飼料中粗脂肪超聲提取快速測定方法的研究

高志存，高 蕓，余舒寧，袁雪波，王 薇，萬彬彬，崔惠娟

（1.云南省紅河哈尼族彝族自治州動物疫病預(yù)防控制中心，云南 紅河哈尼族彝族自治州 661199；2.云南省紅河哈尼族彝族自治州農(nóng)民科技教育培訓(xùn)中心，云南 紅河哈尼族彝族自治州 661199；3.云南省紅河哈尼族彝族自治州動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 紅河哈尼族彝族自治州 661199）

粗脂肪是飼料中重要的組成成分之一， 是動物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)物質(zhì)。 飼料中粗脂肪含量是衡量飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，因此，準(zhǔn)確測定飼料中粗脂肪含量， 對評價飼料質(zhì)量和指導(dǎo)飼料配方設(shè)計及優(yōu)化具有重要意義［1］。 目前，飼料中粗脂肪含量測定方法包括索氏提取法（油重法）、殘余法、濾袋法、快速溶劑萃取法等，但大多存在操作繁瑣、耗時長等問題，難以滿足大批量樣品檢測需求［2-8］。 超聲提取技術(shù)是將超聲換能器的振動在溶液中產(chǎn)生的空化等各種特殊作用， 用于待測樣本化學(xué)成分提取工藝中， 促使樣本中所含成分快速、高效率地溶入溶劑中的一項提取技術(shù)，具有快速、高效、方便、提取率高等優(yōu)點［9］。 超聲提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥、食品、油脂等特定成分提取和檢測中， 但在飼料粗脂肪提取中的應(yīng)用尚無報道［10-17］。

本文利用超聲波特有的高頻率以及超聲波在媒質(zhì)中高速傳播的工作原理， 將其首次應(yīng)用于飼料中粗脂肪的提取測定，以期建立一種能快速、簡便、準(zhǔn)確測定飼料中粗脂肪含量的方法，并分析比較超聲提取法和索氏提取法在測定飼料粗脂肪含量的差異，以期為實際檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 飼料樣品來源

飼料樣品共計14 種， 包括草魚膨化配合飼料、 仔豬前期配合飼料、 生長育肥豬前期配合飼料、生長育肥豬后期配合飼料、肉用仔雞前期配合飼料、肉用仔雞中期配合飼料、肉用仔雞后期配合飼料、產(chǎn)蛋雞育成前期配合飼料、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋高峰期配合飼料、產(chǎn)蛋種雞配合飼料、仔豬濃縮飼料、熊飼料、玉米、豆粕，來源于云南省紅河哈尼族彝族自治州飼料生產(chǎn)企業(yè)和畜禽養(yǎng)殖場。 飼料樣品按《動物飼料 試樣的制備》（GB/T 20195—2006）用四分法縮減至500 g，粉碎后過40 目篩，混勻后裝入樣品瓶中備用。

1.1.2 主要試劑耗材石油醚（沸程30～60 ℃），購自重慶川東化工（集團）有限公司；海砂（含量不少于99.8%），購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；定性濾紙（12.5 cm），購自杭州新華紙業(yè)有限公司；高型稱樣瓶（40 mm×70 mm），購自福州北玻實驗儀器有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

CSM-1 型旋風(fēng)式樣品磨， 購自北京一輕研究院有限公司；AG-204 型電子天平， 購自瑞士梅特勒公司；101C-IIB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，購自上海實驗儀器廠有限公司；SZC-101 型脂肪測定儀，購自上海纖檢儀器有限公司；SK5200HP 型超聲波清洗器，購自上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；超聲波脂肪快速測定儀（專利號：ZL 2021 2 1564314.6），筆者所在實驗室自行研發(fā)。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲提取法

精密稱?。?.000 0±0.000 5）g 飼料樣品和2 g海砂于定性濾紙上，疊成濾紙包，用鉛筆編號，裝入稱樣瓶中，放入103 ℃烘箱中干燥4 h，取出放入干燥器中冷卻至室溫，稱重后記為m1；將濾紙包轉(zhuǎn)移至超聲波脂肪快速測定儀的廣口瓶中， 按一定液料比（V/W）加入適量石油醚，進(jìn)行超聲波處理。 超聲提取結(jié)束后， 用30 mL 石油醚沖洗濾紙包，將濾紙包裝入相應(yīng)的稱樣瓶中，放入103 ℃烘箱中干燥1 h， 取出放入干燥器中冷卻至室溫，稱重后記為m2。

