N-乙酰-D-氨基葡萄糖抑制氧化應(yīng)激和促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化減輕大鼠急性胰腺炎

許祖知,張靚,黃鑫,余磊,陳鵬飛,謝學(xué)文,陳治非,方開晗,費書珂*

(1. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院肝膽胰脾外科,湖南衡陽 421000;2. 南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,湖南衡陽 421000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床中常見的消化系統(tǒng)疾病之一,因多種因素導(dǎo)致胰蛋白酶激活,同時引起病理性細(xì)胞通路和細(xì)胞器功能障礙,最終導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞死亡,引發(fā)局部乃至全身的炎癥反應(yīng)[1-3]。 嚴(yán)重的炎癥和激活的炎癥細(xì)胞會產(chǎn)生高水平的活性氧(reactive oxygen species,ROS),耗盡內(nèi)源性抗氧化劑,導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化失衡,引起氧化應(yīng)激,從而破壞腺泡細(xì)胞并加劇多器官功能障礙[4-5]。 丙二醛(malondialdehyde,MDA)即是常見的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,其含量反映的是機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度。 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)作為機(jī)體內(nèi)最重要的自由基清除劑維持機(jī)體代謝平衡,其含量可反映機(jī)體抗氧化的程度[6]。 過氧化物酶體增生物激活受體-γ( peroxisome proliferator activated receptor-γ,PPAR-γ)是一種核受體,最初被確定為脂肪生成的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子,而后研究證明其在炎癥、癌癥和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 此外,PPAR-γ也被認(rèn)為是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化和細(xì)胞極化的關(guān)鍵抗炎調(diào)節(jié)劑[7]。 在AP 早期,胰腺組織浸潤的巨噬細(xì)胞通常為M1 型巨噬細(xì)胞,可持續(xù)產(chǎn)生高水平的促炎細(xì)胞因子、活性氮和活性氧等中間體參與引發(fā)和維持炎癥,進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥范圍,而在AP 晚期,激活的M2 型巨噬細(xì)胞則緩解炎癥并限制炎癥范圍[8]。 因此,將巨噬細(xì)胞極化從促炎M1 型調(diào)整為抗炎M2 型是AP 的有效治療選擇[9]。 氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)是一種天然的氨基單糖,為人體關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖所必需的物質(zhì),N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)是9 種主要糖核苷酸之一,其在細(xì)胞質(zhì)中合成,并主要以尿苷二磷酸(uridine 5’-diphosphate,UDP)結(jié)合的形式被激活[10],是GlcN 類藥物的常用臨床形式之一,目前廣泛應(yīng)用于臨床上骨關(guān)節(jié)炎的治療,對于關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用[11]。 GlcNAc 除了對關(guān)節(jié)的保護(hù)作用外,同時還在其他多種炎癥疾病具有緩解作用。 GlcN 還可以通過抑制ROS 相關(guān)的炎癥信號來減輕香煙煙霧引起的肺部炎癥[12]。GlcN 可抑制炎癥細(xì)胞中髓過氧化物酶的激活,以及NF-κB、COX-2 和iNOS 的激活,從而抑制結(jié)腸粘膜的炎癥,證實了在炎癥性腸病中的抗炎作用[13]。Chiu 等[14]在實驗中發(fā)現(xiàn)GlcN 通過抑制NLRP3 炎癥小體及NF-κB 的激活減輕細(xì)胞的毒性與炎癥反應(yīng)。 然而,對于GlcN 在正常組織和炎癥組織中氧化應(yīng)激的影響,似乎也存在相反的觀點。 Moore 等[15]研究表明,GlcN 增強(qiáng)了正常飲食小鼠的胰島素抵抗,但改善了高脂飲食小鼠的肥胖和胰島素抵抗。同時,GlcN 促進(jìn)視網(wǎng)膜Müler 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并導(dǎo)致胰島素抵抗作用,這表明GlcN 可能加劇糖尿病誘導(dǎo)的高血糖。 這與之前大多研究對于GlcN 抑制氧化應(yīng)激這一結(jié)論相悖。 因此,有必要針對GlcN在不同器官組織疾病中作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。關(guān)于GlcNAc 在胰腺相關(guān)疾病中的研究較少。 Kim等[16]研究表明,由GlcNAc 和葡萄糖醛酸糖組成的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA),可以作為一種營養(yǎng)劑來促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的代謝。 然而,目前尚未有GlcNAc 在胰腺炎之間的直接研究。 本研究通過L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 大鼠模型,探討GlcNAc 對胰腺組織形態(tài)、炎癥因子、氧化應(yīng)激水平、M1、M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的影響,為AP 的治療提供新的切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

