HPLC法考察不同影響因素下雪諾同黃體酮陰道緩釋凝膠的體外藥物釋放度

宋 歌,梅興國,陳振雄

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所;3.咸寧市第一人民醫(yī)院)

黃體酮,又名孕酮激素、黃體激素,是卵巢分泌的具有生物活性的主要孕激素,分子式為C21H30O2,對子宮內(nèi)膜有顯著形態(tài)學(xué)影響,是維持妊娠的關(guān)鍵物質(zhì),它能夠保護(hù)女性的子宮內(nèi)膜,給胎兒早期的生長和發(fā)育提供支持和保障[1-2]。近年來,出現(xiàn)了很多關(guān)于黃體酮給藥的各種劑型的相關(guān)研究,我國的黃體酮劑型以膠囊劑、油劑和凝膠劑為主。目前已上市的凝膠劑型只有英國Serono Pharmaceuticals Limited生產(chǎn)的一種孕激素類藥制劑Crinone?(中文名:雪諾同),據(jù)國外文獻(xiàn)描述,雪諾同和口服劑型、注射劑型的黃體酮在黃體支持期相比,藥效幾乎等同,超過半成的受訪者表示凝膠劑型耐受性良好,安全性更高[3-4]。

孕酮陰道凝膠是一種生物膠,含有細(xì)粉(微粉化)形式的孕酮以促進(jìn)人體吸收。黃體酮陰道緩釋凝膠不同于普通的凝膠制劑,普通的凝膠制劑在陰道內(nèi)給藥只能滯留數(shù)小時,而緩釋凝膠則是一種乳白色的生物粘附性凝膠,具有釋藥緩慢、滯留時間久、刺激性小等優(yōu)點[5]。它含有高分子仿生粘蛋白聚合物聚卡波非和卡波姆974p,聚卡波菲(Polycarbophil)可存在于陰道中長達(dá)72h之久并維持陰道酸性環(huán)境,因此,該凝膠是一種能夠持續(xù)釋藥的系統(tǒng)[6]。

本研究所用供試品為Crinone?陰道緩釋凝膠(8%),它由油相和水相混合而成,其油相為甘油、液狀石蠟、氫化棕櫚油甘油酯和黃體酮,其水相為純化水、微量山梨酸、聚卡波非、卡波姆974p。聚卡波非和卡波姆974p主要作為載體賦形劑使其成為水包油型乳劑,黃體酮呈部分溶解、部分混懸狀[7-9]。

本文從濾膜孔徑、濾膜材質(zhì)和釋放介質(zhì)3個因素入手,考察雪諾同的藥物體外累計釋放度,篩選出最優(yōu)實驗方案,以期為此類半固體型制劑的體外釋放實驗提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與試藥

釋放度試驗儀(廠家:黃海藥檢;型號:RCZ-6B3;編號:PDA004)、電子天平(廠家:賽多利斯;型號:BP221S;編號:CAB003)、電子天平(廠家:瑞士梅特勒-托利多;型號:XSE105;編號:CAB002)、高效液相色譜儀(廠家:SHIMADZU;型號:LC-20A,編號:7-LC-20A-2)。

對照品:黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品(廠家:中國食品藥品檢定研究所;批號:100027-201209;ID:M9L7-WEGS;含量:99.7%);供試品:Crinone?黃體酮陰道緩釋凝膠(廠家:Serono Pharmaceuticals Limited;批號:C18107Y;規(guī)格:90mg,含量:8%);甲醇分析純(廠家:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,純度:99.5%);甲醇色譜純(廠家:西隴試劑;純度:≥99.9%);十二烷基硫酸鈉(廠家:西安天正藥用輔料有限公司;純度:99.0%);實驗用水:娃哈哈牌純凈水。

釋放度實驗所用樣品架為本實驗室自制的聚四氟乙烯樣品架,外徑為27mm左右,內(nèi)徑為22mm左右。釋放用微孔濾膜分別來自英國Whatman公司提供的徑跡蝕刻聚碳酸酯濾膜(PC膜)和尼龍濾膜、北京索萊寶科技有限公司提供的透析袋。

1.2 實驗方法

體外釋放度實驗參考中國藥典2020年版四部通則0931項下溶出度與釋放度測定方法第一法(籃法)進(jìn)行測定[10]。利用正交實驗考察不同材質(zhì)、不同孔徑的微孔濾膜以及不同釋放介質(zhì)對黃體酮陰道緩釋凝膠在4、12、24、36、48和72h的累計釋放率的影響[11]。

1.2.1 對照溶液的制備

取黃體酮對照品4mg精密稱定。置100mL量瓶中,加甲醇適量使溶解,并用甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密量取上述溶液10mL置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。以20%的甲醇溶液作為空白對照。利用高效液相色譜儀進(jìn)行色譜測定,按外標(biāo)法以峰面積計算。

