腸易激綜合征關鍵基因的篩選及驗證

朱文娟,周 菲,費素娟

(1徐州醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院消化內鏡重點實驗室,徐州 221004;2徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內科;*通訊作者,E-mail：xyfyfeisj99@163.com)

隨著社會經濟發(fā)展,腸-腦互動紊亂性疾病IBS等的發(fā)病比例增加,成為消化專科的巨大臨床挑戰(zhàn)[1,2]。腸-腦互動機制研究揭示：特定腦區(qū)的炎癥反應和功能改變與腸道微環(huán)境變化和腸黏膜屏障功能損傷是互為因果的核心機制[3]。應激是引發(fā)腸腦互動特定腦區(qū)炎癥反應和功能改變的重要因素,其中涉及下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)[4]、免疫系統(tǒng)[5]和腦-腸-微生物軸[6]等多條途徑。腸黏膜屏障損傷即“微腸漏”,是腸腔微環(huán)境中的條件致病因素與宿主防御機制之間攻防紊亂致不同程度腸黏膜炎癥,可影響特定腦區(qū)功能性或病理性改變,使內臟高敏感效應增強[7]。精神應激與“微腸漏”互為因果關系[8],在精神應激致特定腦區(qū)高耗能狀態(tài)下,更易遭受“微腸漏”打擊,引發(fā)炎癥等病理改變,加劇功能異常。結合中樞神經系統(tǒng)疾病研究鎖定,小膠質細胞是促發(fā)特定腦區(qū)炎癥的關鍵[9]。但應激和腸黏膜屏障損傷引發(fā)特定腦區(qū)炎癥反應的機制并不明確,可干預的分子靶點也未鎖定。本研究通過公共基因表達譜數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO)中IBS患者及健康對照者的直腸結腸活檢樣本、十二指腸空腸活檢樣本的芯片檢測結果進行分析,并利用皮質酮(corticosterone,Cort)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、Cort疊加LPS構建應激、炎癥、應激疊加炎癥的小膠質細胞模型來模擬IBS的發(fā)生發(fā)展,驗證DEGs在IBS中的表達,旨在研究參與IBS發(fā)生的關鍵通路/基因,進一步了解IBS的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 表達譜數據來源,數據處理及標準化

設定“irritable bowel syndrome”或“IBS”為檢索關鍵詞,“Homo sapiens”為研究對象,“Expression profiling by array”為研究類型,從中選取近年且數據集包含樣本量較大的數據集GSE36701和GSE166869。GSE36701數據集包含221例樣本,選取其中IBS患者直腸結腸活檢樣本87例,健康對照直腸結腸活檢樣本40例。GSE166869數據集包含69例樣本,選取其中IBS患者十二指腸空腸活檢樣本43例,健康對照十二指腸空腸活檢樣本26例。從GEO數據庫下載經過預處理、標準化及l(fā)og2轉化的基因探針表達矩陣,通過探針號和Gene symbol的依次對應,去除沒有對應到Gene symbol的探針,當1個基因由多個探針匹配時,采用中位數進行替換,進一步得到表達譜數據集的基因樣本信息。基因表達矩陣需要進一步完成標準化步驟以消除樣本之間差異,通過Sangerbox軟件(http：//sangerbox.com/Tool)中的數據處理工具對基因表達矩陣完成分位數標準化,從而得到標準化后基因表達矩陣。

1.2 DEGs篩選

用R語言limma軟件包對GSE166869和GSE36701數據集進行IBSvsHC基因表達差異分析,所有基因經過分析后得到相應的P值,選取差異表達閾值P<0.05且|log2FC|>0.263的基因作為DEGs。對2個數據集差異基因取交集用于后續(xù)分析。用R語言的軟件包ggplot2、ggpubr、ggthemes、pheatmap對DEGs分別以火山圖和熱圖形式進行可視化呈現。

1.3 基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)

GSEA是判斷基因集在不同生物狀態(tài)中是否具有統(tǒng)計學意義、一致性差異的。把GSE36701和GSE166869的標準化基因表達矩陣文件和樣本分組文件引入Sangerbox軟件GSEA簡易分析工具,樣本分類包括IBS組和HC組,背景數據庫選用的是KEGG數據庫。軟件按照算法計算富集分數(ES),標準富集分數(NES),標準化的顯著性水平,糾正多重假設檢驗。