結(jié)果計算：粗脂肪含量（%）=（m1-m2）/m×100；式中，m 為飼料樣品的質(zhì)量（g），m1為超聲提取前恒重的濾紙包+稱樣瓶質(zhì)量（g），m2為超聲提取后恒重的濾紙包+稱樣瓶質(zhì)量（g）。

1.2.2 索氏提取法

精密稱?。?.000 0±0.000 5）g 飼料樣品于定性濾紙上，疊成濾紙包，用鉛筆編號，放入103 ℃烘箱中干燥4 h，取出裝入濾紙筒架內(nèi)，把濾紙筒放到脂肪測定儀中，置于回收位置；將鋁杯編號，放入103 ℃烘箱中干燥1 h，取出放入干燥器中冷卻至室溫，稱重后記為m1；在鋁杯中加入50 mL 石油醚，放入托架上，移入脂肪測定儀加熱板內(nèi)，拉下壓桿，將濾紙筒移至浸泡位置，接通冷凝水；打開電源開關(guān)，手握把下移，將試樣降至鋁杯底，55 ℃浸泡1 h； 將提把升至抽提位置，75 ℃抽提1 h；將提把升至回收位置，85 ℃回收15 min；回收完成后，將壓桿抬起，取出鋁杯，放入103 ℃烘箱中干燥1 h，移入干燥器中冷卻至室溫，稱重后記為m2。

結(jié)果計算：粗脂肪含量（%）=（m2-m1）/m×100；式中，m 為飼料樣品的質(zhì)量（g），m1為恒重的空鋁杯質(zhì)量（g），m2為恒重的鋁杯+濾紙包質(zhì)量（g）。

1.2.3 超聲提取工藝單因素試驗設(shè)計

選擇草魚膨化配合飼料為試驗樣品， 設(shè)計單因素試驗， 考查分析各因素不同水平對粗脂肪含量測定的影響，單因素試驗設(shè)計見表1。 各影響因素各水平分別進(jìn)行獨立提取試驗， 且每個試驗分別設(shè)3 個平行樣， 結(jié)果取3 次試驗的平均值，用Origin 2019 軟件繪圖。

1.2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以液料比、浸泡時間、超聲時間、超聲次數(shù)為研究對象，粗脂肪含量為考查指標(biāo)，設(shè)計4 因素3 水平L9（34）正交試驗，優(yōu)化飼料粗脂肪超聲提取工藝， 各正交試驗均進(jìn)行2次平行重復(fù)試驗。 同時，利用Minitab 18 軟件對正交試驗結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。

1.2.5 最佳超聲提取工藝條件的試驗驗證

按正交試驗優(yōu)化后的最佳條件， 測定草魚膨化配合飼料中粗脂肪含量， 并與索氏提取法測定結(jié)果進(jìn)行比較，重復(fù)6 次，取平均值。

1.2.6 兩種提取方法的比較

超聲提取工藝確定后， 分別采用此工藝條件和索氏提取法測定13 種飼料樣品中的粗脂肪含量，重復(fù)6 次，測定結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。利用SPSS 18 統(tǒng)計學(xué)軟件中配對樣本t 檢驗法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1 可知，隨著液料比的增加，粗脂肪含量先逐漸增大后基本保持平穩(wěn)。當(dāng)液料比較低時，濾紙包不能完全浸泡在提取溶劑中， 濾紙包與提取溶劑接觸不充分，空化效應(yīng)弱，從而導(dǎo)致粗脂肪提取率低。液料比增加時，濾紙包與提取溶劑接觸充分，空化效應(yīng)增強，使粗脂肪提取率增加，因此，后續(xù)正交試驗液料比選擇25、37.5、50 mL/g。

