高效裂解性寬譜大腸桿菌噬菌體篩選方法探究

屈平平，楊明彩，溫華梅，李濤

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東濰坊 261061）

近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)“禁抗減抗”執(zhí)行力度的加大和國(guó)家對(duì)食品安全的重視，噬菌體，作為細(xì)菌的天然殺手，具有特異性強(qiáng)、繁殖速度快、不易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)真核細(xì)胞無(wú)毒副作用等優(yōu)勢(shì)[1-2]，噬菌體及裂解酶在疾病治療、環(huán)境消毒、食品保存等方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[3-5]。如何從自然界篩選到效價(jià)高、暴發(fā)量大、裂解譜廣、抗逆性強(qiáng)的裂解性噬菌體，是噬菌體及其裂解酶研究和開(kāi)發(fā)利用的根本。本試驗(yàn)以免致病性大腸桿菌為宿主菌，研究了高效裂解性寬譜大腸桿菌噬菌體的篩選方法，為下一步大腸桿菌噬菌體的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）污水：取自山東地區(qū)（青島、濰坊、臨沂、萊蕪）肉兔養(yǎng)殖較為密集的養(yǎng)殖場(chǎng)周邊污水。

表1 污水采集地區(qū)及標(biāo)號(hào)

2）指示菌：用于篩選噬菌體的宿主菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的11株兔腸源致病性大腸桿菌。

3）主要試劑與儀器：麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基等，均購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司；甘油，購(gòu)自煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；SM 緩沖液，購(gòu)自北京雷根生物有限公司。主要儀器由一次性注射器，一次性0.22 μm 微孔針式過(guò)濾器，超凈工作臺(tái)、水浴鍋、透射電子顯微鏡（HT7700 型，HITACHI）。

1.2 培養(yǎng)基制備

1）麥康凱培養(yǎng)基：取10 g，加入200 mL 蒸餾水，121 ℃高壓15 min，冷卻至50 ℃，倒板備用。

2）LB 液體培養(yǎng)基：分別稱取胰蛋白胨10 g、酵母浸膏粉5 g 和NaCl 10 g，加入蒸餾水1 L，加熱并不斷攪拌至其溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）LB 固體培養(yǎng)基：分別稱取胰蛋白胨10 g、酵母浸膏粉5 g、NaCl 10 g 和瓊脂粉15 g，加入蒸餾水1 L，加熱并不斷攪拌至其溶解，121 ℃高壓滅菌15 min，室溫冷卻至50 ℃左右，倒入高壓滅菌的平皿中，冷卻凝固，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4）LB 半固體培養(yǎng)基：稱量5 g LB 肉湯，1.4 g 瓊脂粉，加入含有200 mL 蒸餾水的錐形瓶中，攪拌均勻，煮沸至完全溶解，對(duì)其進(jìn)行滅菌處理，滅菌完成后保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 宿主菌菌液的制備

取-80 ℃保存的11株兔源大腸桿菌（編號(hào)為tE1-tE11）在麥康凱培養(yǎng)基上劃線純化，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，挑取純化后的單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)8 h 至對(duì)數(shù)期，得到大腸桿菌菌懸液。

2.2 可疑噬菌體的初選

分別取10mL 污水（編號(hào)為1#-12#）于帶蓋塑料離心管中，12 000 r/min 離心10 min 去除大部分固體雜質(zhì)，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌。取0.1 mL 污水過(guò)濾液加入10 mL 已滅菌LB 液體培養(yǎng)基中，再加入0.1 mL 宿主菌菌液，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日將5 mL 培養(yǎng)液8 000 r/min 離心15 min，上清液經(jīng)過(guò)經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，將過(guò)濾液保存與無(wú)菌青霉素，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

