葛根素調控miR-30b-5p表達抑制類固醇誘導的兔股骨頭壞死

馬曼華 王珊 孟東方

1. 商丘醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學院康復教研室,河南 商丘 476005 2. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨科,河南 鄭州 450003

類固醇誘導的股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種慢性進行性股骨頭疾病,主要由長期過量糖皮質激素誘發(fā),可引起髖關節(jié)損傷和功能障礙,最終影響患者生活質量[1]。目前治療ONFH常用的藥物有雙膦酸鹽、他汀類藥物和抗凝血劑,這些藥物通過不同的藥理機制可以部分恢復骨細胞的功能,但其卻存在明顯的副作用如胃腸道刺激、腎毒性或下頜關節(jié)壞死等[2]。因此,開發(fā)一種效果顯著、不良反應少的抗ONFH藥物至關重要。葛根素是葛根中主要的異黃酮成分之一,具有抗骨質疏松、抗氧化等活性[3]。已有研究報道,葛根素通過促進壞死部位新骨生成,對激素性股骨頭壞死模型大鼠發(fā)揮治療作用,但具體機制尚不完全明確[4]。相關研究顯示,葛根素通過上調miR-34a促進類固醇誘導的股骨頭壞死兔的成骨作用;抑制miR-30b-5p表達可促進類固醇誘導的股骨頭壞死的軟骨細胞凋亡[5-6]。但葛根素能否通過調控miR-30b-5p表達改善類固醇誘導的ONFH尚不明確。因此,本研究主要探究葛根素對類固醇誘導的ONFH兔氧化應激及細胞凋亡的影響以及可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:84只3月齡體質量為2.25～2.5 kg的新西蘭大白兔購自廣東雙林生物制藥有限公司,生產許可證號SCXK(粵)2023-0003。

1.1.2主要試劑:葛根素購自上海同田生物技術有限公司;大腸桿菌內毒素購自上海烜雅生物科技有限公司;甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液購自國藥集團容生制藥有限公司;仙靈骨葆膠囊購自貴州同濟堂制藥有限公司;miR-30b-5p拮抗劑(antagomir)及其陰性對照antagomir NC 購自百奧邁科生物技術有限公司;兔超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)ELISA試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司;鼠源一抗Dickkopf-1(DKK-1)、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠二抗均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1ONFH兔模型的構建:ONFH模型的構建[7]:向兔耳緣靜脈注射兩次大腸桿菌內毒素(10 μg/kg),兩次間隔時間為24 h,末次注射內毒素后,立刻通過臀肌注射三次甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液(25 mg/kg),三次間隔時間為24 h。

1.2.2動物分組及處理:按照隨機數(shù)字表法將84只新西蘭大白兔分為對照組、ONFH組、葛根素低劑量組、葛根素高劑量組、陽性對照組、葛根素高劑量+antagomir NC組、葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組,每組12只。對照組以生理鹽水代替大腸桿菌內毒素、甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液,其余操作同造模過程;其余各組均需采用大腸桿菌內毒素聯(lián)合甲潑尼龍琥珀酸鈉的方式構建ONFH模型。若Micro-CT結果顯示,兔股骨骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高,且HE染色顯示兔骨小梁排列稀疏、無序、變薄、部分斷裂,骨小梁內的骨細胞數(shù)量減少,空骨陷窩數(shù)增多,則表明模型構建成功,然后進行給藥處理。葛根素低劑量組、葛根素高劑量組[5]、陽性對照組[7]分別予以灌胃0.125 g/kg葛根素、0.5 g/kg葛根素、0.4 g/kg仙靈骨葆膠囊,且均需尾靜脈注射等量的生理鹽水;葛根素高劑量+antagomir NC組灌胃0.5 g/kg葛根素且還需尾靜脈注射93.46 μg/只antagomir NC;葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組[8]灌胃0.5 g/kg葛根素且還需尾靜脈注射93.46 μg/只miR-30b-5p antagomir;對照組、ONFH組灌胃等量的生理鹽水且還需尾靜脈注射等體積的生理鹽水。給藥一天一次,持續(xù)12周。

1.2.3標本收集:末次處理24 h后,處死大白兔,收集大白兔的股骨頭,分為兩部分,一部分固定于4 %多聚甲醛中用于Micro-CT掃描、HE染色及TUNEL染色,另一部分凍存于-80 ℃冰箱中用于ELISA、qRT-PCR、Western Blot檢測。

1.2.4Micro-CT檢測:利用Micro-CT掃描固定于4 %多聚甲醛溶液中48 h的股骨頭,并分析骨計量學參數(shù)骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度。