圖1 液料比對粗脂肪含量測定的影響

由圖2 可知，隨浸泡時間的增加，粗脂肪含量略有增加，但差距不大。為了使浸泡時間考查覆蓋范圍更廣，所以后續(xù)正交試驗中浸泡時間選擇0、60、120 min。

圖2 浸泡時間對粗脂肪含量測定的影響

由圖3 可知，隨著超聲時間延長，粗脂肪含量呈先升高后保持平緩的趨勢，而超聲30、40、50 min時的粗脂肪含量測定結(jié)果基本一致， 為了考查超聲30 min 時是否為粗脂肪提取的拐點，所以后續(xù)正交試驗超聲時間選擇20、30、40 min。

圖3 超聲時間對粗脂肪含量測定的影響

由圖4 可知，隨著超聲次數(shù)增加，粗脂肪含量呈先升高后平緩的趨勢， 而超聲次數(shù)為2、3、4、5次時的粗脂肪含量測定結(jié)果基本一致， 為了考查超聲次數(shù)為2 時是否為拐點， 所以后續(xù)正交試驗中超聲次數(shù)選擇1、2、3 次。

圖4 超聲次數(shù)對粗脂肪含量測定的影響

通過單因素試驗分析各因素不同水平對粗脂肪含量測定的影響結(jié)果可設(shè)計正交試驗各因素水平，正交試驗因素水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素水平設(shè)計

2.2 正交試驗和方差分析結(jié)果

由表3 和表4 可知， 各因素對飼料粗脂肪超聲提取影響大小依次為： 超聲次數(shù)>液料比>超聲時間>浸泡時間；超聲次數(shù)、液料比和超聲時間均對飼料粗脂肪超聲提取率具有極顯著（P<0.01）影響； 浸泡時間對飼料粗脂肪超聲提取率具有顯著（P<0.05）影響。

表3 正交試驗結(jié)果及直觀分析結(jié)果

表4 方差分析

以k 值為依據(jù)， 各影響因素中k 值最大的組合A3B3C3D3是最優(yōu)選擇。 但是， 比較A2B1C2D3和A3B1C3D2組合的檢測結(jié)果，二者相差不大，且在單因素試驗中， 可以看出浸泡時間對粗脂肪超聲提取影響不是很大，超聲30 min 和超聲40 min，超聲2 次和3 次的檢測結(jié)果相近。 故綜合考慮檢測成本、檢測時間、準(zhǔn)確性等因素，認(rèn)為飼料粗脂肪超聲提取的最佳工藝條件為：液料比37.5 mL/g，浸泡0 min，超聲時間30 min，超聲提取2 次。

2.3 最佳超聲提取工藝條件的驗證

按照“2.2”項下確定的超聲提取最佳工藝條件，重復(fù)測定6 次，飼料中粗脂肪含量測定結(jié)果分別為：4.72%、4.68%、4.75%、4.83%、4.79%、4.77%，平均值4.76%。 同時，采用索氏提取法測定同一飼料樣品粗脂肪含量，重復(fù)測定6 次，結(jié)果分別為：4.76%、4.77%、4.78%、4.77%、4.79%、4.74%， 平均值4.77%。 試驗證明該工藝穩(wěn)定且可行。

2.4 超聲提取法和索氏提取法的比較

分別采用超聲提取法和索氏提取法測定13種不同飼料樣品粗脂肪含量， 兩種方法測定結(jié)果基本一致， 符合 《飼料中粗脂肪的測定》（GB/T 6433—2006）中關(guān)于重復(fù)性的要求（≤0.25%），結(jié)果見表5。 由表6 可知，兩種方法測定飼料粗脂肪含量差異不顯著（P>0.05）。

表5 超聲提取法和索氏提取法粗脂肪測定結(jié)果分析 單位：%

表6 超聲提取法和索氏提取法的t 檢驗結(jié)果

3 討論

3.1 海砂的使用

裝有飼料樣品的濾紙包， 放入廣口瓶超聲提取時，濾紙包漂浮在液面上，濾紙包與提取溶劑接觸不充分，直接影響到超聲提取效果。為解決這個難題，筆者進(jìn)行了多方摸索。將裝有飼料樣品的濾紙包和1 個直徑35 mm 的POM 球，裝于同一個塑料網(wǎng)兜中，在放入廣口瓶超聲提取時，濾紙包全部浸泡在提取溶劑中，濾紙包浮在液體中上部，超聲提取效果有所改善，但仍未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，且易污染，操作不簡便。 受水分測定時海砂使用的啟發(fā)，將飼料樣品和海砂混合，疊成濾紙包，放入廣口瓶超聲提取， 一方面濾紙包中的飼料樣品通透性增加，與提取溶劑接觸更充分，另一方面濾紙包沉于瓶底，不翻轉(zhuǎn)、不移動，更接近超聲波聲源，從而使超聲提取效果大大增強。