1.4 基因本體論(gene ontology,GO)和KEGG分析

GO分析提供不同生物基因功能的信息,可研究DEGs功能及特性。GO包括：細胞組件(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物學過程(biological process,BP)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用于細胞通路的預測。將DEGs輸入到富集分析工具g：profiler(https：//biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)中進行GO和KEGG富集分析,數據來源設定為GO cellular component, GO molecular function, GO biological process和KEGG,分析標準設定為調整后P<0.05。

1.5 PPI網絡和關鍵基因的篩選

交互式基因恢復工具(STRING)可評估功能基因組學數據。將DEGs導入STRING(http：string-db.org/)數據庫進行分析。選擇的物種是homo sapiens,篩選combined score>0.4的蛋白,導入Cytascape軟件并構建PPI網絡。運用CitoHubba插件,根據Degree算法,篩選關鍵基因(hub genes)。

1.6 上調的DEGs與疾病、藥物的相關分析

將上調的共有差異表達基因分別導入基因富集分析工具WebGestalt中的Disgenet(https：//www.disgenet.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)數據庫,通過ORA富集方法分析,設定P<0.05為富集結果。

1.7 細胞與分組處理

細胞及主要試劑：BV2神經小膠質細胞及細胞專用培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生物科技有限公司,脂多糖、皮質酮均購于上海麥克林生化科技有限公司,一抗(Pellino-1、SHARPIN、TLR4、NF-κB p65、IκBα、TNF-α、IL-1β)均購于英國Abcam公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒、Trizol均購于上海碧云天生物技術有限公司,TNF-α、IL-6、CRP ELISA試劑盒均購于武漢云克隆科技股份有限公司,PCR引物由徐州偉沃生物科技有限公司合成。

本研究分為正常對照組、LPS組、Crot組、LPS+Cort組。正常對照組在80%～90%融合度的BV2神經小膠質細胞中加入適當體積培養(yǎng)基,LPS組和Cort組加入分別含1 μg/ml LPS、50 nmol/L Cort的同體積培養(yǎng)基刺激4～6 h。LPS+Cort組加入同時含1 μg/ml LPS和50 nmol/L Cort的同體積培養(yǎng)基刺激4～6 h。每組設置3個復孔,進行3次獨立重復實驗。

1.8 實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的表達

收集處理后的各組細胞,用Trizol提取總RNA,分離mRNA,逆轉錄合成cDNA,PCR擴增目的基因,計算ΔCt值,以2-ΔΔCt法分析處理。反應條件：95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個循環(huán)。引物序列如下：GABRE上游引物為5′-CTTCAATGTAAGCAGGAGG-3′,下游引物為5′-GATAGGAGACACGAGGGA-3′;MICALL2上游引物為5′-TCACGCCGCAAGAAACTA-3′,下游引物為5′-CAAGGTCATTGTCCAGGATT-3′;TLR4上游引物為5′-AGCTCCTGACCTTGGTCTTG-3′,下游引物為5′-CGCAGGGGAACTCAATGAGG-3′;NF-κB p65上游引物為5′-ACTGCCGGGATGGCTACTAT-3′,下游引物為5′-TCTGGATTCGCTGGCTAATGG-3′;IκBα上游引物為5′-GGTCTCGCTCCTGTTGAAGTGTG-3′,下游引物為5′-TCCGTGTCATAGCTCTCCTCATCC-3′;TNF-α上游引物為5′-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3′,下游引物為5′-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′;IL-1β上游引物為5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′,下游引物為5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′。每組設置3個復孔,進行3次獨立重復實驗。

1.9 免疫印跡法(Western blot)檢測GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達

向處理后的細胞中加入RIPA裂解液,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。配制7.5% SDS-PAGE進行凝膠電泳,蛋白上樣量為10 μg,70 V恒壓電泳2 h,濕轉法400 mA恒流快速電轉160 min,將蛋白轉至PVDF膜上,3% BSA封閉液封閉2 h。將蛋白質條帶分別加入抗GABRE(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、TNF-α(1∶800)、IL-1β(1∶800)、GAPDH(1∶1 000)一抗中,4 ℃搖床過夜,使用TBST洗滌。條帶放入與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗(1∶5 000)中孵育1 h,TBST洗滌。暗室中化學發(fā)光顯影。每組設置3個復孔,進行3次獨立重復實驗。