7 周齡SPF 級雄性SD 大鼠20 只,體重200 ~250 g,購自斯貝福生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0010】。 所有大鼠飼養(yǎng)于南華大學(xué)SPF 級動物實驗中心【SYXK(湘)2022-0008】,飼養(yǎng)期間自由飲水、飲食,飼喂普通飼料由南華大學(xué)實驗動物中心提供。 飼養(yǎng)環(huán)境:遵守日照/黑暗環(huán)境各12 h,在濕度40%~60%,溫度20 ~ 26℃下飼養(yǎng)。 本實驗所有操作已通過南華大學(xué)倫理審查會審批(USC2022 10DS18)。

1.1.2 主要試劑與儀器

N-乙酰-D-氨基葡萄糖(上海源葉生物科技有限公司,貨號:S11029),IL-1β、IL-6、TNF-α 試劑盒(武漢華美生物工程有限公司,貨號分別為:CSBE08055r、CSB-E04640r、CSB-E11987r),HO-1 抗體和β-actin 抗體(proteintech、貨號:27282-1-AP、66009-1-Ig)、NRF2 抗體和PPAR-γ 抗體(Abcam,貨號:ab62352、16643-1-AP),CD206 抗體(PTG、貨號:18704-1-AP、26903-1-AP),CD86 抗體(PTG、貨號:26903-1-AP 或13395-1-AP),F4/80(Santa,貨號:sc-377009)。 電泳槽和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(北京六一,中國),光學(xué)顯微鏡(Motic,BA210T,中國),多功能酶標(biāo)分析儀(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司,MB-530,中國)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AP 模型制備、給藥方法、取材

20 只SPF 級雄性SD 大鼠經(jīng)1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后,根據(jù)隨機(jī)對照原則,分為對照組(腹腔注射生理鹽水)、AP 組(腹腔注射20% L-精氨酸溶液)、低劑量GlcNAc + AP 組(腹腔注射50 mg/kg GlcNAc)、高劑量GlcNAc + AP 組(腹腔注射200 mg/kg GlcNAc)。 所有大鼠AP 造模給藥前禁食24 h,禁飲8 h。 AP 造模采用方法:按2.5 g/kg 劑量腹腔注射20% L-精氨酸2 次,間隔60 min。 低、高劑量GlcNAc + AP 組造模采用方法:AP 造模前24 h 分別按照50 mg/kg 或200 mg/kg 劑量予以腹腔注射GlcNAc。 24 h 后按2.5 g/kg 劑量腹腔注射20%L-精氨酸2 次,間隔60 min。 48 h 后進(jìn)行大鼠取材,將大鼠麻醉后固定手術(shù)臺開腹,取腹主動脈血,于離心機(jī)中4℃下,4000 r/min 離心10 min,取上清液,分裝于兩個1.5 mL 離心管中,-80℃冰箱保存,一份用于檢測血清AMY、LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6;另一份用于檢測MDA、SOD 含量。 取血后再取胰腺組織。 將取好的胰腺組織分為兩部分,一部分用4%多聚甲醛溶液固定,制備石蠟切片用于HE 染色和免疫組化;另一部分存放在-80℃冰箱中備用,之后用Western Blot 檢測和免疫熒光。

1.2.2 胰腺組織HE 染色

取出用4%多聚甲醛固定的SD 大鼠胰腺組織,將其切成4 μm 的薄片,用不同濃度的乙醇和二甲苯逐級脫水,石蠟包埋,然后在100 倍光鏡下檢查組織病理學(xué)變化。

