基于吲哚的溶酶體熒光探針的合成及應(yīng)用

陳 濤,梁梓健,桑亞男,王自瑤,柴方園,晏 可,張 璐,高 濤,3*

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院非動(dòng)力核技術(shù)化學(xué)與生物學(xué)院;3.湖北科技學(xué)院輻射化學(xué)與功能材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

細(xì)胞內(nèi)的pH對(duì)細(xì)胞正常生命活動(dòng)至關(guān)重要,如信號(hào)傳遞[1]、離子轉(zhuǎn)運(yùn)[2]、細(xì)胞凋亡[3]等。許多疾病的發(fā)生發(fā)展都與細(xì)胞內(nèi)pH的異常相關(guān)[4-5],因此,快速靈敏地監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值對(duì)闡明這些疾病的機(jī)制以及開發(fā)相應(yīng)的治療診斷工具具有重要意義。

傳統(tǒng)的pH計(jì)僅適用于宏觀流體,不能用于細(xì)胞以及亞細(xì)胞器的微環(huán)境pH監(jiān)測(cè)。相比之下,由于熒光探針具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、響應(yīng)快、無(wú)創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn),使得其可以滿足細(xì)胞中的監(jiān)測(cè)要求[6-8]。pH探針的質(zhì)子與探針的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅或者增強(qiáng),其中熒光增強(qiáng)型探針比熒光猝滅型熒光探針更為準(zhǔn)確,因?yàn)闊晒忖缈赡苁怯蓪?shí)際樣品中其他的物質(zhì)干擾引起的[9],開發(fā)具有熒光信號(hào)增強(qiáng)型的熒光探針是一種有效的策略。

F16[(E)-4-(1H-吲哚-3-基乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物]是一種離域型親脂性陽(yáng)離子(DLC),常用于抗腫瘤藥物的研究,這類分子可以在多種癌細(xì)胞中表現(xiàn)出細(xì)胞線粒體特異性積累,進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死[10]。而化合物(E)-3-(2-吡啶-4-乙烯基)-1H-吲哚(PVI)作為F16的前體結(jié)構(gòu),很少有人對(duì)其性能進(jìn)行研究。但PVI分子仍保留有F16的大部分效應(yīng)官能團(tuán),即具有較大的氮原子參與的共軛體系。這不僅使其具有較低能量激發(fā)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而且可能對(duì)測(cè)定介質(zhì)所帶來(lái)的pH變化發(fā)生相應(yīng)響應(yīng)。本文研究了PVI的光學(xué)性質(zhì)、熒光響應(yīng)機(jī)制以及其細(xì)胞成像方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

蘆竹堿[1-(1H-indol-3-yl)-N,N-Dimethylmethanamine]購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;4-吡啶甲醛(4-Pyridinecarboxaldehyde)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;正丁基膦(Tributylphosphane)購(gòu)于上海安耐吉化學(xué)有限公司;石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯、乙腈、二甲亞砜等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。溶酶體紅色熒光探針(Lyso-Tracker Red)購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)有限公司,PC-3細(xì)胞來(lái)自湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。

Bruker ASCEND 400MHz核磁;日立U3010紫外分光光度計(jì);日立F4500熒光分光光度計(jì);ELx800酶標(biāo)儀;DYS2000倒置熒光顯微鏡;OLYMPUS FV3000激光共聚焦熒光顯微鏡。本實(shí)驗(yàn)所用的B-R(Britton-Robinson)緩沖液(含40nm乙酸、硼酸和磷酸)使用稀鹽酸或氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié)pH值。

1.2 方法

1.2.1 探針PVI的合成

PVI的合成路線如圖1所示。合成的化合物由蘆竹堿348mg(2.00mmol/L)溶于15.0mL干燥乙腈中,常溫下,加入4-吡啶甲醛0.400mL(4.00mmol/L)與正三丁基膦1.00mL(4.00mmol/L),80℃加熱回流反應(yīng)24h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程,待反應(yīng)結(jié)束后旋干有機(jī)溶劑,得黑褐色油狀物質(zhì)。采用硅膠柱以石油醚∶乙酸乙酯=1∶1(v/v)分離純化,得淡黃色粉末(PVI)。

圖1 PVI的合成路線

1.2.2 光物理性質(zhì)

在DMSO中制備探針PVI的儲(chǔ)備溶液(10.0mmol/L),稀釋至所需濃度。在日立U3010紫外分光光度計(jì)收集PVI在不同pH下的吸收光譜。熒光發(fā)射光譜由日立F-4500熒光光譜儀獲得。將探針的儲(chǔ)備溶液用B-R緩沖液稀釋至不同的pH值進(jìn)行測(cè)試(探針的最終濃度均為10.0μmol/L)。