1.10 ELISA實驗檢測TNF-α、IL-6和CRP的表達

取處理后的細胞上清離心,設置標準品孔和樣本孔,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體37 ℃水浴鍋溫育60 min。棄去液體,吸水紙上拍干,重復洗板5次,加入底物A、B后37 ℃避光孵育15 min。加入終止液在450 nm波長處測定各孔的OD值。每組設置3個復孔,進行3次獨立重復實驗。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 DEGs篩選結果

根據|log2FC|>0.263,P<0.05的篩選標準,GSE36701中IBS組與HC組有861個DEGs,包含447個上調基因和414個下調基因;GSE166869中IBS組與HC組有4 426個DEGs,包含117個上調基因和4 309個下調基因(見圖1,2)。GSE36701和GSE166869的交集基因有95個,其中均上調的基因有4個,均下調的基因有62個(見圖3)。

A. GSE36701中差異表達基因熱圖B. GSE166869中差異表達基因熱圖圖2 IBS組與HC組差異表達基因熱圖Figure 2 Heat map of differentially expressed genes between IBS group and HC group

A.兩數據集差異基因的交集 B.兩數據集上調差異基因的交集C.兩數據集下調差異基因的交集圖3 GSE36701和GSE166869的IBS組與HC組差異表達基因情況Figure 3 Differential expression of genes between IBS group and HC group in GSE36701 and GSE166869

2.2 GSEA分析結果

設定P<0.05為標準篩選,GSE36701中差異表達基因富集到帕金森病、甲狀腺癌、卵母細胞減數分裂和亨廷頓病(見圖4)。GSE166869中差異表達基因富集到P53信號通路、趨化因子信號通路、細胞因子受體相互作用、細胞周期、n聚糖生物合成、阿爾茨海默病、錯配修復、TOLL樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、細胞凋亡等,設定P<0.01為富集結果篩選,取前10個富集結果進行可視化呈現(見圖5)。

圖4 GSE36701中IBS組與HC組差異表達基因的GSEA分析圖Figure 4 GSEA analysis of differentially expressed genes between IBS group and HC group in GSE36701

2.3 GO分析和KEGG分析結果

GSE36701和GSE166869中的共有差異表達基因GO分析結果為：①在生物學過程中,主要富集于自然殺傷細胞介導的細胞毒性調節(jié)、自然殺傷細胞介導的免疫調節(jié)、胞內運輸的調節(jié)、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、自然殺傷細胞介導的免疫、白細胞介導的細胞毒性調節(jié)、蛋白激酶a信號、細胞殺傷、細胞殺傷的調節(jié)、咽弓動脈形態(tài)發(fā)生等。②在細胞組件中,主要富集于3級顆粒腔、微絨毛、樹突膜、紡錘體、3級顆粒、神經元投影膜、特異顆粒腔、循環(huán)內吞體、中體、線粒體外膜等。③在分子功能中,主要富集于核纖層蛋白結合、氨基?；D移酶活性、MHC蛋白復合物結合、組蛋白脫乙酰酶結合、碳水化合物結合、E-box結合、蛋白激酶a結合、半胱氨酸型內肽酶抑制劑活性、分子功能激活劑活性、線性酰胺中作用于碳-氮(而非肽)鍵的水解酶活性等(見圖6)。KEGG分析結果示共有差異表達基因顯著富集于瘧疾、人T細胞白血病病毒1型感染、細胞周期、乙型肝炎、藥物代謝-細胞色素p450、細胞色素p450外源生物代謝、EB病毒感染、結直腸癌、γ-氨基丁酸能突觸等通路(見圖7)。設定P<0.05為標準篩選,取前10個GO富集分析結果及KEGG分析結果進行可視化呈現。

圖5 GSE166869中IBS組與HC組差異表達基因的GSEA分析圖Figure 5 GSEA analysis of differentially expressed genes between IBS group and HC group in GSE166869

圖6 IBS組與HC組的共有差異表達基因GO分析結果Figure 6 GO analysis results of common differentially expressed genes in between IBS group and HC group

圖7 IBS組與HC組的共有差異表達基因KEGG分析結果Figure 7 KEGG analysis results of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

2.4 PPI網絡和關鍵基因的篩選

通過STRING數據庫構建GSE36701和GSE166869中的共有差異表達基因的PPI網絡(見圖8)。結果顯示中樞節(jié)點最高(即關鍵基因)的為CDC20、PTTG1、BIRC5、CDKN3、MYC、HIST1H2AJ、NUSAP1、HIST1H2AB、HIST1H2AE、HIST1H3C、HIST1H3B(見表1及圖9)。

