Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合多指標(biāo)綜合評分法對青錢柳提取工藝的優(yōu)化研究*

張丹丹,李利華,楊玉瑩,葉曉川**

(1.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室,湖北 咸寧 437100;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與中藥化學(xué)省級重點實驗室;3.湖北省中醫(yī)院)

近年來,糖尿病的發(fā)病率逐年上升,WHO預(yù)測到2030年世界糖尿病發(fā)病率約為3.66億人[1-2]。糖尿病并發(fā)癥較多,嚴(yán)重危害人類健康,臨床上抗糖尿病藥物的長期使用會引起耐藥性及副作用,因此,從中藥或者天然藥物中尋找療效確切、副作用小的藥物有很大的前景。

青錢柳Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinsk.是國家重點保護的瀕危植物之一[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[4],其具有降血糖、降血壓等作用,近年來,民間及企業(yè)對青錢柳的需求量不斷攀升,種植青錢柳成為貴州、廣西等地脫貧攻堅的重點項目,青錢柳的總黃酮、總?cè)萍翱偠嗵菫槠浒l(fā)揮藥理作用的有效物質(zhì)部分[4-8],但對該三類成分同時提取的工藝研究尚未見報道。本研究通過多指標(biāo)綜合評分法結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化青錢柳提取工藝,以期為青錢柳的新產(chǎn)品開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器

蘆丁(批號:100080-201408,中國食品藥品檢定研究院,純度>98%);齊墩果酸(批號:R0160203,成都普思生物科技有限公司,純度>98%);D-無水葡萄糖(批號:S08J6G1,上海源葉生物科技有限公司,純度>98%)。

青錢柳藥材為實驗室自行采摘,產(chǎn)地為江西省修水縣黃坳鄉(xiāng)九龍山脈,經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)葉曉川教授鑒定為胡桃科植物青錢柳的干燥葉。藥材粉碎(過2號篩),備用。

純水儀(Milli-Q型,德國默克密理博公司);紫外可見光分光光度計(UV-1800,島津企業(yè)管理有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 層次分析權(quán)數(shù)法確定各評價指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)

以指標(biāo)性成分總?cè)?、總黃酮、總多糖三者提取率的總量對青錢柳的提取工藝進行評價。根據(jù)課題組前期的譜效關(guān)系研究得到總多糖、總黃酮、總?cè)婆c降血糖總藥效的關(guān)聯(lián)系數(shù)分別為0.75、0.80、0.68,由其關(guān)聯(lián)系數(shù)來確定層次分析矩陣,見表1。計算出總?cè)啤⒖傸S酮、總多糖權(quán)重系數(shù)分別為:0.16、0.54、0.30。隨機一致性比率CR=0.00458<0.1,故所得權(quán)重系數(shù)有效。

表1 層次分析矩陣

1.2.2 單因素實驗

單因素考察的條件如表2,基于該結(jié)果,來確定響應(yīng)面法選取的因素及水平范圍為響應(yīng)面法實驗做準(zhǔn)備,并根據(jù)權(quán)重系數(shù)來計算單因素實驗的綜合評分。

表2 單因素實驗結(jié)果

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù):取青錢柳粉末9份,每份1g,精密稱定,分別用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為提取溶媒,料液比1∶10,90℃下,提取2次,1h/次,濾過合并濾液,用相應(yīng)的溶媒定容至100mL。

(2)料液比:取青錢柳粉末5份,每份1g,精密稱定,以不同的料液比加入30%的乙醇,90℃下,提取2次,1h/次,濾過,合并濾液,并用相應(yīng)的溶媒定容至100mL。

(3)提取次數(shù):取青錢柳粉末3份,分別在料液比1∶10、90℃條件下用30%的乙醇提取不同次數(shù),1h/次,過濾,合并濾液,并用相應(yīng)的溶媒定容至100mL。

(4)提取時間:取青錢柳粉末5份,在料液比1∶10、90℃下用30%的乙醇提取,在5個不同浸提時間下,每個時間條件各浸提2次,濾過,合并濾液,并用相應(yīng)的溶媒定容至100mL。

(5)提取溫度:取青錢柳粉末5份,料液比1∶10,30%乙醇提取,2次,1h/次,在5個不同提取溫度下提取,濾過,合并濾液,并用相應(yīng)的溶媒定容至100mL。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選青錢柳提取工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,采用Design Expert 7.0軟件設(shè)計實驗,因素及水平表見表3,提取次數(shù)固定為3次。

表3 Box-Behnken設(shè)計的因素及水平

1.2.4 多糖的含量測定

取D-無水葡萄糖對照品2.35mg,精密稱定,加蒸餾水定容到10mL,搖勻。精密量取對照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL,置試管中,分別加水至2mL,加5%的苯酚溶液1mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5mL,搖勻,置40℃水浴保溫20min,冷卻至室溫。以水為空白,照紫外-可見分光光度法(中國藥典2015版通則0401),在490nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程:Y=0.0411X+0.1631,R2=0.9926,表明D-無水葡萄糖對照品在2.94～23.50μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密量取10mL樣品,在水浴上揮干至無醇味,上D101大孔吸附樹脂,用蒸餾水沖洗,得沖洗液,濃縮到一定體積,轉(zhuǎn)移至50mL的量瓶中,加水至刻度,搖勻。精密量取2mL,照上述方法,測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算出供試品溶液中含D-無水葡萄糖的重量(μg)。