1.2.3 DFT計(jì)算

使用高斯09軟件包,采用密度泛函理論(DFT),使用B3LYP函數(shù)進(jìn)行計(jì)算。在6-311G基組下,計(jì)算了PVI質(zhì)子化前后的最優(yōu)構(gòu)象及其前線分子軌道(HOMO和LUMO)。

1.2.4 細(xì)胞成像

將PC-3細(xì)胞與10.0μmol/L的PVI培養(yǎng)基在5%CO2,37°C的條件下孵育30min。用PBS洗滌3次后,DYS2000倒置熒光顯微鏡捕獲圖像。

1.2.5 共定位實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)好的PC-3細(xì)胞與PVI一起孵育(1.00μmol/L,60min),然后與溶酶體探針(LTDR,1.00μmol/L,20min)進(jìn)一步孵育。用PBS洗滌3次后,OLYMPUS FV3000激光共聚焦熒光顯微鏡拍攝圖像。綠色通道在λem=488nm處收集,紅色通道在λem=561nm處收集。

2 結(jié) 果

2.1 PVI的合成

目標(biāo)產(chǎn)物經(jīng)蘆竹堿與4-吡啶甲醛在正三丁基膦的催化下制備,產(chǎn)率為51%(淡黃色固體)。通過核磁共振波譜儀對(duì)所合成的化合物進(jìn)行表征,確定了目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.50(s,1H),8.47(d,J=4.6Hz,2H),8.05(d,J=7.7Hz,1H),7.73(d,J=15.5Hz,2H),7.52(d,J=4.5Hz,2H),7.46(d,J=7.9Hz,1H),7.18(dd,J=9.6,7.7Hz,2H),7.07(d,J=16.6Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ 149.71,145.84,137.12,127.87,127.28,125.03,122.02,120.22,120.04,119.91,119.86,113.18,112.03。

2.2 光物理性質(zhì)

我們研究了不同pH值下PVI在B-R緩沖溶液中的吸收和發(fā)射光譜(圖2)。如圖2a所示,弱酸條件下(pH=7.00～4.00),PVI的最大吸收峰位于414nm處,其強(qiáng)度在酸性條件下隨著pH值的減小而逐漸升高。在pH大于4時(shí),熒光強(qiáng)度的增幅開始減緩。同時(shí)溶液顏色逐漸由無(wú)色變?yōu)辄S色?；衔镂舛鹊淖兓怯捎谫|(zhì)子化后的PVI分子整體Π成鍵軌道與Π反鍵軌道能級(jí)縮小,躍遷概率增大所致。與此同時(shí),在該吸收光波長(zhǎng)上激發(fā)出的最大熒光發(fā)射峰位于527nm處,且熒光強(qiáng)度隨著pH的減小而逐漸升高。這可能是因?yàn)橘|(zhì)子化后的PVI分子的ICT效應(yīng)受到阻礙,導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。通過紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜,我們可以明確,所合成的化合物PVI對(duì)溶液pH值具有較好響應(yīng)能力,特別是酸性條件下化合物的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。因?yàn)槿苊阁w是一種具有酸性微環(huán)境的細(xì)胞器,所以探針PVI具有潛在的溶酶體內(nèi)發(fā)光和成像的能力。

圖2 PVI(10.0μmol/L)在365nm下不同pH的BR溶液中的發(fā)射(a)和在日光燈下吸收光譜(b)

2.3 探究熒光響應(yīng)對(duì)pH影響的潛在機(jī)制

為了探究熒光響應(yīng)對(duì)pH的潛在機(jī)制,對(duì)PVI質(zhì)子化前后的分子構(gòu)型和HOMO/LUMO能級(jí)分布進(jìn)行了密度泛函(DFT)分析。如圖3所示,PVI是一個(gè)大共軛平面。其中吲哚環(huán)上的氮原子孤對(duì)電子也參與共軛體系的構(gòu)建,而吡啶環(huán)則不然。吲哚環(huán)上的氮原子比吡啶環(huán)上的氮更容易被質(zhì)子化,所以吲哚環(huán)上的氮原子先被質(zhì)子化(圖4)。隨后,研究了相應(yīng)結(jié)構(gòu)的HOMO/LUMO能級(jí)分布(圖4)。質(zhì)子化后PVI的HOMO和LUMO在分子中分布較多,導(dǎo)致ICT效應(yīng)被抑制使熒光增強(qiáng)(圖5)。PVI質(zhì)子化后的HOMO和LUMO軌道之間的能量間隙(Eg)逐漸減小,這與它們的熒光發(fā)射峰紅移的結(jié)果一致。上述研究確定了PVI在酸性條件的發(fā)光機(jī)制,該結(jié)果對(duì)PVI的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

