新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)規(guī)?；驁龈篂a羔羊源大腸桿菌的分離鑒定及毒力基因和耐藥基因分析

董 貴，于月通，馬志遠，王 堯，盛光玉，陶大勇，齊 萌

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室， 新疆 阿拉爾843300；2.塔城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 塔城 834700）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起羔羊腹瀉的主要病原菌之一， 可導(dǎo)致腹瀉羔羊50%以上的死亡率，常給羊養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失［1］。 根據(jù)Clermont 等［2］建立的分群方法，將大腸桿菌分為A 群、B1 群、B2 群和D 群， 不同群組間大腸桿菌攜帶的毒力基因具有一定差異。研究表明，大腸桿菌所攜帶的毒力基因種類與致病性有密切關(guān)系，其中腸細(xì)胞脫落位點（locus of enterocyteeffacement，LEE） 毒力島、 耶爾森菌強毒力島 （highpathogenicity island，HPI）可編碼多種毒力基因，是致病性大腸桿菌重要的毒力因子［3］； 溶血素（hemolysin，Hlf）可溶解細(xì)胞，造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，在大腸桿菌致病過程中起到了重要作用［4］。 由于臨床生產(chǎn)中使用抗菌藥物不合理， 導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性不斷增強， 給羊大腸桿菌病的防治帶來較大的挑戰(zhàn)。令人擔(dān)憂的是，耐藥的動物源大腸桿菌及其耐藥基因可通過食物鏈、 生產(chǎn)鏈和糞便等途徑傳給人類，危害人類健康［5］。

隨著新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的快速規(guī)?；l(fā)展，圈養(yǎng)羊數(shù)量不斷增加，羊腹瀉發(fā)生較普遍，對養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成較大的威脅。生產(chǎn)中為治療羊腹瀉， 基層養(yǎng)殖人員大量使用抗菌藥物，造成羊源大腸桿菌產(chǎn)生較多耐藥株，其耐藥機制也日趨復(fù)雜，呈現(xiàn)多種耐藥現(xiàn)象，潛在影響了羊肉食品質(zhì)量安全和環(huán)境衛(wèi)生安全［6］。 本試驗旨在分離鑒定和田地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場腹瀉羔羊糞便中的大腸桿菌，檢測其毒力基因和耐藥基因，以期為該地區(qū)規(guī)?；驁龊侠碛盟?， 預(yù)防和治療羔羊腹瀉病提供有益參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糞便樣本來源

于2019 年1—9 月，分別在和田地區(qū)策勒縣、和田縣和于田縣3 個規(guī)模化羊場收集40 日齡以內(nèi)腹瀉羔羊肛拭子樣本共70 份，其中策勒縣23份、和田縣30 份和于田縣17 份， 標(biāo)記信息后置4 ℃冷藏箱，送至實驗室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂（MAC）培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂（EMB）培養(yǎng)基，奧博星生物技術(shù)（北京） 有限責(zé)任公司產(chǎn)品；DL 2 000 Marker、2×Easy Taq PCR Super Mix（+dye）、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，全式金生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，濱和微生物試劑（杭州）有限公司產(chǎn)品；革蘭染色液，為筆者所在實驗室自配。

1.2 試驗方法

1.2.1 糞便樣本處理

1.2.2 大腸桿菌的分離及形態(tài)學(xué)鑒定

取上述增菌液中的菌液分別劃線接種于EMB 固體培養(yǎng)基、MAC 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，挑選在EMB 平板上呈現(xiàn)金屬光澤的單一菌落和MAC 平板上玫紅色疑似大腸桿菌的單一菌落，進行純化。純化完成后挑選形態(tài)良好的單菌落進行革蘭染色， 經(jīng)普通光學(xué)顯微鏡進行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察和鑒定。

1.2.3 大腸桿菌的生化鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察后，無菌吸取5 μL 增菌液，按照說明書操作， 置入生化管內(nèi)，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)完成后觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果， 結(jié)果參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［7］進行生化鑒定。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA 提取和PCR 擴增

經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定為疑似大腸桿菌的分離菌，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書對分離菌株進行DNA 提取。 參照劉肖利等［8］報道的序列，設(shè)計細(xì)菌線粒體16S rDNA 通用引物進行PCR擴增， 上游引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 下游引物序列為1 492 R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。 PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL，陰性對照是將DNA 模板替換成ddH2O。PCR 擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴增結(jié)束后，吸取5 μL 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀拍照。 將PCR 陽性產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進行雙向測序， 測序結(jié)果進行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析后鑒定分離細(xì)菌的種類。

1.2.5 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群的鑒定

根據(jù)Clermont 等［2］報道設(shè)計大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群基因引物序列，引物序列和目的片段見表1。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix（+dye）12.5 μL， 上、 下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL。 PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