3.2 濾紙包的稱量

濾紙包經(jīng)溶劑超聲提取、 干燥后很容易吸潮，稱量過程中，在分析天平上很難平衡，讀數(shù)不準(zhǔn)，會對實驗結(jié)果造成影響。本實驗將濾紙包放入40 mm×70 mm 規(guī)格的高型稱樣瓶中進(jìn)行稱量，很好地解決了濾紙包在分析天平上讀數(shù)不準(zhǔn)的問題。 稱樣瓶規(guī)格不宜過小，否則濾紙包不便放入稱樣瓶中，即使放入后，多次拿取也易造成濾紙包破損。

3.3 超聲提取后沖洗濾紙包

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，超聲提取結(jié)束后，直接將濾紙包裝入稱樣瓶中干燥稱重， 超聲提取法測得的粗脂肪含量值比索氏提取法測得值低。分析原因，是飼料中超聲提出的少量粗脂肪吸附在濾紙包上，必須進(jìn)行清洗。 超聲提取結(jié)束后，用適量石油醚沖洗濾紙包， 再將濾紙包裝入稱樣瓶中干燥稱重， 所測得的粗脂肪含量值與索氏提取法測得值接近。

3.4 超聲波清洗器的選擇

目前超聲提取方面的文獻(xiàn)大多對超聲功率、頻率進(jìn)行了優(yōu)化，最佳超聲功率多在250～540 W［18-27］，而實驗室常用超聲波清洗器的功率大多在200 W、40～60 kHz，為確保研發(fā)的飼料中粗脂肪超聲提取快速測定方法可以用實驗室常用的儀器設(shè)備自行組配檢測， 在研發(fā)過程中就使用實驗室常用功率的超聲波清洗器進(jìn)行試驗。

3.5 超聲提取法應(yīng)用范圍廣

本實驗中， 選用脂肪含量高的草魚膨化配合飼料為試驗材料，進(jìn)行單因素和正交試驗，確定出超聲提取粗脂肪的最佳工藝條件。 再選用市場上常見的飼料原料（玉米、豆粕）及豬、雞等動物性飼料產(chǎn)品用超聲提取法測定粗脂肪含量， 并與索氏提取法進(jìn)行比較， 結(jié)果顯示超聲提取法和索氏提取法測定飼料粗脂肪含量差異不顯著 （P>0.05），表明本實驗研發(fā)的超聲提取法可用于飼料原料和常見動物性飼料產(chǎn)品的粗脂肪含量測定， 適用范圍廣。超聲提取法所用設(shè)備可用超聲波清洗器、廣口瓶、冷凝管（球形效果更好）自行組配，1 次可測30 余個樣品， 提取時間僅需1 h， 具有前處理簡便、準(zhǔn)確度高、速度快、成本低和溶劑損耗小等優(yōu)點，適用于大批量樣品的檢測。而脂肪測定儀采用的是索氏提取法，需要專門的儀器設(shè)備，該儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，造價高，1 次只能測定6 個樣品，提取時間至少需2 h［8-9］。

4 結(jié)論

本研究首次將超聲提取技術(shù)應(yīng)用于飼料原料和常見動物性飼料產(chǎn)品粗脂肪含量測定中， 采用正交試驗優(yōu)化飼料粗脂肪超聲提取工藝， 其最佳提取工藝條件為液料比37.5 mL/g， 浸泡0 min，超聲時間30 min，超聲提取2 次。 研究表明，超聲提取法與脂肪測定儀索氏提取法相比，1 次可多測5倍飼料樣品，提取時間縮短1 半，成本低，測定結(jié)果差異不顯著（P>0.05），適用于大批量樣品的檢測。