抗豬腸道冠狀病毒生物活性化合物的研究

文│童秋廷（山東省博興縣湖濱鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）

在生豬養(yǎng)殖中，各種腸道疾病頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響了生豬生產(chǎn)性能，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬腸道冠狀病毒是引起豬腹瀉的常見病原體，傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒均屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬。傳染性胃腸炎病毒最早于1946年在美國被發(fā)現(xiàn)，盡管該病毒在養(yǎng)豬場的發(fā)病率不高，但新生仔豬感染后的死亡率幾乎達(dá)到100%。豬流行性腹瀉于1971年在英國首次被確診，其病原體豬流行性腹瀉病毒于1978年被確定為一種新型冠狀病毒，豬流行性腹瀉的患病率據(jù)報(bào)道為50.21%～62.1%，新生仔豬感染豬流行性腹瀉病毒后死亡率高達(dá)100%。豬德爾塔冠狀病毒又被稱為豬丁型冠狀病毒，屬于δ冠狀病毒屬，分子監(jiān)測中首次于2012年在豬直腸拭子中檢測到，2014年美國首次報(bào)告了豬德爾塔冠狀病毒引起的腹瀉。豬德爾塔冠狀病毒腹瀉的患病率低于豬流行性腹瀉，但高于傳染性胃腸炎病毒腹瀉，導(dǎo)致新生仔豬的死亡率低于兩者。豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）也被稱為豬腸道α冠狀病毒（Swine enteric alphacoronavirus，SeACoV）和豬腸道α病毒（Porcine enteric alphacoronavirus，PEAV），2017年在中國腹瀉仔豬中首次發(fā)現(xiàn)。迄今為止，在臨床樣本中檢測到豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的報(bào)道并不多，僅在廣東、福建、遼寧和甘肅省的腹瀉樣本中檢測到。豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒感染導(dǎo)致5日齡以下的仔豬高達(dá)90%的死亡率，8日齡以上仔豬的死亡率降低至5%。目前，缺乏用于預(yù)防和治療豬腸道冠狀病毒的藥物，因此有必要總結(jié)已發(fā)現(xiàn)的對這些冠狀病毒具有抑制作用的生物活性化合物及其抑制機(jī)制，為藥物研發(fā)提供依據(jù)。由于病毒的有效復(fù)制取決于宿主細(xì)胞，總結(jié)影響這些冠狀病毒復(fù)制的宿主因素有助于識(shí)別新的抗病毒靶點(diǎn)。

一、豬腸道冠狀病毒復(fù)制的重要宿主因素

抗病毒試劑的作用機(jī)制一般分為兩類，一類針對病毒本身，另一類針對參與病毒生命周期的重要宿主因素。

1.細(xì)胞凋亡。一些病毒逃避細(xì)胞凋亡以獲得足夠的時(shí)間產(chǎn)生子代病毒，而一些病毒主動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以促進(jìn)子代病毒的釋放和傳播。多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞凋亡有利于豬流行性腹瀉病毒、豬德爾塔冠狀病毒和豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的復(fù)制。豬流行性腹瀉病毒通過激活線粒體凋亡誘導(dǎo)因子觸發(fā)細(xì)胞凋亡。豬德爾塔冠狀病毒通過觸發(fā)線粒體細(xì)胞色素c向細(xì)胞質(zhì)中的釋放而引起細(xì)胞凋亡。豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒同時(shí)誘導(dǎo)外源性細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。傳染性胃腸炎病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑包括胱天蛋白酶依賴性的外源性途徑、內(nèi)源性途徑以及凋亡誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的胱天蛋白酶非依賴性途徑，但阻斷胱天蛋白酶對傳染性胃腸炎病毒的復(fù)制沒有明顯的影響。

2.自噬。真核細(xì)胞自噬對不同的病毒表現(xiàn)出不同的作用。有研究認(rèn)為，自噬對傳染性胃腸炎病毒的復(fù)制具有負(fù)調(diào)控作用，但另一項(xiàng)研究指出，自噬可促進(jìn)傳染性胃腸炎病毒的感染和復(fù)制。豬流行性腹瀉病毒誘導(dǎo)的自噬有利于病毒復(fù)制，PEDV ORF3蛋白是一種依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的自噬誘導(dǎo)劑，PEDV ORF3蛋白能刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)抑制劑4-苯基丁酸的敲除促進(jìn)了豬流行性腹瀉病毒的復(fù)制。豬德爾塔冠狀病毒、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒與自噬之間的相互作用仍有待研究。

3 . 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路。MAPK信號通路是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由多種病毒操縱。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、Janus激酶（JNK）和p38 MAPK是3種主要的MAPK途徑，已被證明主要在豬流行性腹瀉病毒和豬德爾塔冠狀病毒進(jìn)入后發(fā)揮作用，如參與病毒生物合成和子代釋放。有研究表明，p38抑制劑或p38的敲除抑制了傳染性胃腸炎病毒的繁殖，表明p38對傳染性胃腸炎病毒的復(fù)制是必要的。而豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的有效傳播需要ERK的激活。

4.膽固醇。膽固醇影響病毒生命周期的多個(gè)階段，尤其是進(jìn)入過程。病毒膽固醇和細(xì)胞膽固醇都參與傳染性胃腸炎病毒和豬德爾塔冠狀病毒的復(fù)制，而豬流行性腹瀉病毒需要細(xì)胞膽固醇才能有效復(fù)制。病毒膽固醇的耗竭并不影響傳染性胃腸炎病毒與其受體氨基肽酶N的結(jié)合，而是影響吸附后的步驟。豬流行性腹瀉病毒的附著和內(nèi)化需要細(xì)胞膽固醇，細(xì)胞膽固醇和病毒膽固醇對豬德爾塔冠狀病毒的附著和內(nèi)化都至關(guān)重要。

