一株C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定

宋鋒，劉賽，榮榕

（山東省濱州市博興縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心 山東濱州 256600）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（魏氏梭菌）是一種革蘭氏陽性、桿狀、可形成芽孢的厭氧菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種人畜共患病原菌、其特點(diǎn)是在體內(nèi)或者食物中生長迅速，菌體細(xì)胞數(shù)量在10 min 內(nèi)可以翻倍[1]，該菌在生長過程中快速產(chǎn)生有毒氣體（如亞硫酸鹽），可引起人畜各種組織感染，如污染傷口的氣性壞疽，人類胃腸炎（包括食源性和非食源性腹瀉），動物的壞死性腸炎（NE），牛、羊和家兔的梭菌病等[2-3]。另外，產(chǎn)氣莢膜梭菌是食品加工衛(wèi)生方面的重要指標(biāo)，其在周圍環(huán)境中廣泛分布，經(jīng)常從土壤及動物腸道和糞便中分離出來[4]。其在不適宜生存的惡劣條件下（如缺乏營養(yǎng)、干燥、高溫、低溫、紫外照射等）可以形成對外界具有較強(qiáng)抗性的芽孢，芽孢作為其生物休眠體具有很強(qiáng)的生存能力，不易被常規(guī)消毒劑、高溫高壓等滅菌條件所殺滅，在環(huán)境適宜時(shí)，芽孢桿菌可以重新萌發(fā)繁殖，具有很強(qiáng)的致病性，往往給畜牧養(yǎng)殖業(yè)（豬、牛、羊及家禽等）帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。近年來產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性隨著抗菌藥物的大量使用逐年增加，許多臨床強(qiáng)毒株出現(xiàn)了多重耐藥性，給養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和食品安全、人類健康帶來了巨大的挑戰(zhàn)[7]。

羊梭菌病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種急性、高度致死性疾病，常包括羊快疫、猝狙、腸毒血癥、羔羊痢疾、黑疫等，每年因該病對養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的損失[8-9]。該菌感染羊只后可出現(xiàn)食欲減退、反芻次數(shù)減少，進(jìn)而出現(xiàn)腹脹、腹瀉、呼吸困難甚至突然死亡等臨床癥狀，發(fā)病羊只剖檢變化為心臟、腎臟、肺臟、胃、腸道等多器官水腫、出血等剖檢變化。膘情較好的羊只感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后可出現(xiàn)急性死亡癥狀，往往沒有得到救治的機(jī)會，發(fā)病動物的病死率30%以上[10]。

本文從山東博興縣某羊場的一只疑似梭菌病患病羊肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離，通過對分離菌菌落特征分析、革蘭氏染色鏡檢及產(chǎn)氣莢膜梭菌α（CPA）、β（CPB）、ε（ETX）和ι（ITX）四種毒素進(jìn)行PCR 鑒定，確定該分離菌為羊源C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1）病料。山東博興縣某羊場中疑似梭菌病患病羊。

2）試劑及儀器。綿羊血平皿及卵黃瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、藥敏紙片為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品、革蘭氏染色試劑從青島海博生物技術(shù)有限公司購買；PCR Mix 為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DL2000 為AG 公司產(chǎn)品；厭氧培養(yǎng)箱為上海新苗儀器設(shè)備制造有限公司設(shè)備、細(xì)菌基因組提取試劑盒及PCR 擴(kuò)增試劑購自濟(jì)南盛偉生物科技有限公司。

1.2 方法

1）細(xì)菌的分離培養(yǎng)。取病羊肝臟放于無菌玻璃平皿中，對肝臟表面進(jìn)行消毒處理、使用無菌手術(shù)刀，切開肝臟，使用一次性接種環(huán)蘸取肝臟內(nèi)部病料，劃線接種于綿羊血平皿中，將平皿置于42 ℃厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行分離培養(yǎng)。

2）細(xì)菌表面形態(tài)觀察。經(jīng)42 ℃培養(yǎng)24 h 后，將平板取出，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，將分離菌劃線卵黃瓊脂板上進(jìn)行厭氧培養(yǎng)后取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

3）分離菌的PCR 分型鑒定：①細(xì)菌基因組的提取。用滅菌的接種環(huán)挑取單菌落接種于魏氏梭菌專用液體培養(yǎng)基中，42 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，取0.5 mL 培養(yǎng)菌液，經(jīng)離心沉淀、溶菌酶處理后使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌的核酸，提取核酸存于-40 ℃保存?zhèn)溆?；②引物合成。魏氏梭菌的分型及鑒定引物按照文獻(xiàn)[11]中序列合成，其中α 毒素基因片段為300 bp 左右、β 毒素部分基因片段約為190 bp、ε 毒素基因片段約為650 bp、ι 毒素截短的基因約為440 bp，所有引物由上海生工科技有限公司合成；③PCR 擴(kuò)增體系?？傮w系20 μL：2XPower Taq Master Mix 10 μL、滅菌水6 μL、上下游引物各0.5 μL（20 μM）、模板3 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性為94 ℃、3 min；變性條件為94 ℃、15 s，退火條件為44 ℃、20 s，延伸條件為72 ℃、30 s，共30 個(gè)循環(huán)；循環(huán)擴(kuò)增最后在72 ℃延伸6 min；2～8 ℃保存。取PCR 產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，120V 運(yùn)行15 min 后觀察核酸電泳結(jié)果，紫外成像儀拍圖片保存。