2.5 GSE36701和GSE166869中共有上調差異表達基因與疾病、藥物分析結果

設定P<0.05為標準篩選,GSE36701和GSE166869中共有上調差異表達基因與疾病關系預測有13種疾病,前10名為：聾盲癥、原發(fā)性震顫、手術中休克、脈絡膜疾病、中暑、叢集性頭痛、虹膜疾病、食欲亢進、貪食癥、分裂情感障礙(見表2)。GSE36701和GSE166869中共有上調差異表達基因與藥物關系預測有10種藥物,分別為：氟馬西尼、氟硝西泮、戊巴比妥、異氟醚、苦味毒、丙泊酚、抗焦慮藥、四氫孕酮、乙醇、核黃素(見表3)。

圖8 IBS組與HC組的共有差異表達基因的PPI網絡Figure 8 PPI network of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

表1 IBS組與HC組的共有差異表達基因的前11個關鍵基因信息

圖9 IBS組與HC組的共有差異表達基因的前11個關鍵基因Figure 9 Top 11 hub genes of common differentially expressed genes between IBS group and HC group

表2 IBS組與HC組共有上調差異表達基因與疾病關系預測

2.6 Cort和LPS對GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表達的影響

qRT-PCR檢測發(fā)現Cort組、LPS組和LPS+Cort組小膠質細胞中GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達顯著高于正常對照組,且LPS+Cort組表達顯著高于Cort組和LPS組(見圖10)。

表3 IBS組與HC組的共有上調差異表達基因與藥物預測

與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與LPS+Cort組相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001圖10 qRT-PCR檢測Cort和LPS對細胞中GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的影響Figure 10 Effect of Cort and LPS on GABRE,MICALL2,TLR4,IκBα,NF-κB p65,TNF-α,IL-1βin cells detected by qRT-PCR

2.7 Cort和LPS對GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表達的影響

免疫印跡法結果發(fā)現Cort組、LPS組和LPS+Cort組細胞中GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β的表達顯著高于正常對照組,且LPS+Cort組表達顯著高于Cort組和LPS組(見圖11)。

2.8 Cort和LPS對細胞中TNF-α、IL-6、CRP的影響

ELISA檢測結果發(fā)現Cort組、LPS組和LPS+Cort組細胞中TNF-α、IL-6和CRP的表達顯著高于正常對照組,且LPS+Cort組表達顯著高于Cort組和LPS組(見圖12)。

與正常對照組相比,***P<0.001;與LPS組和Cort組相比,###P<0.001圖11 Western blot檢測Cort和LPS對細胞中GABRE、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α和IL-1β蛋白的影響Figure 11 Effect of Cort and LPS on GABRE,TLR4,IκBα,NF-κB p65,TNF-α,IL-1βin cells detected by Western blot

與正常對照組相比,***P<0.001;與LPS組和Cort組相比,###P<0.001圖12 ELISA檢測Cort和LPS對細胞中TNF-α、IL-6、CRP的影響Figure 12 Effect of Cort and LPS on TNF-α,IL-6,CRP in cells detected by ELISA

3 討論

IBS是常見的胃腸道疾病,影響全球數百萬人。盡管IBS普遍存在,但機制尚不完全清楚,而腦-腸軸在IBS中發(fā)揮重要作用。有關研究表明帕金森病、阿爾茨海默病等神經退行性疾病患者的腸道微生物群落改變,致腸黏膜、血腦屏障功能受損,使大腦積累腸道內源性毒物和代謝物,引起腦區(qū)炎癥,造成腸腦互動異常[10]。本研究以在GEO公共數據庫中篩選出的IBS相關芯片結果作為研究對象,篩選出差異表達基因,通過取交集得到共有的差異表達基因,對共有差異表達基因的GSEA分析結果顯示,IBS與帕金森病、阿爾茨海默病等相關,并可激活TOLL樣受體信號通路。