5.其他宿主因素。表皮生長因子受體屬于受體酪氨酸激酶家族，在許多細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在傳染性胃腸炎病毒的附著和進(jìn)入發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，表皮生長因子受體的激活也有助于豬流行性腹瀉病毒的復(fù)制，但其在豬流行性腹瀉病毒生命周期中的作用仍有待研究。

功能性細(xì)胞受體，如受體氨基肽酶N是傳染性胃腸炎病毒的功能性細(xì)胞受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1據(jù)推測可能是豬流行性腹瀉病毒的功能性細(xì)胞受體。

跨膜蛋白41B支持傳染性胃腸炎病毒復(fù)制所必需的雙膜小泡的形成，并參與傳染性胃腸炎病毒內(nèi)化和早期復(fù)制?？缒さ鞍酌附z氨酸2和鑲嵌絲氨酸蛋白酶在豬流行性腹瀉病毒感染期間具有促進(jìn)PEDV S蛋白切割、促進(jìn)細(xì)胞-細(xì)胞融合和病毒-細(xì)胞融合的特性。鋅指DHHC型棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶17直接影響豬德爾塔冠狀病毒的復(fù)制。

二、抗豬腸道冠狀病毒的生物活性化合物

在目前報(bào)道的對豬腸道冠狀病毒具有抗病毒活性的生物活性化合物中，一些化合物對傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬德爾塔冠狀病毒中的兩種或三種表現(xiàn)出抑制作用，如從中藥隱孔菌（Cryptoporus volvatus，一種木生真菌）中提取的過氧化麥角甾醇、25-羥基膽固醇和褪黑素。關(guān)于抑制豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的生物活性化合物的報(bào)道相對有限。對其他冠狀病毒具有高度抑制作用的藥物是有價(jià)值的參考，應(yīng)該更多地關(guān)注對多種冠狀病毒有效的藥物。

姜黃素是姜黃的主要多酚類化合物，對傳染性胃腸炎病毒的早期感染有抑制作用，尤其是對病毒吸附有抑制作用，對傳染性胃腸炎病毒也有直接的殺毒作用。金絲桃素是從圣約翰草（Hypericum perforatum L.）中提取的一種具有生物活性的二胺基化合物，可以抑制傳染性胃腸炎病毒的復(fù)制。兒茶素源自綠茶，具有抗傳染性胃腸炎病毒的特性，這與其抗氧化有關(guān)。何首烏多糖可抑制傳染性胃腸炎病毒的復(fù)制，減輕活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。Tyrphostin A9是tyrphotin類受體酪氨酸激酶抑制劑，可以通過減輕p38的激活來發(fā)揮抗傳染性胃腸炎病毒作用，主要作用于吸附后階段。褪黑素和結(jié)構(gòu)類似物（包括吲哚、色胺和l-色氨酸）能夠干擾傳染性胃腸炎病毒的進(jìn)入。番茄堿和25-羥基膽固醇也能抑制傳染性胃腸炎病毒的復(fù)制，但作用機(jī)制尚不清楚，它們對豬流行性腹瀉病毒也具有抗病毒活性，它們對這兩種病毒的抑制機(jī)制可能相似。

番茄堿是一種從番茄表皮和葉片中提取的甾體生物堿，對豬流行性腹瀉病毒復(fù)制有良好的抑制作用。槲皮素是一種類黃酮分子，靶向影響豬流行性腹瀉病毒感染的初始階段。甘草酸是甘草根提取物的主要成分，主要干預(yù)豬流行性腹瀉病毒的進(jìn)入和復(fù)制。蘆薈提取物在豬流行性腹瀉病毒生命周期后期具有抑制作用，也可以在不影響病毒基因組和PEDV S1蛋白的情況下直接滅活病毒粒子。兒茶素-沒食子酸酯是綠茶中的主要多酚，在豬流行性腹瀉病毒生命周期的多個(gè)階段發(fā)揮作用，包括附著、進(jìn)入、復(fù)制和組裝。銀杏葉外果皮多糖可通過抑制病毒的附著和進(jìn)入，有效緩解豬流行性腹瀉病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變。過氧化麥角甾醇限制豬流行性腹瀉病毒的內(nèi)化、復(fù)制和釋放，還具有滅活豬流行性腹瀉病毒粒子和減輕豬流行性腹瀉病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力。金絲桃素、苦楝原花青素、苦楝皮、黃連、黃柏皮和苦參提取物、tyrphostin A9和褪黑素均對豬流行性腹瀉病毒有抑制作用。

過氧化麥角甾醇阻斷豬德爾塔冠狀病毒附著和進(jìn)入，并在病毒進(jìn)入后的早期和中期起作用。此外，它還能直接滅活豬德爾塔冠狀病毒的傳染性，緩解細(xì)胞凋亡，其抗病毒活性與其減輕豬德爾塔冠狀病毒誘導(dǎo)的p38激活有關(guān)。膽汁酸如鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid）和石膽酸擾亂了豬德爾塔冠狀病毒的進(jìn)入后階段，但鵝去氧膽酸已被證明可以促進(jìn)豬流行性腹瀉病毒的復(fù)制。25-羥基膽固醇作用于豬德爾塔冠狀病毒的進(jìn)入。25-羥基膽固醇對傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒也有抑制作用，25-羥基膽固醇具有開發(fā)成為廣譜抗冠狀病毒藥物的潛力。