基于核苷酸序列的羅非魚(yú)羅湖病毒分子流行病學(xué)分析

劉助紅　張璜　唐玲　劉賢旭　林潔文　吳林

摘 要：通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里的羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，了解羅湖病毒在全球的流行情況和中國(guó)羅非魚(yú)（tilapia）養(yǎng)殖中羅湖病毒的感染情況。該研究將第3個(gè)片段的序列比對(duì)結(jié)果中的羅湖病毒分成12個(gè)簇群，通過(guò)對(duì)片段進(jìn)行motif序列富集，顯示motif序列每個(gè)位點(diǎn)的堿基。對(duì)從廣東各地區(qū)羅非魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)采集到的302份樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，均未檢測(cè)出羅湖病毒陽(yáng)性，并且顯示motif序列位點(diǎn)的堿基非常穩(wěn)定。通過(guò)對(duì)羅湖病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)分析，中國(guó)雖未有羅湖病毒流行的趨勢(shì)，但在進(jìn)出口貿(mào)易中仍要嚴(yán)格防控羅湖病毒的輸入，并應(yīng)對(duì)這些非常保守的motif的相關(guān)功能進(jìn)行深入研究。

關(guān)鍵詞：羅非魚(yú)（tilapia）；羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）；分子流行病學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.125文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

羅非魚(yú)（tilapia）因價(jià)格實(shí)惠、富含蛋白質(zhì)、抗病能力強(qiáng)和耐高密度養(yǎng)殖而成為世界上主要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[1-2]。中國(guó)是世界上最大的羅非魚(yú)養(yǎng)殖國(guó)，已先后從國(guó)外引入多個(gè)羅非魚(yú)品種，年產(chǎn)量超過(guò)160萬(wàn)t，羅非魚(yú)的養(yǎng)殖一般是采用土塘等養(yǎng)殖模式，伴隨著高密度和不可控的養(yǎng)殖條件，導(dǎo)致羅非魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中各種疾病不斷出現(xiàn)[3-4]。近年來(lái)，羅湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）的出現(xiàn)給羅非魚(yú)的養(yǎng)殖造成了極大的威脅[5]。早在2009年，以色列就報(bào)道了養(yǎng)殖羅非魚(yú)的大量死亡的現(xiàn)象，隨后在厄瓜多爾、埃及、馬來(lái)西亞、哥倫比亞、泰國(guó)、印度等國(guó)家以及中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)有TiLV感染的情況[6-12]。但直到2014年，羅湖病毒才被正式鑒定新的羅湖病毒科[13]。羅湖病毒目前基本形成了以菲律賓、印度、泰國(guó)及以色列等4個(gè)國(guó)家為中心的流行圈，調(diào)查顯示中國(guó)的羅湖病毒顯示來(lái)自厄瓜多爾。同時(shí)，不同地區(qū)的序列間堿基存在一定的突變，但從氨基酸水平來(lái)看，絕大部分的突變是無(wú)益突變。羅湖病毒為單鏈RNA病毒，其基因組含有10個(gè)片段，除了第1片段跟其他病毒有弱同源性外，其他9個(gè)均找不到同源序列[2]。據(jù)報(bào)道，它可以感染所有生長(zhǎng)階段的羅非魚(yú)[14]。2017年5月，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）、亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)（NACA）、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）等國(guó)際組織均針對(duì)TiLV發(fā)布公告或預(yù)警，要求所有成員國(guó)在羅非魚(yú)的養(yǎng)殖和進(jìn)出口過(guò)程中加強(qiáng)檢疫和防范[15-16]。目前，關(guān)于羅湖病毒的來(lái)源和傳播途徑還沒(méi)有一個(gè)確切的結(jié)論，Dominique等人分析了2017年導(dǎo)致孟加拉國(guó)羅湖魚(yú)大量死亡的羅湖病毒疑似來(lái)源于與泰國(guó)羅非魚(yú)孵化場(chǎng)頻繁的進(jìn)出口貿(mào)易[17]。文章通過(guò)對(duì)全球已有羅湖病毒的保守核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析和對(duì)廣東省羅非魚(yú)養(yǎng)殖相關(guān)養(yǎng)殖場(chǎng)的羅非病毒樣本進(jìn)行分子檢測(cè)，從分子水平分析羅湖病毒在全球范圍的流行和進(jìn)化情況，為羅湖病毒在中國(guó)的防控提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

根據(jù)前期序列分析，選取羅湖病毒的保守序列第3個(gè)片段序列（GenBank：KJ605629）進(jìn)行生物學(xué)信息分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與第3個(gè)片段序列的相關(guān)序列共93條。具體序列的相關(guān)信息見(jiàn)表1。另外，從廣東省各地區(qū)羅非魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)采集了302份相關(guān)的樣本用于感染情況分析，具體的樣本信息見(jiàn)表2。