1.2.5HE染色檢測兔股骨頭組織病理變化:取1.2.3中的股骨頭,在10 % EDTA中脫鈣,并包埋在石蠟中。然后將組織切成5 μm厚的切片。用HE對連續(xù)切片進行染色,使用光學顯微鏡記錄組織病理學變化,Image-Pro Plus 6.0軟件分析切片上的空骨陷窩數(shù)、總骨陷窩數(shù),并計算空骨陷窩率,空骨陷窩率(%)=(空骨陷窩數(shù)/骨陷窩數(shù)×100 %)。

1.2.6ELISA法檢測兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量:嚴格按照試劑盒說明書檢測兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量。

1.2.7TUNEL染色檢測兔股骨頭組織中細胞凋亡:取1.2.5中的股骨頭組織切片,根據TUNEL試劑盒說明書步驟檢測細胞凋亡,凋亡細胞呈綠色熒光,正常細胞的細胞核被染成藍色。細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100 %。

1.2.8qRT-PCR檢測股骨頭組織中miR-30b-5p表達:利用TRIzol試劑提取股骨頭組織勻漿總RNA。將RNA逆轉錄為cDNA后,以cDNA為模板進行熒光定量PCR反應。以U6為內參,通過2-ΔΔCt法計算miR-30b-5p相對表達量。引物序列:U6-F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,R:5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′;miR-30b-5p-F: 5′-CCGAAACATCCT ACACTCAGCTAA-3′,R:5′-CAGTGCGTGTCGTGG AGT-3′。

1.2.9Western Blot檢測股骨頭組織中DKK-1蛋白表達:利用RIPA裂解緩沖液提取股骨頭組織勻漿總蛋白,將50 μg總蛋白經電泳、轉膜、封閉后,在4 ℃下將膜與一抗DKK-1、GAPDH孵育過夜,再將膜與二抗共同孵育1.5 h。加入ECL試劑觀察蛋白印跡,利用Image J軟件評估目的蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 葛根素對各組兔股骨頭區(qū)骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度的影響

與對照組比較,ONFH組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度升高,骨小梁分離度降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高(P<0.05),見圖1和表1。

表1 各組兔股骨區(qū)骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度及骨小梁分離度變化比較Table 1 Comparison of changes in the number, thickness, and separation of bone trabeculae in the femoral region of rabbits in each group n=6)

圖1 Micro-CT掃描檢測兔股骨微結構Fig.1 Micro-CT scan to detect the microstructure of rabbit femur

2.2 葛根素對各組兔股骨頭組織病理變化的影響

對照組兔股骨頭組織無明顯異常,骨小梁整齊致密,排列規(guī)則,骨小梁內的骨細胞分布清晰均勻,骨陷窩豐富;ONFH組兔骨小梁排列稀疏、無序、變薄、部分斷裂,骨小梁內的骨細胞數(shù)量減少,空骨陷窩數(shù)增多;與對照組比較,ONFH組空骨陷窩率升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組空骨陷窩率降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組空骨陷窩率升高(P<0.05),見圖2和表2。

表2 各組兔空骨陷窩率變化比較Table 2 Comparison of changes in empty bone lacuna rate among different groups of rabbits n=6)

圖2 HE染色檢測兔股骨頭組織病理變化(200×)Fig.2 HE staining detection of pathological changes in rabbit femoral head tissue (200×)

2.3 葛根素對各組兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量的影響

與對照組比較,ONFH組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組SOD活性升高,MDA含量降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組SOD活性降低,MDA含量升高(P<0.05),見表3。

表3 各組兔股骨頭組織中SOD活性及MDA含量變化比較Table 3 Comparison of changes in SOD activity and MDA content in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

2.4 葛根素對各組兔股骨頭組織中細胞凋亡的影響

與對照組比較,ONFH組兔股骨頭組織中細胞凋亡率升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組兔股骨頭組織中細胞凋亡率降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組兔股骨頭組織中細胞凋亡率升高(P<0.05),見圖3和表4。

表4 各組兔股骨頭組織中細胞凋亡率變化比較Table 4 Comparison of changes in cell apoptosis rate in femoral head tissue of rabbits in each group n=6)

圖3 TUNEL染色檢測兔股骨頭組織中骨細胞凋亡(400×)Fig.3 TUNEL staining for detecting osteocyte apoptosis in rabbit femoral head tissue (400×)

2.5 葛根素對各組兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達及DKK-1蛋白表達的影響

與對照組比較,ONFH組miR-30b-5p表達降低,DKK-1蛋白表達升高(P<0.05);與ONFH組比較,葛根素低、高劑量組、陽性對照組miR-30b-5p表達升高,DKK-1蛋白表達降低(P<0.05);與葛根素高劑量組、葛根素高劑量+antagomir NC組比較,葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組miR-30b-5p表達降低,DKK-1蛋白表達升高(P<0.05),見圖4和表5。