1.2.2 供試溶液的制備

取濾膜1片,用鑷子將其放在自制的聚四氟乙烯樣品架上(如圖1),使活性層朝上。精密稱取三份100mg供試品,分別均勻涂抹于3個自制樣品架上的膜中心(樣品涂抹面積約為釋放膜面積的1/3),以籃法測定[12]。將樣品架浸入釋放介質(zhì)液面下1cm左右(如圖1)。釋放條件:釋放介質(zhì)體積:1000mL、轉(zhuǎn)速:100r/min、水溫:(37±0.5)℃;于4、12、24、36、48和72h,各取出5mL釋放液,并補(bǔ)充相同體積的釋放介質(zhì),經(jīng)0.45μm的過濾膜過濾后,吸取20μL續(xù)濾液進(jìn)入高效液相色譜儀,待測。按外標(biāo)法以峰面積計算其在不同時間的累計釋放率[13]。

圖1 自制樣品架示意圖

1.2.3 色譜條件

a.色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠;b.流動相:甲醇-水(75∶25);c.流速:1mL/min;d.檢測波長:254nm;e.柱溫:40℃;f.進(jìn)樣量:20μL。

1.2.4 藥物體外釋放率計算公式

雪諾同中黃體酮的累計體外釋放率按公式[14-15]計算:

式中:LCn%-表示累積釋放率,單位為%;LC-表示標(biāo)示量,單位為mg;V-表示取樣體積,單位為mL;1000-表示釋放介質(zhì)體積,單位為mL;N-取樣次數(shù);Cn-取樣點n時的藥物濃度,單位為mg/mL;Ci-取樣點i時的藥物濃度,單位為mg/mL。

1.3 正交實驗方法

根據(jù)實驗條件,設(shè)計三因素三水平表,3個因素分別為濾膜材質(zhì)(因子A)、濾膜孔徑(因子B)和釋放介質(zhì)(因子C),每個因子設(shè)置3個水平,見表1。

表1 三因素三水平表

將3個因素各取3個水平進(jìn)行排列組合,設(shè)計九組實驗,繪制正交實驗表格,見表2。根據(jù)正交實驗表,開展實驗1～9,以篩選最佳實驗方案,考察不同材質(zhì)、不同孔徑的濾膜以及不同成分的釋放介質(zhì)對黃體酮陰道緩釋凝膠藥物體外釋放度的影響。

表2 正交實驗表

2 結(jié) 果

2.1 色譜結(jié)果

根據(jù)“1.2.3”項下色譜條件,將空白對照溶液、黃體酮對照溶液和黃體酮凝膠在4、12、24、36、48和72h的供試溶液分別進(jìn)樣,對照溶液的峰面積分別為319715、322125,峰面積的RSD值為0.53%,精密度良好。根據(jù)圖2～4可知,該色譜條件下的檢驗方法專屬性良好。

圖2 空白對照溶液色譜圖

圖3 黃體酮對照品溶液色譜圖

2.2 正交實驗結(jié)果

將正交實驗1～9的色譜測定結(jié)果分別代入“1.2.4”項下藥物體外釋放率計算公式中,得到不同因素水平下的藥物累計釋放率,見表3。根據(jù)正交實驗結(jié)果,繪制極差分析表,見表4。根據(jù)表4可知,對試驗結(jié)果影響最大的因素為因子A(濾膜材質(zhì))。最佳因素組合為:因子A(濾膜材質(zhì))為聚碳酸酯膜、因子B(濾膜孔徑)為0.05μm、因子C(釋放介質(zhì))為0.5%十二烷基硫酸鈉磷酸緩沖鹽溶液。因素主次順序:因子A(濾膜材質(zhì))>因子C(釋放介質(zhì))>因子B(濾膜孔徑)。

表3 正交實驗結(jié)果

表4 極差分析表

2.3 藥物累計釋放率曲線

通過對實驗結(jié)果進(jìn)行辯證分析,繪制了不同孔徑濾膜、不同材質(zhì)濾膜和不同釋放介質(zhì)3個影響因素下的黃體酮累計釋放率曲線,見圖5～7。根據(jù)圖5可知,當(dāng)濾膜孔徑發(fā)生改變,而濾膜材質(zhì)、釋放介質(zhì)等其他條件不變時,對藥物累計釋放率影響較小,濾膜孔徑為0.05μm時的藥物累計釋放率稍高。根據(jù)圖6可知,當(dāng)濾膜材質(zhì)發(fā)生改變,而濾膜的孔徑、釋放介質(zhì)等其他條件不變時,對藥物累計釋放率的影響較大。當(dāng)濾膜材質(zhì)為聚碳酸酯(PC)膜時的藥物累計釋放率最高,當(dāng)材質(zhì)為透析袋時藥物釋放率近乎為零,因此,濾膜材質(zhì)對藥物釋放度的影響較為明顯。根據(jù)圖7可知,當(dāng)釋放介質(zhì)發(fā)生改變而其他條件不變時,對藥物累計釋放度影響較小,當(dāng)釋放介質(zhì)為20%甲醇溶液時藥物釋放效果更佳。