1.2 試驗(yàn)方法

用生物信息學(xué)軟件DNASTAR對(duì)上述序列及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比較和分析，采用MEGA 4.0進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)繪制、堿基和氨基酸殘基突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)，對(duì)序列進(jìn)行選擇壓力和保守位點(diǎn)的分析。另外，采用“SC/T 7024-2021 羅非魚(yú)湖病毒病監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范”推薦的檢測(cè)步驟對(duì)采集的樣本進(jìn)行處理和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，以便具體分析羅湖病毒在廣東省的實(shí)際感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅湖病毒的分布情況

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)第三個(gè)核酸片段在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有任何同源序列，該序列編碼的蛋白功能目前還未了解清楚，序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。由于羅湖病毒最早發(fā)生在以色列，對(duì)其研究也較多，故從該國(guó)分離鑒定上傳的序列是最多的，達(dá)到了近30%，其次為印度和泰國(guó)。泰國(guó)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，每年都有羅湖病毒被從不同地區(qū)分離鑒定。隨著羅湖病毒的流行，數(shù)據(jù)庫(kù)顯示全球總共有14個(gè)國(guó)家先后發(fā)現(xiàn)了羅湖病毒的存在，并且病毒的分布呈現(xiàn)區(qū)域化的趨勢(shì)，尤其是在東南亞區(qū)域（圖1）。中國(guó)雖然羅非魚(yú)養(yǎng)殖面積大，但目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該病大規(guī)模的流行，深圳海關(guān)和廈門(mén)海關(guān)在中國(guó)進(jìn)出口的羅非魚(yú)及相關(guān)產(chǎn)品中均未檢出羅湖病毒。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

基于羅湖病毒的第3個(gè)核苷酸片段序列采用最小快速進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)得到圖2所示的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)可以將已鑒定的毒株歸類(lèi)為12個(gè)簇群：（1）2018年從越南分離到的羅湖病毒株ON376584（2018）為單獨(dú)進(jìn)化的毒株（Group 1），該毒株與其他毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。泰國(guó)鑒定的KY381578（2016）及MN687697（2014）雖然與其他毒株有共同的進(jìn)化祖先，但在后期的演化中也分別單獨(dú)進(jìn)化成了一個(gè)簇群（Group 7和8）。（2）2019年從菲律賓發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)LC504279（2019）OK274115（2019）成為一個(gè)簇群（Group 2）。（3）2019年從菲律賓分離的另外兩個(gè)毒株OK274114（2019）、OK274113（2019）自成一個(gè)簇群（Group 3）。（4）菲律賓剩下的3個(gè)毒株OK274111（2018）、OK274112（2019）、OK274110（2020）與埃及的2個(gè)KY817384（2015）、KY817385（2015）成為一個(gè)簇群（Group 4）。（5）泰國(guó)不同年份分離的11個(gè)毒株與越南2020年鑒定的毒株ON376574（2020）成為一個(gè)簇群（Group 5）。（6）哥倫比亞唯一毒株OL539823（2018）、印度的MK752932（2019）、MN094791（2019）、馬來(lái)西亞MN970195（2019）和泰國(guó)的OL539818（2018）成為一個(gè)簇群（Group 6）。（7）以色列2018年鑒定的毒株與印度尼西亞、泰國(guó)、孟加拉國(guó)及美國(guó)鑒定的共25個(gè)毒株成為一個(gè)簇群（Group 9）。（8）印度鑒定的12個(gè)毒株成為一個(gè)簇群（Group 10）。（9）中國(guó)、厄瓜多爾、印度、以色列、馬來(lái)西亞、秘魯?shù)冉M成一個(gè)簇群（Group 11）。（10）泰國(guó)鑒定的其他12個(gè)毒株成為一個(gè)簇群（Group 12）。從分布的國(guó)家來(lái)看，印度和泰國(guó)的毒株型是最多的，都達(dá)到3種。這兩個(gè)國(guó)家也是羅湖病毒疾病大量流行的國(guó)家。以色列雖然也是大面積爆發(fā)羅湖病毒疾病的國(guó)家，但毒株比較單一，病毒變異較小。從每個(gè)簇群所分布的國(guó)家來(lái)看，第11個(gè)簇群的羅湖病毒類(lèi)型分布最為廣泛，在全球六個(gè)國(guó)家均有涉及，其次是第6個(gè)簇群，分別分布在全球四個(gè)國(guó)家。在進(jìn)化程度上，中國(guó)的毒株與厄瓜多爾和秘魯?shù)葒?guó)家的毒株有較近的親緣關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示中國(guó)的毒株是從厄瓜多爾的毒株進(jìn)化而來(lái)，這與中國(guó)在水產(chǎn)行業(yè)上與這些國(guó)家有較多的貿(mào)易關(guān)系是分不開(kāi)的。另外，要特別留意的是越南新出現(xiàn)的毒株，它與以往的毒株在進(jìn)化上沒(méi)有相互關(guān)系，極有可能是通過(guò)病毒重組或變異形成的新的毒株，目前，關(guān)于它的毒力和傳染性等情況都沒(méi)有太多的研究。