圖3 PVI優(yōu)化后的構(gòu)型

圖4 PVI質(zhì)子化前后的HOMO/ LUMO以及能量間隙(Eg)

圖5 PVI熒光響應(yīng)機(jī)理

2.4 活細(xì)胞中的熒光成像

MTT測(cè)定用于檢查探針的細(xì)胞毒性。以10.0μmol/L的PVI與PC-3細(xì)胞共同孵育48小時(shí)的細(xì)胞仍然顯示出相當(dāng)高的活力。良好的生物相容性促使我們進(jìn)一步研究它們?cè)诨罴?xì)胞中的熒光成像。將濃度為1.00μmol/L的PVI與PC-3細(xì)胞共同孵育30min。如圖6所示,通過MTT和細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn),我們可以確定的是,化合物的細(xì)胞毒性低,能夠在細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮作用而不損傷細(xì)胞,滿足細(xì)胞及生物體中應(yīng)用的前置條件。從細(xì)胞的成像效果我們可以發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形貌依然清晰完整,且呈現(xiàn)明亮的綠色熒光,說(shuō)明PVI具有較好的生物相容性和細(xì)胞成像能力。

圖6 用10.0μmol/L的PVI與PC-3細(xì)胞共同孵育30min后熒光顯微鏡圖像(a、b、c為熒光圖,a1、b1、c1為明場(chǎng))

2.5 溶酶體共定位

溶酶體是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器,是細(xì)胞的“化工廠”,具有控制細(xì)胞凋亡的能力。因溶酶體具備獨(dú)特的消化功能,使得其內(nèi)部始終保持酸性的微環(huán)境,具有較強(qiáng)的嗜堿能力,能吸收和吸附堿性小分子。PVI分子具有吡啶和吲哚結(jié)構(gòu),因此,分子自身具有較強(qiáng)的堿性,具有被溶酶體識(shí)別和吸附的能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PVI在細(xì)胞中的空間分布情況,我們通過激光共聚焦顯微鏡結(jié)合溶酶體商品染料(LTDR),研究了PVI的溶酶體定位能力。選用PC-3細(xì)胞作為研究對(duì)象,先用PVI孵育然后用LTDR進(jìn)行處理。再通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行實(shí)時(shí)成像。如圖7所示,PVI發(fā)綠色熒光,LTDP呈現(xiàn)紅色熒光,共定位分析表明,皮爾遜相關(guān)系數(shù)Pr=0.909,表明PVI和LTDP發(fā)光區(qū)域重疊性非常好。PVI可以在PC-3細(xì)胞中成像,能夠在溶酶體中積累,且發(fā)出明亮的綠色熒光。說(shuō)明PVI是一種較好的溶酶體熒光探針,具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

a.PC-3細(xì)胞用1.00μmol/L的PVI染色1h;b.PC-3細(xì)胞用1.00μmol/L LTDR染色20min;c.PC-3的明場(chǎng);d.是a,b,c的重疊圖;e.PVI和LTDR的皮爾遜相關(guān)系數(shù);f.PC-3細(xì)胞ROI的熒光強(qiáng)度圖,綠線代表PVI的強(qiáng)度,紅線代表LTDR的強(qiáng)度。圖7 PC-3細(xì)胞的熒光共定位實(shí)驗(yàn)

3 討 論

我們通過吲哚和吡啶成功構(gòu)建了一種小分子化合物PVI,其具有較好光物理性質(zhì),且熒光強(qiáng)度對(duì)pH有很強(qiáng)的依賴性,在酸性環(huán)境中能夠發(fā)出明亮的綠色熒光。探針PVI的DFT計(jì)算結(jié)果表明,質(zhì)子化后的PVI通過抑制ICT效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了pH熒光增強(qiáng),是PVI在酸性條件發(fā)光的主要作用機(jī)制。PVI的MTT和細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所合成的探針生物相容性好,細(xì)胞毒性低,能夠在細(xì)胞中發(fā)出明亮的綠色熒光。進(jìn)一步的共聚焦成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探針具有較好的溶酶體定位能力,能有效的在溶酶體中聚集并發(fā)出綠色熒光。

綜上,我們合成得到了一種pH響應(yīng)的熒光探針PVI,具有細(xì)胞毒性低、生物相容性好、熒光強(qiáng)度大的優(yōu)點(diǎn),能用于溶酶體定位和成像,是一種具有商業(yè)應(yīng)用價(jià)值的溶酶體熒光探針。