表5 各組兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達及DKK-1蛋白表達變化比較Table 5 Comparison of changes in miR-30b-5p expression and DKK-1 protein expression in femoral head tissues of rabbits in each group n=6)

圖4 Western Blot檢測兔股骨頭組織中DKK-1蛋白Fig.4 Western Blot detection of DKK-1 protein in rabbit femoral head tissue注:A:對照組;B:ONFH組;C:葛根素低劑量組;D:葛根素高劑量組;E:陽性對照組;F:葛根素高劑量+antagomir NC組;G:葛根素高劑量+miR-30b-5p antagomir組。

3 討論

ONFH是一種常見且迅速致殘的疾病,大多數(shù)患者會在2～3年內出現(xiàn)股骨頭塌陷,最終出現(xiàn)髖關節(jié)功能障礙,給患者家庭和整個社會帶來不可估量的勞動和經濟損失[9]。Micro-CT是可通過全面、立體的方式測量骨微結構、評價骨質量及預測骨強度的新型技術[7]。本研究利用該技術檢測了ONFH兔模型的骨計量學參數(shù),結果顯示,與對照組比較,ONFH組骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度降低,骨小梁分離度升高,表明ONFH兔模型的骨計量學參數(shù)異常。據報道,氧化應激與類固醇誘導的ONFH過程密切相關,在激素誘導的ONFH兔股骨頭組織中SOD活性降低,MDA含量升高[10]。此外,骨細胞凋亡與ONFH的發(fā)生和進展密切相關,當ONFH發(fā)生時,股骨頭的內部血液供應被切斷,導致骨細胞營養(yǎng)不足進而誘導細胞凋亡,骨小梁組織也被慢慢拉松,最終引起股骨頭塌陷[11]。本研究顯示,與對照組比較,ONFH組兔股骨頭組織中SOD活性降低,MDA含量、骨細胞凋亡率及凋亡相關蛋白DKK-1蛋白表達升高,股骨頭組織病理損傷嚴重,表明ONFH兔存在氧化應激及骨細胞凋亡的現(xiàn)象。因此,抑制氧化應激及骨細胞凋亡可能是治療ONFH的潛在有效策略之一。

葛根素是一種具有高健康價值的天然物質,具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、保護心腦血管和骨修復等一系列生物活性[12]。相關研究顯示,葛根素對于激素性ONFH大鼠的壞死股骨具有良好的修復作用[13];葛根素可減弱骨間充質干細胞凋亡進而改善糖皮質激素誘導的大鼠ONFH[14]。本研究亦顯示,葛根素可抑制ONFH兔股骨頭組織氧化應激及細胞凋亡,且葛根素劑量越高,抑制作用越明顯。本研究同先前的研究[13-14]一致,證實了葛根素對ONFH具有保護作用,但也對該結論進行了完善,即葛根素對ONFH的保護作用是通過抑制氧化應激及細胞凋亡實現(xiàn)的。另有研究顯示,仙靈骨葆膠囊作為臨床上常用于治療ONFH的藥物,本研究設置該藥物為陽性藥物,結果顯示,仙靈骨葆膠囊與高劑量葛根素對ONFH兔股骨頭組織氧化應激及細胞凋亡的抑制作用差異無統(tǒng)計學意義。提示葛根素可能成為治療ONFH的潛在有效藥物。

近年來,越來越多的研究表明葛根素通過調控miRNA的表達來影響各種疾病的進展。如葛根素通過下調miR-196a-3p促進大鼠成骨細胞增殖和分化,進而改善骨質疏松[15];葛根素通過抑制miRNA-140-5p表達來預防糖尿病腎損傷[16]。且有研究表明在ONFH動物模型中miR-30b-5p表達降低[6]。但葛根素能否通過調控miR-30b-5p表達影響ONFH兔股骨頭組織氧化應激及細胞凋亡的研究鮮有報道。此外,有研究顯示,miR-30b-5p可通過抑制氧化應激減輕大鼠子癇前期癥狀[17]。本研究顯示,葛根素可促進ONFH兔股骨頭組織中miR-30b-5p表達,且葛根素劑量越高,促進作用越明顯,推測葛根素可能通過上調miR-30b-5p表達來抑制ONFH兔氧化應激及細胞凋亡。為了驗證該推測,本研究在高劑量葛根素作用的基礎上再加上miR-30b-5p antagomir來干預ONFH兔,結果顯示,miR-30b-5p antagomir減弱了高劑量葛根素對ONFH兔氧化應激及細胞凋亡的抑制作用。證實了猜想的正確性。

綜上所述,葛根素可能通過上調miR-30b-5p表達來抑制ONFH兔氧化應激及細胞凋亡。葛根素抑制ONFH兔氧化應激及細胞凋亡的具體機制有待進一步深入探究。