因為人類生活的環(huán)境具有相似性，所以在交際過程中存在雙方互明的共知環(huán)境，也就是相互認(rèn)知環(huán)境。在電影字幕翻譯中，如果新信息與譯語觀眾過去的知識或經(jīng)驗是一致的或相關(guān)的，那么譯語觀眾就可以理解源語作者的信息意圖。心理學(xué)家巴特利特（Bartlett）將“對過去的反應(yīng)和經(jīng)驗的積極組織”定義為圖式。[5]因此，在這種情況下，譯者可以通過激活譯語觀眾的相關(guān)圖式，從而使他們把握源語作者的信息意圖，獲得足夠的語境效果。我們來看《英倫對決》電影中相關(guān)情況的一些例子。

表1 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群分型鑒定PCR 引物信息

根據(jù)電泳結(jié)果鑒定大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育群分型，鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：同時在chuA 和yjaA 基因位點或同時在chuA、TspE4.C2 和yjaA 基因位點PCR 擴增成功的分離菌屬于B2 群； 僅在chuA 基因位點或同時在chuA 和TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的分離菌屬于D 群；僅在TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的分離菌屬于B1 群； 僅在yjaA 基因位點PCR 擴增成功或在3 個位點均PCR 擴增不出條帶的分離菌屬于A 群。

1.2.6 大腸桿菌毒力基因和耐藥基因的PCR 擴增

分 別 參 考 孟 相 秋［9］和 劉 少 昆［10］的 報 道 設(shè) 計 大腸桿菌毒力基因和耐藥基因引物， 引物序列和目的片段見表2 和表3。 PCR 反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix （+dye） 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表2 和表3），72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表2 大腸桿菌毒力基因PCR 引物信息

表3 大腸桿菌耐藥基因PCR 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)和生化鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定，從70 份腹瀉羔羊糞便樣本中初步分離大腸桿菌38 株，分離率為54.3%（38/70）。 分離菌在MAC 培養(yǎng)基中呈紅色透明菌落（見圖1）；挑取單個菌落革蘭染色鏡檢，可見分離菌兩端鈍圓形，為紅色短桿狀的陰性菌。分離菌在EMB 培養(yǎng)基中呈金屬光澤的菌落（見圖2）；挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢， 同樣可見分離菌為紅色短桿狀的陰性菌。

圖1 分離菌株在MAC 平板上的菌落形態(tài)

圖2 分離菌株在EMB 平板上的菌落形態(tài)

對38 株分離菌進行生化鑒定， 結(jié)果顯示，分離菌均可發(fā)酵鼠李糖、木糖、蕈糖等糖；靛基質(zhì)、MR 試驗均顯示陽性；尿素、硫化氫和VP 試驗均為陰性，與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中大腸桿菌的生化鑒定結(jié)果相符合。

2.2 分離菌株的16S rDNA 序列PCR 擴增、測序及比對

對經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化鑒定初步鑒定為大腸桿菌的38 個分離菌， 采用PCR 法擴增其16S rDNA 序列。結(jié)果表明，38 株疑似大腸桿菌均擴增出1 500 bp左右的目的條帶（見圖3）。 38 份PCR 產(chǎn)物均成功測序，發(fā)現(xiàn)本試驗所獲分離菌的16S rDNA 序列與美國加利福尼亞州牛糞便來源大腸桿菌（GenBank登錄號：CP050498） 的16S rDNA 序列同源性為99.3%～100%。 基于分離菌株形態(tài)學(xué)、生化鑒定和16S rDNA 序列鑒定結(jié)果， 可以確定分離的38 株菌均為大腸桿菌。

圖3 分離菌株基于細(xì)菌16S rDNA 基因的PCR 擴增結(jié)果

2.3 大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群分型鑒定

3 個基因位點的目的片段PCR 擴增結(jié)果見圖4。 38 株大腸桿菌分離菌中， 僅在yjaA 基因位點PCR 擴增成功的分離菌共計10 株，鑒定為A 群，所占比例為26.3%（10/38）；僅在TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的分離菌共計26 株， 鑒定為B1群， 所占比例為68.4%（26/38）； 同時在chuA 和TspE4.C2 基因位點PCR 擴增成功的2 個分離菌，鑒定為D 群，所占比例為5.3%（2/38）；未檢測到B2 群大腸桿菌。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育群分型3 個基因位點PCR 擴增結(jié)果

2.4 大腸桿菌毒力基因的檢測

采用PCR 法檢測38 株大腸桿菌分離菌的8種毒力基因，結(jié)果檢測到4 種毒力基因（見表4），其中以攜帶fimC 基因的菌株最多， 所占比例為92.1%（35/38），其余依次為irp2 基因［所占比例為47.4%（18/38）］、hlyF 基因 ［所占比例為36.8%（14/38）］、 fyuA［所占比例為34.2%（13/38）］；分離菌中未檢測到大腸桿菌eaeA 基因、LT 基因、LT基因和Stx1 基因。

