蛋白可表現(xiàn)出強(qiáng)烈彌漫表達(dá)（100.0%，2/2）[13]、弱細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)染色或者陰性[12]，與本研究11.1%（2/18）強(qiáng)陽性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色，72.2%（13/18）陰性表達(dá)的結(jié)果相符。研究顯示，CD138 蛋白促進(jìn)人纖維肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[18]，提示CD138 基因可能在纖維肉瘤中可能扮演著促癌基因的角色，但在本實(shí)驗(yàn)組織樣本中發(fā)現(xiàn)CD138 蛋白在纖維肉瘤中的表達(dá)率僅為27.8%（5/18），這可能與樣本量有關(guān)。在上皮樣肉瘤中，CD138 蛋白表現(xiàn)出細(xì)胞膜陽性（5/5）[16]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果37.5%（3/8）陽性表達(dá)有些出入。有研究報(bào)道稱，軟組織肉瘤骨轉(zhuǎn)移樣本CD138 蛋白高表達(dá)，并且與各種參與生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)相關(guān)。也有學(xué)者在小鼠白色脂肪組織中檢測(cè)到CD138 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)，這與本研究中正常脂肪組織的弱膜染色（14.3%，3/21）的結(jié)果是一致的。

當(dāng)與其他七種軟組織肉瘤相比時(shí)，脂肪肉瘤差異性高表達(dá)（χ2=30.01，P＜0.001）。與正常脂肪組織相比，CD138 蛋白在脂肪肉瘤中差異性高表達(dá)（χ2=12.668，P=0.002），提示CD138 蛋白可能作為脂肪肉瘤的特異性標(biāo)記物。一項(xiàng)關(guān)于CD138 基因調(diào)節(jié)脂肪形成在脂肪肉瘤中的研究，通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)在分化良好的脂肪肉瘤中表現(xiàn)為陰性（0/6），在大多數(shù)去分化脂肪肉瘤病例（10/13）顯示CD138 蛋白細(xì)胞質(zhì)陽性染色：46%（6/13） 觀察到弱染色（1+），而中等染色（2+） 到強(qiáng)染色為30%（4/13）；作者進(jìn)一步在脂肪肉瘤兩種亞型中運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)CD138 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)去分化脂肪肉瘤中CD138 mRNA 高于分化良好的脂肪肉瘤[19]。在本研究中，分化良好的脂肪肉瘤中僅55.6%（5/9）表現(xiàn)出了細(xì)胞膜弱染色（1+）；而大多數(shù)去分化脂肪肉瘤病例（16/17）顯示CD138 蛋白的細(xì)胞質(zhì)陽性染色，70.6%（12/17） 表現(xiàn)出強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)染色；兩種亞型CD138 蛋白表達(dá)差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.393，P＜0.001）。脂肪肉瘤起源于脂肪細(xì)胞，目前國際分類中的三種脂肪組織腫瘤的分類是有區(qū)別的：（1）良性：主要是脂肪瘤；（2）中間性：分化良好的脂肪肉瘤（well-differentiated liposarcomas，WDLPS）；（3）惡性：去分化脂肪肉瘤（dedifferentiated liposarcomas，DDLPS），粘液樣脂肪肉瘤和多形性脂肪肉瘤。常規(guī)蘇木素- 伊紅（HE）染色并不能很好地診斷脂肪肉瘤，免疫組織化學(xué)的發(fā)展使得診斷精確度得以提高，但可用于診斷脂肪肉瘤的免疫組織化學(xué)標(biāo)記物很少。超過40%DDLPS 可能會(huì)復(fù)發(fā)，標(biāo)準(zhǔn)化療治愈率低，5年死亡率為30%，對(duì)新治療靶點(diǎn)的需求十分迫切。因而，研究脂肪肉瘤的特定免疫組化標(biāo)記物，將可能為鑒別脂肪肉瘤提供很好的幫助。

通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中肉瘤患者CD138 基因表達(dá)與生存狀況之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，雖然CD138 基因低表達(dá)患者生存與高表達(dá)患者生存之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但我們?nèi)匀幌嘈?，只要?shù)據(jù)量足夠大，CD138低表達(dá)患者的生存率比高表達(dá)患者終會(huì)有相關(guān)性。

4 結(jié)論

CD138 蛋白在各型軟組織肉瘤中均有不同程度表達(dá)，脂肪肉瘤組織中的表達(dá)與其組織學(xué)亞型相關(guān)，提示CD138 蛋白可能參與脂肪肉瘤腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相信隨著分子生物學(xué)和癌基因研究的不斷發(fā)展，CD138 蛋白將對(duì)軟組織肉瘤的預(yù)防、治療和預(yù)后有全面深入了解。