1.2.3 ELISA 法檢測AMY、LPS、SOD、MDA 水平

將保存在-80℃的大鼠血清置于室溫解凍,離心,參照各試劑盒說明書進(jìn)行測定,用酶標(biāo)儀(MB-530,深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)分別在450 nm(IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD)、532 nm(MDA)、580 nm(LPS)和660 nm(AMY)處檢測吸光度。 根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)指標(biāo)的濃度。

1.2.4 Western Blot 檢測NRF2、HO-1、PPAR-γ 的表達(dá)水平

將存于-80℃的胰腺組織,解凍后加入溶解劑,離心分離上層清液。 采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。取200 μL 蛋白上清液,進(jìn)行凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,用1 ×PBST 封閉90 min 后,加入相應(yīng)抗體(HO-1、NRF2、PPAR-γ、β-actin 抗體,稀釋比例分別以1 ∶2000;1 ∶1000;1 ∶3000;1 ∶5000),4℃孵育過夜。 然后加入HRP 標(biāo)記的二抗(稀釋比例1 ∶5000),室溫下孵育90 min。 ECL 顯色后,采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 M1、M2 極化、PPAR-γ 的免疫熒光

將胰腺組織切片60℃下烘焙12 h 后放入二甲基苯酚溶液1 h,然后分別用100%、95%、85%、75%的乙醇脫水。 將該切片分別在EDTA 緩沖劑(pH =9.0)、0.01 mol/L PBS(pH = 7.2 ~ 7.6)、硼氫化鈉溶液、蘇丹黑染色溶液、10%的正常人血清/5%的牛血清白處理后,將一抗體(PPAR-γ,CD86 + F4/80,CD206 + F4/80)滴入培養(yǎng)基中置于冰箱中12 h。用50 ~ 100 μL 的抗-兔子免疫球蛋白-IgG 標(biāo)記的熒光抗體,在37℃下培養(yǎng)60 ~ 90 min,然后甘油封存避光保存,置于熒光顯微鏡下觀察。 采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.2.6 免疫組化

將胰腺組織切片60℃下烘焙12 h 后依次脫水,熱修復(fù)抗原后,加1%高碘酸滅活內(nèi)源性酶,將一抗體(CD86,CD206)孵育過夜。 用50 ~ 100 μL 抗-兔、兔-IgG 抗體-HRP 多聚體37℃孵育30 min,沖洗后滴加預(yù)制好的顯色液DAB 工作液50 ~ 100 μL,蘇木素復(fù)染5 ~ 10 min,蒸餾水沖洗,PBS 返藍(lán);再次脫水后置于二甲苯10 min,2 次,中性樹膠封片、顯微鏡觀察。 用Image-Pro Plus 進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計過程用GraphPad Prism 9.0 處理,計量資料用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組之間比較采用單因素方差分析,非配對t檢驗用兩組間比較。P< 0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 GlcNAc 下調(diào)L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 大鼠血清AMY、LPS 水平

L-精氨酸造模后,肉眼觀AP 組胰腺較對照組明顯水腫,滲出,同時AP 組大鼠血清AMY(8.97 ±0.42 U/mL)、LPS 水平(46.12 ± 3.84 U/L)較對照組(6.63 ± 0.25 U/mL),(22.92 ± 1.19 U/L)明顯升高(P< 0.05),表明AP 大鼠造模成功;高劑量GlcNAc + AP 組大鼠血清AMY(7.22 ± 0.32 U/mL)、LPS(27.28 ± 1.26 U/L)與AP 組大鼠相比均明顯下降(P< 0.05),同時低劑量GlcNAc + AP 組血清AMY(8.04 ± 0.40 U/mL)無顯著性差異,而LPS(32.66 ± 1.77 U/L)明顯低于AP 組(P< 0.05)。在大鼠腹腔肉眼觀中,低劑量GlcNAc + AP 組和高劑量GlcNAc + AP 組胰腺組織的水腫程度較AP 組明顯減輕;而在低劑量GlcNAc + AP 組AMY、LPS水平和高劑量GlcNAc + AP 組無顯著性差異(圖1)。 綜上所述,GlcNAc 可以降低L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 大鼠血清AMY、LPS 水平。