圖5 不同孔徑濾膜條件下黃體酮的累計釋放率曲線

圖6 不同材質(zhì)濾膜條件下黃體酮的累計釋放率曲線

圖7 不同釋放介質(zhì)條件下黃體酮的累計釋放率曲線

3 討 論

聚碳酸酯濾膜是在超凈條件下,采用先進(jìn)電介質(zhì)技術(shù)制成的無菌膜,它包含均一的圓柱型小孔,膜表面光滑且平整,對提取物幾乎沒有吸附,便于對截留物粒子進(jìn)行觀察。主要特性為:孔徑精確、流速快;低灰分和皮重;低蛋白吸附力、低水平反吸附,樣品不易被污染;具有生物惰性和良好的耐化學(xué)性和熱穩(wěn)定性,適用于大多樣品[16]。

尼龍濾膜是一種常見的濾膜材料,它具有優(yōu)異的物理和化學(xué)性質(zhì),廣泛應(yīng)用于過濾、分離、純化等領(lǐng)域。其主要特性為:親水性好,無需潤濕劑,潤濕劑在過濾水溶液時會被萃取;柔韌性好、耐用、抗撕扯,能在135℃下高溫滅菌;耐適當(dāng)濃度的酸堿,不僅適用于含有酸堿性的水溶液,亦適用于過濾大多數(shù)有機(jī)溶液[17]。

透析袋通常是由半透膜制成的袋狀容器,在生物大分子的制備過程中,除去鹽、少量有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品時都要用到透析技術(shù)。透析袋的主要特性為:透析動力來自擴(kuò)散壓,擴(kuò)散壓由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成;透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度,且正比于膜的面積和溫度;透析溫度通常為4℃,當(dāng)溫度升高可加快透析速度。但是,半透膜制成的透析袋可能存在透析時間長、樣品回收率不高和無法處理微量樣品的缺點[18]。

在進(jìn)行藥物體外釋放試驗時,觀察到以下實驗現(xiàn)象:尼龍膜上的凝膠大多與反滲介質(zhì)一起形成混懸狀態(tài),而PC膜上的凝膠大多吸附在膜表面,少許與反滲介質(zhì)混懸;尼龍膜于藥物釋放8h后出現(xiàn)明顯的反滲現(xiàn)象,PC膜該現(xiàn)象則不明顯;當(dāng)釋放介質(zhì)為0.5%十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖溶液時,濾膜與釋放介質(zhì)接觸面容易出現(xiàn)氣泡,因此在進(jìn)行釋放實驗前,需確保釋放介質(zhì)內(nèi)的氣泡充分排出[19-20];藥物釋放12h后9組實驗的釋放介質(zhì)液面均下降明顯(約下降0.4cm)?？紤]到釋放介質(zhì)為有機(jī)溶劑,易揮發(fā),在后期試驗中用保鮮膜充分密封杯口[21],效果顯著,有效防止了釋放介質(zhì)的揮發(fā)。

依據(jù)當(dāng)前的黃體酮陰道緩釋凝膠進(jìn)口藥物注冊標(biāo)準(zhǔn),要求黃體酮陰道緩釋凝膠在4、24與72h的平均釋放量分別成為標(biāo)示量的15%～30%、35%以上與70%以上[22]。通過實驗發(fā)現(xiàn),使用尼龍材質(zhì)微孔濾膜時藥物4、24、72h的累計釋放度均未達(dá)到該方法規(guī)定的要求,且在使用0.5%十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液后其72h釋放度仍只有54.82%。而使用相同孔徑的聚碳酸酯纖維濾膜,以0.5%十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)時,黃體酮24h累計釋放率>35%,72h累計釋放率可達(dá)80%,藥物釋放效果更佳。根據(jù)正交實驗極差分析結(jié)果可知,濾膜材質(zhì)對藥物釋放速率有明顯影響,極差值(R)=74.88,影響因素主次順序為因子A(濾膜材質(zhì))>因子C(釋放介質(zhì))>因子B(濾膜孔徑)。因此,選擇孔徑為0.05μm的聚碳酸酯膜作為釋放濾膜以及0.5%十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)時,可獲得較理想的實驗結(jié)果。