腸上皮細胞的緊密連接是維持腸黏膜屏障的結構和功能完整性所必需的。小腸微絨毛的變化會引起腸道通透性的改變。研究發(fā)現,腸道黏膜受損致通透性增加致“微腸漏”,可促進消化道來源的炎癥活性物質激發(fā)特定腦區(qū)的炎癥反應[11],是中樞神經系統(tǒng)疾病(如阿爾茲海默癥等)的發(fā)病機制之一[12,13],可進一步造成腸腦互動紊亂。本研究GO分析結果顯示IBS患者與健康人群共有差異表達基因可能通過影響微絨毛的結構發(fā)揮作用。KEGG通路分析結果示共有差異表達基因顯著富集于藥物代謝-細胞色素p450、γ-氨基丁酸能突觸等通路。IBS會造成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其受體通過γ-氨基丁酸能突觸等途徑形成相應變化。細胞色素p450可影響抗精神病等藥物代謝,或可作為腸腦互動紊亂的相關治療靶點。

我們又進一步對共有差異表達基因進行蛋白互作分析,篩選IBS相關的關鍵基因,其中CDC20、PTTG1、BIRC5、CDKN3、MYC、NUSAP1等均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。有研究證實IBS患者與健康人群相比不會增加患腫瘤的總體風險,且IBS與較低的結直腸癌死亡率相關[10]。原因可能是IBS患者更傾向于結腸鏡檢查,可早期發(fā)現結直腸癌前病變等,更早地干預治療,降低IBS患者發(fā)生癌癥的風險。

與此同時,我們又對共有上調差異表達基因與疾病、藥物進行預測分析,發(fā)現共有上調差異表達基因與食欲亢進、分裂情感障礙等相關,證實了DEGs在腸-腦互動異常疾病中發(fā)揮重要作用。共有上調差異表達基因與藥物預測中相關的藥物是氟硝西泮、抗焦慮藥等。在早期研究已表明IBS患者有精神心理異常,焦慮和抑郁癥狀突出。抗焦慮藥治療后可改善IBS患者精神障礙,減輕腹痛等癥狀[14]。

進一步表明了精神心理因素參與IBS的發(fā)生發(fā)展,因此抗焦慮藥等是治療IBS的重要手段。

IBS患者與健康人群共有差異表達基因中有4個上調基因,其中GABRE是GABA受體,可參與IBS的病理生理過程[15],便秘型IBS患者血清中GABA減少,且下降程度與臨床癥狀相關。用含谷氨酸脫羧酶(GABA合成途徑中的限速酶)的益生菌治療,可緩解IBS患者腹痛癥狀,改善抑郁程度[16,17]。GABA是神經抑制性遞質,可改善精神緊張,起到抗焦慮、鎮(zhèn)靜作用,IBS患者中GABA減少,與其受體GABRE結合減少,游離GABRE增加,進一步加劇IBS患者的臨床癥狀。MICALL2主要在神經系統(tǒng)和肌肉中表達,可影響多動癥等精神疾病的臨床癥狀的發(fā)展[18],在一定程度上影響腸-腦互動,推進IBS發(fā)生發(fā)展。

臨床實踐證明,精神心理應激和腸黏膜低度炎癥是誘發(fā)或加重IBS癥狀的重要因素,因此,本研究利用LPS、Cort、LPS+Cort構建炎癥、應激、炎癥疊加應激的小膠質細胞模型,以此來模擬IBS的發(fā)生發(fā)展。本研究結果發(fā)現,應激或炎癥作用下GABRE、MICALL2、TLR4、IκBα、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表達上調,且應激疊加炎癥處理時有放大的炎癥反應。相關生物信息學分析表明GABRE基因可激活NF-κB通路[19],引起炎癥反應。本研究亦驗證了GABRE基因可通過NF-κB通路促發(fā)細胞炎癥反應。應激狀態(tài)下下丘腦通過HPA軸促進腎上腺皮質釋放Cort,Cort的過度累積可誘導腦區(qū)炎癥反應,釋放TNF-α、IL-1β等炎癥因子,啟動小膠質細胞內炎癥信號[20]。同時,應激可改變腸道微生物組成,使菌群多樣性下降。并且,應激增加血腦屏障通透性,提高了細胞因子和腸道微生物代謝產物進入大腦的機會,擴大腦區(qū)的炎癥反應[21],使腸腦互動異常,加劇IBS進展。

GABRE、MICALL2基因與IBS發(fā)生發(fā)展相關,是IBS治療的潛在靶標。IBS發(fā)病機制受多種因素影響,部分基因在IBS中有關鍵作用。但是,大多數基因的功能及對IBS的確切作用仍不清楚,因此需要更多研究來確定這些基因的作用機制及基因之間的相互作用。