圖1 大鼠腹腔肉眼觀和血清AMY、LPSNote. A. Abdominal pancreas macroscopic view. B. Serum amylase and lipase concentrations of rats. Compared with AP group, *P < 0.05. (The same in the following figures)Figure 1 Abdominal cavity images of rats and concentration of AMY and LPS

2.2 GlcNAc 減輕L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 大鼠胰腺損傷

對照組大鼠在顯微鏡下可觀察到胰腺小葉間清晰,胰腺組織無水腫、壞死、出血等,其周圍無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。 AP 組有明顯的胰腺間質(zhì)水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤聚集、胰腺小葉間模糊、大量胰腺腺泡細(xì)胞壞死,未見明顯出血。 低劑量GlcNAc +AP 組大鼠可觀察到有胰腺間質(zhì)水腫、中量炎癥細(xì)胞浸潤聚集、胰腺小葉間模糊、腺泡細(xì)胞壞死,未見明顯出血。 高劑量GlcNAc + AP 組大鼠可觀察到有胰腺間質(zhì)輕度水腫、少量炎癥細(xì)胞浸潤聚集、胰腺小葉間稍模糊、腺泡細(xì)胞少量壞死,未見明顯出血(圖2)。 綜上所述,GlcNAc 可以減輕L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 大鼠胰腺的損傷。

圖2 GlcNAc 對大鼠胰腺組織形態(tài)的影響(HE 染色)Note. White arrow. Pancreas hemorrhage. Black arrow. Inflammatory cells infiltrate pancreatic tissue.Figure 2 Effect of GlcNAc on pancreatic histomorphology of rats(HE staining)

2.3 GlcNAc 對AP 大鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組炎癥因子IL-1β(0.18 ± 0.01 ng/mL)、IL-6(45.81 ± 1.16 pg/mL)、TNF-α(36.13 ±1.73 pg/mL)水平相比,AP 組血清炎癥因子IL-1β(0.44 ± 0.01 ng/mL)、IL-6(96.53 ± 2.71 pg/mL)、TNF-α(63.56 ± 1.74 pg/mL)水平明顯升高(P<0.05);低劑量GlcNAc + AP 組和高劑量GlcNAc +AP 組與AP 組相比,其血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯下降(P< 0.05);而低劑量GlcNAc+ AP 組和高劑量GlcNAc + AP 組之間,可以發(fā)現(xiàn)高劑量GlcNAc + AP 組血清炎癥因子IL-1β(0.29 ±0.01 ng/mL)、IL-6(65.70 ± 2.57 pg/mL)水平較低劑量GlcNAc + AP 組(0.37 ± 0.01 ng/mL,79.18 ±1.86 pg/mL) 明顯下降(P< 0.05),而高劑量GlcNAc + AP 組TNF-α(45.31 ± 3.48 pg/mL)僅略低于低劑量GlcNAc + AP 組(53.73 ± 2.13 pg/mL),且無顯著性差異(圖3)。 總的來說,GlcNAc可明顯降低AP 大鼠血清炎癥因子水平。

圖3 大鼠血清IL-1β、IL-6、和TNF-α 的表達(dá)Note. Compared with low GlcNAc + AP group,#P < 0.05. (The same in the following figures)Figure 3 Expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats

2.4 GlcNAc 抑制AP 大鼠MDA、SOD 的表達(dá)

與對照組MDA(3.99 ± 0.49 nmol/L),SOD(31.89 ± 0.84 nmol/L)相比,AP 組大鼠血清MDA(8.38 ± 0.48 nmol/L)水平明顯升高(P< 0.05),而SOD 水平(12.71 ± 1.30 nmol/L)明顯下降(P<0.05),表明AP 大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平明顯升高(圖4)。 高劑量GlcNAc + AP 組(6.03 ± 0.38 nmol/L)相比于AP 組MDA 水平明顯下降(P<0.05),SOD 水平(24.67 ± 1.74 nmol/L)明顯升高(P< 0.05),提示GlcNAc 可以顯著降低AP 大鼠氧化應(yīng)激水平。 低劑量GlcNAc + AP 組相比于AP組,MDA 水平(6.59 ± 0.42 nmol/L)明顯下降(P<0.05),SOD 水平(18.33 ± 2.29 nmol/L)略高,但都無顯著性差異。 同時,高劑量的GlcNAc 似乎比低劑量GlcNAc 更能降低AP 大鼠MDA、升高SOD,但兩者并無顯著性差異(圖4)。 總而言之,GlcNAc 可以明顯降低AP 大鼠氧化應(yīng)激水平。