利用滴定法檢測(cè)污水中有無(wú)噬菌體存在，取100 μL 大腸桿菌菌懸液涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板上，在平板背面畫出分割線并進(jìn)行標(biāo)號(hào)，根據(jù)平板標(biāo)號(hào)點(diǎn)滴樣品濾液，每個(gè)標(biāo)號(hào)方格中滴加10 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，觀察有無(wú)空斑出現(xiàn)?？瞻叽蠖噶琳撸f(shuō)明該污水中可能含有裂解性比較強(qiáng)的噬菌體（如圖1 中4#、6#和7#污水中可能存在能高效裂解宿主菌tE1 的噬菌體）。空斑小，渾濁，內(nèi)有少量細(xì)菌者，說(shuō)明該污水中雖然存在能裂解該細(xì)菌的噬菌體，但裂解不徹底，裂解能力較差（如圖1 中8#和9#污水中存在的噬菌體裂解宿主菌tE1 能力相對(duì)差）。優(yōu)選空斑大而透亮者，再進(jìn)一步進(jìn)行噬菌體的分離和純化。

圖1 滴定法檢測(cè)污水中有無(wú)噬菌體的演示

2.3 寬譜噬菌體的篩選

將大而透亮的空斑用無(wú)菌眼科手術(shù)鑷摳出，加入10 mL LB 液體培養(yǎng)基，再加入100 μL 宿主菌菌懸液，37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日將噬菌體增殖液過(guò)0.22 μm 濾膜，得到噬菌體過(guò)濾液。然后進(jìn)行交叉滴定試驗(yàn)，即利用一種噬菌體過(guò)濾液滴定其他噬菌體的宿主菌，看有無(wú)空斑出現(xiàn)，出現(xiàn)空斑較多者，說(shuō)明該噬菌體的裂解譜較寬，有可能為寬譜噬菌體。

2.4 噬菌體的分離與純化

將疑似寬譜噬菌體的過(guò)濾液進(jìn)行梯度稀釋，取合適梯度噬菌體稀釋液0.1 mL 與0.2 mL 宿主菌菌液混合，加入4mL 約55 ℃LB半固體培養(yǎng)基，混勻后倒入LB 平板上，平板凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱4～6 h，觀察噬菌斑大小、形狀及透明度，并記錄噬菌體效價(jià)。將有透亮噬菌斑，且效價(jià)較高的樣品，利用雙層平板法進(jìn)一步純化，重復(fù)3～5 次后，最終得到噬菌斑透而亮，形狀和大小一致。

2.5 噬菌體的分類與命名

將篩選的寬譜噬菌體，用磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行透射電鏡觀察。取富集后的噬菌體緩沖液15 μL 滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min，用濾紙吸干多余液體，然后滴一滴磷鎢酸（2%）染色，等待10min，干燥后通過(guò)電子顯微鏡觀察其形態(tài)。根據(jù)《根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）在2011年發(fā)布的第9 次報(bào)告中噬菌體的分類與命名標(biāo)準(zhǔn)》[6]和相關(guān)文獻(xiàn)[7]對(duì)噬菌體進(jìn)行分類和命名。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 噬菌體的初步篩選

通過(guò)噬菌體原液滴定宿主菌，在普通平板上空斑的情況見(jiàn)表2和圖2，其中空斑大而透亮的有tE1-2#、tE1-5#、tE1-7#、tE1-9#、tE1-10#、tE2 -9#、tE2 -10#、tE5 -2#、tE5 -5#、tE5 -9#、tE5 -10#、tE5 -11#、tE6-2#、tE6-5#、tE6-9#、tE6-10#、tE6-11#、tE10-11#，因此，利用滴定法初步篩選到18株裂解性比較強(qiáng)的噬菌體。

圖2 滴定試驗(yàn)出現(xiàn)空斑的情況

表2 滴定法初次篩選噬菌體的結(jié)果

3.2 寬譜噬菌體的篩選

利用一種噬菌體過(guò)濾液滴定其他噬菌體的宿主菌，出現(xiàn)空斑的情況見(jiàn)表3?？芍删wtE6-5#除了可以裂解宿主菌tE6，還可裂解宿主菌tE1、tE2、tE5、tE10；噬菌體tE10-11#可以裂解宿主菌tE10，還可裂解宿主菌tE1、tE2、tE5、tE6；其他噬菌體僅能裂解1 種或者2 種宿主菌。因此，噬菌體tE6-5#和噬菌體tE10-11#很可能為寬譜噬菌體。