1.2.5 總黃酮的含量測定

取蘆丁對照品2.80mg,精密稱定,用甲醇定容到25mL,搖勻。精密量取對照品溶液0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL,分別置于10mL試管中,揮干溶劑,加1%三氯化鋁甲醇溶液1mL,搖勻,甲醇定容至10mL,搖勻,放置15min,以相應(yīng)試劑為空白,照紫外-可見分光光度法[5],在409.5nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程:Y=0.031X-0.074,R2=0.9986,表明蘆丁對照品在8.96～44.80μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密量取供試品溶液0.2mL,照上述方法,測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算供試品溶液中蘆丁的重量(μg)。

1.2.6 總?cè)频暮繙y定

取齊墩果酸對照品3.28mg,精密稱定,加5mL甲醇,搖勻。精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,置于10mL試管中,揮干溶劑,放冷,精密加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL、高氯酸1.4mL,搖勻,70℃水浴加熱15min,取出冷卻至室溫,乙酸乙酯定容至10mL,以相應(yīng)試劑為空白,照紫外-可見分光光度法,在551.5nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:Y=0.0132X+0.0367,R2=0.9965,表明齊墩果酸對照品在13.12～65.60μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密量取供試品溶液0.2mL,照上述方法,測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算供試品溶液中齊墩果酸的重量(μg)。

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗結(jié)果

以100g青錢柳中總多糖、總黃酮、總?cè)频奶崛×繛榭疾熘笜?biāo),進行單因素考察,結(jié)果見表2。在提取次數(shù)因素考察中,綜合評分由次數(shù)的增加而增高,故固定次數(shù)為3次。試驗因素水平見表3。

2.2 響應(yīng)面法

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以總多糖、總黃酮、總?cè)铺崛×康木C合評分為評價指標(biāo),進行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計表及結(jié)果

分析表4中27個試驗點的響應(yīng)值,采用統(tǒng)計軟件Design Expert 7.0進行多元回歸分析,所得回歸方程:Y=77.77+5.14X1+14.13X2+0.15X3+3.45X4+0.54X1X2-3.53X1X3-3.04X1X4+1.69X2X3-8.79X2X4+3.61X3X4-11.13X12-5.54X22-4.63X32-2.80X42,回歸方程模型“P>F”小于0.05,說明未知因素對實驗結(jié)果干擾小,擬合模型檢驗較顯著(P<0.05)。由表5可知,4個因素對綜合評分的影響順序為X2>X1>X4>X3。

表5 響應(yīng)面法方差分析結(jié)果

2.2.2 驗證實驗

根據(jù)回歸模型,由統(tǒng)計軟件對實驗參數(shù)進一步優(yōu)化最佳的提取工藝參數(shù):乙醇體積分?jǐn)?shù)43.46%,料液比1∶30,提取時間98.44min,溫度60℃,在此最佳條件下的綜合評分為91.18。根據(jù)實際情況確定最佳工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)45%,料液比1∶30,提取時間100min,溫度60℃,提取次數(shù)3次,在此條件下進行3次驗證實驗,得到的綜合評分別為91.49、89.13、90.96,平均值90.53,與預(yù)測值比較,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.71%,說明該工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠,具有一定的實際指導(dǎo)意義,結(jié)果見表6。

表6 驗證實驗結(jié)果

3 討 論

響應(yīng)面分析法作為一種優(yōu)化方法,建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好,采用綜合評分篩選出相關(guān)性顯著的因素,在最大程度上減小實驗誤差,被廣泛應(yīng)用于工藝參數(shù)的優(yōu)化[9-10]。響應(yīng)面法是在單因素實驗的基礎(chǔ)上得到合適的點,并從這些點中獲得一個完整連續(xù)的面,進而篩選到最優(yōu)值;因此,在響應(yīng)面設(shè)計中,單因素實驗中變量參數(shù)的選擇非常重要。

根據(jù)總評分對單因素參數(shù)范圍進行確定,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從60%升高到80%時,總評分變化不大,所以范圍定在0%～60%;總評分隨著料液比的增加而增高,所以范圍定在10～30;總評分在60min時出現(xiàn)一次峰值,但又隨著提取時間的增加而增高,所以提取時間定為60～180min;提取次數(shù)越高,總評分越高,在3次時,總評分最高,故定為提取3次;總評分在90℃時出現(xiàn)第一次峰值,在100℃時下降,為確定其在90℃～100℃中的變化情況,把提取溫度定為60℃～100℃。得到最佳提取工藝:45%乙醇體積分?jǐn)?shù),料液比1∶30,100min,60℃,驗證實驗證明了工藝的可行性。綜上所述,Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合多指標(biāo)綜合評分法可用于青錢柳的提取工藝優(yōu)化,且所得最優(yōu)提取工藝穩(wěn)定、可行。

近年來,研究者分別采用響應(yīng)面法對青錢柳的總多糖和黃酮進行了提取工藝的篩選[11-13],僅針對一種成分進行提取,而青錢柳發(fā)揮藥效作用是總多糖、總黃酮及總?cè)瞥煞值墓餐饔?因此,本研究首次從多指標(biāo)入手,計算綜合評分來優(yōu)化青錢柳的提取工藝,該實驗結(jié)果為青錢柳的綜合利用、產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。