圖4 大鼠血清MDA、SOD 濃度Figure 4 Concentration of MDA and SOD in serum of rats

2.5 GlcNAc 促進(jìn)AP 大鼠NRF2、HO-1 的表達(dá)

相比于對照組,AP 組大鼠NRF2、HO-1 的蛋白表達(dá)明顯下降(P< 0.05)。 而高劑量GlcNAc + AP組NRF2、HO-1 蛋白表達(dá)較AP 組明顯升高(P<0.05);同時,在低劑量GlcNAc + AP 組和高劑量GlcNAc + AP 組之間,高劑量GlcNAc + AP 組HO-1蛋白表達(dá)略高,但無顯著性差異(P> 0.05);綜上所述,推斷GlcNAc 促進(jìn)AP 大鼠NRF2/HO-1 軸的激活,抑制氧化應(yīng)激,減輕AP 大鼠胰腺損傷(圖5)。

圖5 GlcNAc 對大鼠胰腺NRF2、HO-1、PPAR-γ 蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響Note. A. Western Blot of NRF2, HO-1 and PPAR-γ in pancreatic tissue. B. Quantitative and analysis of NRF2, HO-1 and PPAR-γ in pancreatic tissue.Figure 5 Effect of GlcNAc on the proteins expression levels of NRF2, HO-1 and PPAR-γ in pancreas of rats

2.6 GlcNAc 促進(jìn)AP 大鼠M2 巨噬細(xì)胞極化

PPAR-γ 的表達(dá)與巨噬細(xì)胞極化密切相關(guān)[7]。在本實驗中,與對照組相比,Western Blot 檢測提示AP 組PPAR-γ 蛋白表達(dá)明顯降低(P< 0.05),同時,高劑量GlcNAc + AP 組PPAR-γ 較AP 組明顯升高(P< 0.05)(圖5)。 為求進(jìn)一步驗證GlcNAc與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系,進(jìn)行免疫熒光和免疫組化驗證。 各組大鼠CD86(M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)和CD206(M2 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)免疫組化顯示AP組與對照組相比,CD86 增高,CD206 降低,而無論低劑量GlcNAc + AP 組還是高劑量GlcNAc + AP組都可明顯抑制這一現(xiàn)象(圖6)。 同時,免疫熒光提示F4/80(巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)與CD86、CD206 等存在共定位的現(xiàn)象,表示CD86、CD206 分別代表胰腺組織中的M1 型極化巨噬細(xì)胞和M2 型極化巨噬細(xì)胞。 AP 組免疫熒光提示CD86 明顯升高、CD206 明顯下降,提示巨噬細(xì)胞向M1 促炎型轉(zhuǎn)化。 而在高劑量GlcNAc + AP 組中,免疫熒光及定量分析提示CD206 明顯升高、CD86 明顯下降(P< 0.05)。 這結(jié)果表明GlcNAc 干預(yù)可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 抗炎型轉(zhuǎn)化。 低劑量GlcNAc + AP 組免疫熒光定量提示CD86 明顯降低(P< 0.05),但對于CD206 的影響不明顯。 同時,高劑量GlcNAc + AP 組相比于低劑量GlcNAc + AP 組,其CD206 定量分析明顯升高(圖7,圖8)(P< 0.05)。 綜上所述,GlcNAc 促進(jìn)AP 大鼠巨噬細(xì)胞向M2 型抗炎型轉(zhuǎn)化。

圖6 大鼠胰腺CD86、CD206 免疫組化Figure 6 Immunohistochemistry of CD86 and CD206 in rats pancreatic tissue