4）分離菌的藥敏試驗(yàn)。將培養(yǎng)菌液稀釋后涂板，分別將多西環(huán)素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨芐西林等藥敏片貼在平板上，厭氧培養(yǎng)12～16 h 后觀察耐藥情況。

5）分離菌外毒素試驗(yàn)。將單菌落接種于魏氏梭菌專用液體培養(yǎng)基中，42 ℃條件下厭氧培養(yǎng)12 h，取2 mL 菌液于滅菌離心管中離心取上清，使用滅菌生理鹽水進(jìn)行5 倍稀釋。選取6 只日齡體重相近的小白鼠，3 只作為對照組尾靜脈注射0.2 mL 滅菌生理鹽水，3只作為實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射0.2 mL 稀釋菌液上清。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離

在42 ℃溫度下厭氧培養(yǎng)24 h 后在血平板上形成形雙層溶血環(huán)的菌落，單菌落表觀呈現(xiàn)灰色、圓形、略顯光滑、微微隆起的雙溶血環(huán)（圖1）。在顯微鏡下可見革蘭氏陽性、桿狀粗大桿菌（圖2）。挑取單菌落在卵黃瓊脂板上，菌落周圍呈現(xiàn)圓形、不溶性、不透明白色沉淀物（圖3）。

圖1 綿羊血平板培養(yǎng)

圖2 卵黃瓊脂培養(yǎng)

圖3 魏氏梭菌鏡檢

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分型PCR 鑒定

PCR 鑒定結(jié)果顯示在300 bp 和190 bp 位置出現(xiàn)目的片段表明α、β 毒素陽性，ε、ι 毒素、陰性對照無相應(yīng)條帶出現(xiàn)，該擴(kuò)增結(jié)果表明該分離菌為C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌（圖4）。

圖4 魏氏梭菌分型

2.3 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)表明分離菌對常見抗生素具有不同程度的耐藥性，對頭孢噻呋敏感性最高，對氨芐西林中敏，對多西環(huán)素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、慶大霉素耐藥。

2.4 外毒素試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組三只小鼠在攻毒后1 h 出現(xiàn)精神沉郁、行動遲緩、呼吸加快現(xiàn)象，3 h 后全部死亡，對照組小鼠狀態(tài)正常，全部存活。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是條件性致病菌，致病能力主要依靠其外毒素，相關(guān)研究顯示其外毒素主要有α、β、ε、ι、γ、δ、θ、η、κ、λ、μ、υ 等12種，根據(jù)其致病力較強(qiáng)的主要的前四種外毒素可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι）等五種基因型。A型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)量最高的α 毒素為所有基因型均含有的毒素，其具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致血管滲透性增加，出現(xiàn)皮膚壞死、血小板凝集，使動物發(fā)生壞死性腸炎等癥狀；B 型可產(chǎn)生β 毒素，β 毒素可分為β1、β2 毒素，β1 毒素是一種具有細(xì)胞毒性和致死性的強(qiáng)毒素，β2 毒素是最近幾年相關(guān)學(xué)者從C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)現(xiàn)的新毒素，與β1 毒素相似。B 型和D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染易引起牛、羊的腸炎或腸毒血癥，當(dāng)前E 型導(dǎo)致的臨床致病案例較少[12-14]。在最新的研究中又有新的基因型被添加到這個(gè)分型系統(tǒng)中，包括產(chǎn)氣莢膜梭菌的F 型和G 型[15-16]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素可引起人類和動物不同的腸道疾病，這些疾病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌的一種或多種毒素介導(dǎo)的，在與產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的腸道感染中，C 型菌株引起人和動物的感染，其可引起羊猝狙，該病的主要特征為急性死亡、會導(dǎo)致腹膜炎和潰瘍性腸炎的一種毒血癥，急性腹痛，糞便中帶血。該病的發(fā)生與采食C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的飼料或飲水有關(guān)，多發(fā)生在1～2 歲的成年綿羊或山羊，呈現(xiàn)出明顯的地方性流行趨勢，常在冬春季節(jié)的低洼、潮濕地區(qū)發(fā)生。細(xì)菌進(jìn)入腸道后在小腸大量繁殖，迅速產(chǎn)生并釋放毒素，引起羊只發(fā)病。發(fā)病羊癥狀多出現(xiàn)機(jī)體消瘦、跟不上羊群、時(shí)常臥地不起、精神煩躁、昏迷或痙攣等，病程短促常于數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡[17]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌普遍存在于環(huán)境中，是腸道微生物群的正常成員，當(dāng)突然改變飲食、抗生素過度治療或天氣突然變化時(shí)，導(dǎo)致動物受到應(yīng)激，免疫抵抗力下降，腸道微生物菌群平衡失調(diào)，產(chǎn)氣莢膜會快速生長，大量產(chǎn)氣和分泌多種腸毒素，短時(shí)間內(nèi)可導(dǎo)致羊只死亡。同時(shí)，該菌能產(chǎn)生廣泛的胞外毒素和水解酶，在有氧環(huán)境中有一定的存活數(shù)量。加強(qiáng)環(huán)境消毒、異地運(yùn)輸過程中提前應(yīng)用一些抗應(yīng)激物、定期飼喂一些中藥制劑和按時(shí)免疫羊三聯(lián)四防疫苗，可以較為有效的預(yù)防羊梭菌病的發(fā)生，降低梭菌病對養(yǎng)羊業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。■