表3 寬譜噬菌體的篩選結(jié)果

3.3 疑似寬譜噬菌體的分離和純化結(jié)果

經(jīng)過(guò)純化后，tE6-5#的噬菌斑為圓形，直徑約0.8～1 mm，邊緣整齊無(wú)暈環(huán)，完全透亮（見(jiàn)圖3），效價(jià)為5.42×108PFU/mL。tE10-11#的噬菌斑圓形，直徑約2～2.5 mm，邊緣整齊無(wú)暈環(huán)，完全透亮（見(jiàn)圖4），效價(jià)為8.26×109pfu/mL。

圖3 tE6-5# 噬菌斑形態(tài)

圖4 tE10-11# 噬菌斑形態(tài)

3.4 噬菌體的分類與命名

通過(guò)透射電鏡觀察到噬菌體tE6-5#，平面觀察頭部大致呈長(zhǎng)六角形，長(zhǎng)徑約為59.6 nm，橫徑約為57.3 nm，尾部長(zhǎng)約106 nm，無(wú)明顯的頸部（見(jiàn)圖5），從形態(tài)和結(jié)構(gòu)上可初步判定該噬菌體屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科，暫命名為vB-EcoM-tE6。噬菌體tE10-11#，頭部呈二十面體，長(zhǎng)徑約為52.5 nm，橫徑約為51.6 nm，尾部長(zhǎng)約86.9 nm，有明顯的頸部（見(jiàn)圖6），從形態(tài)和結(jié)構(gòu)上可初步判定該噬菌體也屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科，暫命名為vB-EcoM-tE10。

圖5 vB-EcoM-tE6 電鏡形態(tài)

圖6 vB-EcoM-tE10 電鏡形態(tài)

4 討論

近年來(lái)，眾多研究者以禽源、羊源、豬源致病性大腸桿菌等為宿主菌，篩選了多株大腸桿菌噬菌體，并對(duì)其生物學(xué)特性和分子生物學(xué)信息進(jìn)行了深入的研究[8-11]。旨在篩選出安全、高效、潛在利用價(jià)值高的寬譜裂解性噬菌體。由于自然界中的噬菌體種類和數(shù)量多，特異性強(qiáng)，理想型噬菌體的篩選成為噬菌體開(kāi)發(fā)和利用的前提，也是研發(fā)工作中最為繁瑣的環(huán)節(jié)。

本項(xiàng)目組探索了一套省時(shí)省力、高效篩選目的噬菌體的方法。首先是利用滴定法根據(jù)空斑的大小和透明度，初步篩選出裂解能力較強(qiáng)的噬菌體，再利用交叉滴定法，篩選出能夠裂解多株宿主菌的寬譜噬菌體，最后利用雙層平板法，篩選和純化出效價(jià)高、噬菌斑大而透的噬菌體。這種方法可以避免一開(kāi)始就利用雙層平板法初選噬菌體和盲目對(duì)大量未知噬菌體的分離和純化過(guò)程中時(shí)間、精力、試驗(yàn)材料的消耗，大大提高了科研工作的效率，在很大程度節(jié)約了試驗(yàn)耗材和試劑的投入。

根據(jù)電鏡下噬菌體形態(tài)學(xué)特征，本試驗(yàn)從萊蕪和青島某兔場(chǎng)污水種中分離的大腸桿菌噬菌體vB-EcoM-tE6 和vB-EcoM-tE10 均為有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科。與趙劍等[12]以一株兔非典型腸致病型大腸桿菌（ZR1）為宿主菌，分離到的噬菌體ZRP1；與王志鵬等[13]以1株致病性大腸埃希菌為宿主菌，分離純化的出4株噬菌體ZRP2、ZRP3、ZRP4 和ZRP5，在形態(tài)上具有相似性，符合大腸桿菌噬菌體的一般特征。噬菌體vB-EcoM-tE6 和vB-EcoM-tE10 的效價(jià)在109～1010之間，至少能裂解5 種以上的致病性大腸桿菌，符合高效裂解性寬譜噬菌體的特點(diǎn)，很可能具有很高的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值?！?/p>