圖7 大鼠胰腺CD86 免疫熒光及定量分析Note. A. Immunofluorescence of pancreatic CD86 in four groups of rats. Green. CD86. Blue. Nucleus. Red. F4/80. B. Quantitative analysis of CD86 immunofluorescence in four groups of rats (ratio of CD86 relative fluorescence intensity to F4/80 relative fluorescence intensity).Figure 7 Immunofluorescence and quantitative analysis of CD86 in rats pancreatic tissue

圖8 大鼠胰腺CD206 免疫熒光及定量分析Note. A. Immunofluorescence of pancreatic CD206 in four groups of rats. Green. CD206. Blue. Nucleus. Red. F4/80. B. Quantitative analysis of CD206 immunofluorescence in four groups of rats (ratio of CD206 relative fluorescence intensity to F4/80 relative fluorescence intensity).Figure 8 Immunofluorescence and quantitative analysis of CD206 in rats pancreatic tissue

3 討論

急性胰腺炎的治療,臨床上多以抑制胰酶、抗炎、止痛、胃腸道減壓、靜脈營養(yǎng)對癥治療,但仍有部分患者得不到有效的治療。 因此,尋找治療AP的手段,仍為重中之重。 通過胰腺炎的病理生理機(jī)制研究,減少Ca2+超載、抑制ROS、恢復(fù)腺泡細(xì)胞自噬、減輕線粒體功能障礙、抑制腺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原過早激活、抑制巨噬細(xì)胞M1 型極化和促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型極化可能是胰腺炎治療研究的重要著手點。

在本實驗中,發(fā)現(xiàn)GlcNAc 可明顯減輕AP 大鼠氧化應(yīng)激和胰腺損傷。 對比AP 組,可以發(fā)現(xiàn)高劑量GlcNAc + AP 組血清AMY、LPS 水平明顯降低,而低劑量GlcNAc + AP 組雖然LPS 水平明顯降低,但血清AMY 水平僅略低于AP 組(無顯著性差異)?？紤]到AMY、LPS 與胰腺炎嚴(yán)重程度并不完全平行,進(jìn)一步檢測了炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的水平。 無論是低劑量GlcNAc + AP 組,還是高劑量GlcNAc + AP 組,其炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)都明顯下降,這表示GlcNAc 治療可以減輕AP 大鼠的炎癥程度。 在氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物的Western Blot 檢測中發(fā)現(xiàn),相比于AP 組,高劑量GlcNAc +AP 組MDA 水平明顯降低,SOD 水平明顯升高(P<0.05),而低劑量GlcNAc + AP 組中,MDA 水平僅稍降低,SOD 含量僅稍高于AP 組,且沒有顯著性差異,這提示低劑量GlcNAc 可能對于L-精氨酸造模的中重度AP 來說,其抑制氧化應(yīng)激能力較弱。 低劑量GlcNAc 對于AP 的影響,可能需要更為輕型的AP 模型(例如雨蛙肽誘導(dǎo)AP 模型)去進(jìn)一步探討其抑制氧化應(yīng)激能力。

既往的研究中,NRF2/HO-1 通路在眾多研究中被證實參與了AP 病情的發(fā)生發(fā)展,且與氧化應(yīng)激相關(guān)[17-18]。 Shi 等[19]研究表明,LipoxinA4 受體激動劑BML-111 通過NRF2 調(diào)節(jié)的抗氧化途徑改善急性胰腺炎后的腸道紊亂。 Mei 等[20]研究表明由GlcNAc 以β-1,4 糖苷鍵結(jié)合而成的多糖-殼寡糖(COS)可改善胰腺損傷的嚴(yán)重程度,防止腸屏障破壞并減少SAP 中的炎癥和氧化損傷。 其主要的保護(hù)機(jī)制歸因于腸道微生物群的重塑以及Nrf2/HO-1通路的調(diào)節(jié)。 本實驗研究了GlcNAc 與NRF2/HO-1通路和氧化應(yīng)激之間的關(guān)系,高劑量GlcNAc + AP組大鼠血清中NRF2、HO-1 的表達(dá)明顯升高,然而,低劑量GlcNAc + AP 組大鼠血清HO-1、NRF2 表達(dá)升高不明顯,這可能的原因是低劑量GlcNAc 對于NRF2-HO-1 信號通路的激活能力較弱。 同時,NRF2除了作用于HO-1 這一下游之外,還作用于下游其他基團(tuán),如還原型輔酶/醌氧化還原酶(NADPH)、谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)等。 進(jìn)一步了解GlcNAc對NRF2/HO-1 通路的影響,可以通過增加多個GlcNAc 劑量干預(yù)組,同時納入NADPH、GPX4 等NRF2 其他下游基團(tuán)進(jìn)行驗證。