2.5 大腸桿菌耐藥基因的檢測

采用PCR 法檢測38 株E.coli 分離菌的8 種耐藥基因，結(jié)果檢測到6 種耐藥基因（見表5），其中以攜帶磺胺類耐藥基因的菌株數(shù)最多，sul2 基因占42.1%（16/38）；攜帶氯霉素類cmlA 基因和四環(huán)素類tet（B）基因的菌株數(shù)較少，所占比例分別為5.3%（2/38）和13.2%（5/38）；分離菌均未檢測到氨基糖苷類耐藥基因。

表5 分離菌株不同大腸桿菌耐藥基因檢測結(jié)果

3 討論

大腸桿菌是引起羔羊腹瀉和死亡的主要病原之一， 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中一定程度上制約著養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。 江婉琳等［11］從新疆克拉瑪依地區(qū)分離奶牛源大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育群分型顯示B1 群占70.9%，未檢出B2 群。 顧曉曉［12］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆部分地區(qū)分離牛、 羊腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育群分型顯示多屬于A 和B1 群。 本試驗分離得到的大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育群分型結(jié)果顯示，38 株大腸桿菌分離株具有多樣性，B1 群占68.4%，同樣未檢出B2 群，提示新疆地區(qū)牛、羊源大腸桿菌以B1群為優(yōu)勢群。

大腸桿菌的致病性與攜帶的毒力基因密切相關(guān)。 劉英玉等［13］對庫爾勒地區(qū)2 個育肥場、1 個繁殖場中分離到的185 份羊源大腸桿菌進行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)攜帶的毒力基因主要為Stx1 基因，為24.3%（45/185），未檢測出eaeA 基因。 佟盼盼等［14］對新疆部分地區(qū)養(yǎng)殖場、 屠宰場和市場中收集的202 份羊源大腸桿菌進行毒力基因檢測， 發(fā)現(xiàn)攜帶的毒力基因主要為Stx1 和hly， 所占比例為68.0%（17/25），未檢測出eaeA 基因。 趙學(xué)亮等［15］對陜西部分地區(qū)分離得到的50 株腹瀉羊源致病性大腸桿菌進行毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，eaeA 基因所占比例為32.0%（16/50），未檢出Stx1 基因。 王顯峰等［16］對內(nèi)蒙古扎蘭屯地區(qū)45 株羊源大腸桿菌毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)，irp2、fyuA 基因檢出率均為100%（45/45）、eaeA 基因為33.3%（15/45）、Stx1 為4.4%（2/45）。 本試驗對38 株腹瀉羊源致病性大腸桿菌毒力基因的檢測結(jié)果顯示，irp2 基因為47.4%（18/38）、hlyF 為36.8%（14/38）， 未檢測出Stx1 基因和eaeA 基因。上述研究結(jié)果表明致病性大腸桿菌菌株間攜帶的毒力基因不同可能與宿主來源和地區(qū)分布差異有關(guān)。

大腸桿菌耐藥性的增強主要與菌株間的接合、轉(zhuǎn)化及各耐藥基因間的水平傳播等有關(guān)，致使菌株呈現(xiàn)多重耐藥性［17］。 陳家露等［18］檢測西藏那曲市26 株羊源致病性大腸桿菌的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出率為100%（26/26）。 劉正明等［19］檢測內(nèi)蒙古地區(qū)108 株羊源大腸桿菌的耐藥基因發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出率為99.1%（107/108），氨基糖苷類、磺胺類和喹諾酮類耐藥基因檢出率均在50.0%以上。 顧曉曉等［20］檢測新疆石河子地區(qū)100 株羊源大腸桿菌氨基糖苷類耐藥基因，發(fā)現(xiàn)aph 和aadA 基因的檢出率分別為89%（89/100） 和98%（98/100）。 本試驗檢測和田地區(qū)38 株羊源大腸桿菌耐藥基因，發(fā)現(xiàn)磺胺類耐藥基因sul2 檢出率為42.1%（16/38），β-內(nèi)酰胺類耐藥基因檢出率為18.4%（7/38），未檢出氨基糖苷類耐藥基因，這與上述報道存在一定的差異，提示不同地區(qū)的羊源大腸桿菌耐藥基因可能因羊的飼喂情況、用藥情況、菌株地理分布等因素而存在差異。因此，在臨床治療羔羊腹瀉時，應(yīng)合理用藥，避免更多耐藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

該研究發(fā)現(xiàn)， 和田地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場腹瀉羔羊大腸桿菌感染率較高， 系統(tǒng)發(fā)育群主要為B1群，可攜帶多種毒力基因和耐藥基因，對綿羊的健康養(yǎng)殖存在一定危害。