2.2.2 羅湖病毒在全球的流行分析

從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)看，羅湖病毒雖然最早在以色列被報(bào)道，但從分子進(jìn)化水平上來(lái)看，它不是最早出現(xiàn)的。羅湖病毒最開(kāi)始起源于菲律賓，因此，以發(fā)育樹(shù)的結(jié)點(diǎn)作為地理位置的代表國(guó)家，可繪制如下羅湖病毒在全球的傳播路徑圖（圖3）。傳播網(wǎng)絡(luò)顯示，羅湖病毒目前基本形成了以菲律賓、印度、泰國(guó)及以色列等4個(gè)國(guó)家為中心的流行圈，從這些國(guó)家向外圍擴(kuò)散，中國(guó)發(fā)現(xiàn)的羅湖病毒顯示來(lái)自厄瓜多爾。

2.2.3 堿基突變分析

對(duì)該序列中所有的堿基突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如

圖4所示，A、C、G、T四種堿基的突變率為31%、40%、29%、32%。在所有的突變中，大部分為C與T之間的突變，其次為G與C之間的突變。堿基的突變往往帶來(lái)的是蛋白質(zhì)氨基酸的改變，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變病毒的致病力或者傳播能力。

2.3 氨基酸序列分析

羅湖病毒的第三個(gè)片段編碼的蛋白質(zhì)在病毒增殖的過(guò)程中發(fā)揮的作用目前尚不清楚，該片段共編碼420個(gè)氨基酸，通過(guò)對(duì)從各地分離毒株的該片段編碼的氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各國(guó)毒株的該氨基酸序列非常保守（圖5），相似性最低也達(dá)96.9%，這可能與該蛋白自身的功能有非常重要的關(guān)系。因此，從氨基酸水平分析已有毒株的進(jìn)化程度是分不開(kāi)的。

2.4 基因序列的保守位點(diǎn)分析

應(yīng)用在線軟件https：//meme-suite.org/meme/doc/meme.html對(duì)該基因片段的motif序列進(jìn)行查找富集，獲得如下結(jié)果（圖6），在找到的5個(gè)motif序列中，每個(gè)位點(diǎn)的堿基基本上都是非常穩(wěn)定的。然而，關(guān)于這些motif序列的功能在數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未發(fā)現(xiàn)。

2.5 羅湖病毒檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)廣東各地區(qū)采集的302份羅湖病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羅湖病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，進(jìn)一步說(shuō)明羅湖病毒在中國(guó)尚未造成大面積的流行，與前期的分子流行病學(xué)分析結(jié)果是一致的，這與中國(guó)出入境管理部門(mén)在進(jìn)出口中的對(duì)羅湖病毒的嚴(yán)格管理和檢疫是分不開(kāi)的。

3 討論

根據(jù)全球已有的羅湖病毒的報(bào)道，目前羅湖病毒主要在印度、泰國(guó)、以色列等國(guó)家流行，病毒的流行往往具有區(qū)域性，同時(shí)會(huì)隨著進(jìn)出口貿(mào)易等在不同國(guó)家之間流行，羅湖病毒從2009年發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)過(guò)了十余年的進(jìn)化和重組，每個(gè)地區(qū)的病毒株已經(jīng)呈現(xiàn)出明顯的分子水平差異，重組往往會(huì)產(chǎn)生新的毒株。羅湖病毒雖然不會(huì)對(duì)人類(lèi)的健康造成威脅，但是所造成的羅非魚(yú)的死亡嚴(yán)重影響了人類(lèi)的食品安全和健康。對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物類(lèi)的大部分病毒，都沒(méi)有合適的藥物可以治療，因此，如何預(yù)防成為控制羅湖病毒肆意傳播的關(guān)鍵。