對于巨噬細(xì)胞M2 型極化和AP 之間的研究,促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 型極化可能是減輕AP 胰腺損傷甚至其他臟器損傷的有效方法。 Taguchi 等[21]研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射一種針對巨噬細(xì)胞的新型納米一氧化碳結(jié)合血紅蛋白囊泡( CO-bound hemoglobin vesicles,CO-HBVE),可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M2 樣表型,從而抑制胰腺中性粒細(xì)胞的浸潤,減輕胰腺炎所致的肺損傷。 與藥物治療相比,一些特殊的外科技術(shù)也可能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化來治療AP。 研究表明,在重癥AP 大鼠中,腹部穿刺術(shù)和引流術(shù)可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化到M2 型,這可能是由于胰腺炎相關(guān)的腹水清除和腹腔炎性環(huán)境改善所致[22]。針對M1 極化的實驗中,在用表達(dá)miRNA-16 的慢病毒轉(zhuǎn)染從AP 大鼠分離的腹腔巨噬細(xì)胞后,巨噬細(xì)胞的極化從M2 型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1 型,并在功能上激活了CD4+T 細(xì)胞,加劇炎癥的程度[23]。 此外,最近的報道表明,在小鼠胰腺中,巨噬細(xì)胞可能參與誘導(dǎo)腺泡-導(dǎo)管化生(acinar-to-ductal metaplasia,ADM),以及促進(jìn)胰腺β-細(xì)胞再生[24]。

本實驗中,首先對胰腺組織進(jìn)行免疫熒光檢測,采用F4/80 標(biāo)記大鼠胰腺巨噬細(xì)胞,然后進(jìn)行巨噬細(xì)胞表型的熒光檢測,發(fā)現(xiàn)在AP 組可見M1 型極化明顯升高,表現(xiàn)為CD206 明顯下降,CD86 明顯上升(P< 0.05)。 而在高劑量GlcNAc + AP 組中,可以看到M1 型極化明顯抑制,M2 型極化明顯上升,表現(xiàn)為CD206 明顯上升,CD86 明顯下降(P<0.05)。 同時,在低劑量GlcNAc + AP 組和高劑量GlcNAc + AP 組的比較中,高劑量GlcNAc + AP 組M2 極化上升更加明顯(P< 0.05)。 接著,用Western Blot 對胰腺組織PPAR-γ 的蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)AP 組PPAR-γ 蛋白表達(dá)明顯降低,而應(yīng)用GlcNAc 干預(yù)的低劑量GlcNAc + AP 組和高劑量GlcNAc + AP 組,其PPAR-γ 蛋白表達(dá)明顯上升(P< 0.05),這也進(jìn)一步驗證了本實驗結(jié)果。 同時,在對各組大鼠CD86、CD206 免疫組化的檢測中,也可以發(fā)現(xiàn)GlcNAc 治療后,大鼠CD206 含量明顯升高,CD86 含量明顯下降。 這充分證明GlcNAc 治療促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化,減輕AP 大鼠胰腺損傷。

綜上所述,在L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 大鼠模型中,NRF2/HO-1 信號通路被激活,巨噬細(xì)胞表型向促炎型M1 轉(zhuǎn)化,而GlcNAc 治療可通過抑制NRF2/HO-1 信號通路的激活,促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型向抑炎型M2 轉(zhuǎn)化,從而減輕AP。