Chaput等人分析了羅湖病毒BD-2017毒株的10個(gè)片段的保守性，發(fā)現(xiàn)片段8、9、10是變異最小的，但是這三個(gè)片段的長(zhǎng)度均在500bp以下，不利于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和流行性分析[17]。在Chaput關(guān)于羅湖病毒的分析中，作者只分析了孟加拉國(guó)、泰國(guó)、秘魯、厄瓜多爾及以色列7個(gè)毒株的親緣關(guān)系，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析得知孟加拉國(guó)的毒株可能來(lái)自泰國(guó)，南美洲的毒株和以色列的成為一個(gè)簇群，作者推測(cè)是由于孟加拉國(guó)在2012至2017年期間頻繁從泰國(guó)的孵化場(chǎng)進(jìn)口魚(yú)苗導(dǎo)致的，這與文章分析的結(jié)果也是一致的。但是，文章采取全球廣泛使用的羅湖病毒第3個(gè)片段進(jìn)行分析，在數(shù)據(jù)庫(kù)里關(guān)于羅湖病毒的信息也是最全面的，分別對(duì)全球14個(gè)國(guó)家或地區(qū)的93個(gè)羅湖病毒進(jìn)行分析，這對(duì)于從全球水平分析羅湖病毒的流行情況更加準(zhǔn)確和具有代表性。

對(duì)于功能性分析來(lái)說(shuō)，氨基酸序列的比對(duì)比核苷酸的序列比對(duì)更加可靠，因?yàn)槟硞€(gè)氨基酸的改變或替換對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著重要的影響，但是，羅湖病毒的第三個(gè)片段的氨基酸序列比對(duì)卻顯示，氨基酸的序列非常保守，說(shuō)明大部分的堿基突變是無(wú)義突變。無(wú)義突變?cè)黾颖砻魃镞x擇壓力增大，但是突變本身并不會(huì)改變翻譯蛋白質(zhì)的氨基酸序列。非同義突變則表明蛋白質(zhì)氨基酸序列會(huì)發(fā)生改變，病毒可能獲得新的抗原特征從而造成暴發(fā)流行。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，該氨基酸序列未發(fā)現(xiàn)與其他病毒的氨基酸序列有相似性，因此，關(guān)于該蛋白的功能需要進(jìn)一步的研究。

目前，針對(duì)羅湖病毒的不同核苷酸片段已經(jīng)建立了PCR、LAMP等很多方法，為羅湖病毒的鑒定奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，中國(guó)也針對(duì)羅湖病毒建立了分子生物學(xué)檢測(cè)方法[18-20]。盡管通過(guò)某個(gè)單一的保守核苷酸片段對(duì)羅湖病毒開(kāi)展分子流行病學(xué)分析，并以此推斷其起源及地理流行傳播情況不一定十分準(zhǔn)確，但大范圍的分子流行病學(xué)分析仍能為病毒的預(yù)防控制提供了很好的依據(jù)。

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Molecular epidemiological analysis of tilapia lake virus based on nucleotide sequence

LIU Zhuhong1， ZHANG Huang2， TANG Ling1， LIU Xianxu1， LIN Jiewen1， WU Lin1

（1.Guangdong Polytechnic of Science and Trade， Guangzhou 510430， Guangdong China; 2.Guangzhou Double Helix Gene Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510430， Guangdong China）

Abstract：In this paper， the nucleotide sequence of tilapia lake virus（TiLV） in NCBI database was analyzed by bioinformatics to understand the global epidemic of tilapia lake virus and the infection status in tilapia aquaculture in China. According to the sequence of the third segment alignment results， tilapia lake virus searched so far in NCBI database could be divided into 12 groups. The tilapia lake virus had basically formed an epidemic circle centered around four countries， including the Philippines， India， Thailand， and Israel， while the tilapia lake virus in China shows that it comes from Ecuador. There were some base mutations between sequences in different regions of the third segment， but from the amino acid level， most of the mutations were non-sense mutations. Through motif sequence enrichment on the sequence， it was found that the bases at each site of the motif sequence were also very stable. However， the related functions of these highly conserved motifs need to be studied. The 302 clinical samples collected from various regions in Guangdong were tested and none of them detected positive for tilapia lake virus. Through molecular epidemiology analysis of tilapia lake virus， although there is no epidemic trend of tilapia lake virus in China， we should strictly prevent and control the import of tilapia lake virus in our import and export trade.

Keywords：tilapia; tilapia lake virus（TiLV）; molecular epidemiology

基金項(xiàng)目：廣東省青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2018GkQNCX069）；清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（220804107510735）；廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（PBEA202009）

作者簡(jiǎn)介：劉助紅（1985-），男，漢族，碩士研究生，副教授。研究方向：水生動(dòng)物疫病研究，E-mail：290415174@qq.com。