茯苓三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及酶動(dòng)力學(xué)研究*

高滿軍,黃興瓊,莫啟貴,陳 迷,趙寶清**,張丹丹**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

近年來(lái),糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)均明顯上升,到2035年世界糖尿病發(fā)病率約為5.92億人[1-2],其誘發(fā)因素與肥胖、胰島素抵抗、嗜煙嗜酒、生活不規(guī)律等有關(guān)。由糖尿病引起的并發(fā)癥諸多,涉及人體的眼、腦、心、腎、血管、神經(jīng)等病變,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是與血糖水平密切相關(guān)的兩種酶,它們?cè)诳刂葡拖窃矫嫫鹬匾饔?。臨床上,一類(lèi)藥物可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的功能,如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等,對(duì)降低餐后血糖有顯著效果。但這些藥物通常存在一些不良反應(yīng),如腹脹、腹瀉、腹痛等。因此,尋找副作用小、安全性高的天然α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑勢(shì)在必行。

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,是藥食兩用的中藥大品種,臨床應(yīng)用廣泛,素有“十藥九茯苓”之說(shuō)。多糖類(lèi)及三萜類(lèi)是其主要藥理活性成分,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,茯苓具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗心衰、保肝、免疫、鎮(zhèn)靜等作用[3-8]?，F(xiàn)有研究表明,茯苓能夠有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病大鼠胰島素抵抗、血糖升高、胰島素分泌不足等癥狀,有明顯的抗糖尿病藥理活性[9-12],茯苓三萜是茯苓發(fā)揮藥理作用的主要成分之一。本研究考察了茯苓三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用,為茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)降血糖藥物研發(fā)及其他的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-葡萄糖苷酶(批號(hào):C13893463)、對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷(批號(hào):C13575238)、谷胱甘肽(批號(hào):EZ7890C369,含量≥98%)、α-淀粉酶(批號(hào):C14616860)、可溶性淀粉(批號(hào):C14493944)、磷酸氫二鉀(批號(hào):C14569133)、磷酸二氫鉀(批號(hào):C14416643)、酒石酸鉀鈉(批號(hào):C14373771)、苯酚(批號(hào):H2212440)、氫氧化鈉(批號(hào):C2201178)和亞硫酸氫鈉(批號(hào):B2218503)均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。其他試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

1.2 儀器

UV-1900PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(翱翔儀器上海有限公司),ME204E/02型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司),Milli-Q型超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 不同濃度茯苓三萜的制備

茯苓三萜的制備:將準(zhǔn)確稱(chēng)重的茯苓粉末樣品(800.0g)在80%乙醇中回流加熱兩次,每次加熱1h,獲得茯苓醇提物,將醇提物經(jīng)減壓濃縮,得無(wú)醇味的濃縮液,濃縮液用乙酸乙酯萃取3次,回收乙酸乙酯層液體,將其進(jìn)行減壓干燥得到茯苓三萜提取物。采用香草醛-冰酸酸-高氯酸的方法,用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定,總?cè)坪繛?2.26%。

α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)中茯苓三萜的制備:稱(chēng)取茯苓三萜20.00mg,精密稱(chēng)定,溶于500μL 95%乙醇溶液,即40.01mg/mL作為母液,吸取不同體積的母液2、8、16、32、64μL,加入PBS稀釋到500μL,濃度即為1.05、4.20、8.40、16.80、33.60μg/mL。

α-淀粉酶實(shí)驗(yàn)中茯苓三萜的制備:分別吸取40.01mg/mL的母液1、2、3、4、6μL,加入PBS稀釋到500μL,濃度即為3.20、6.40、9.60、12.80、19.20μg/mL。

1.4 茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 不同濃度的茯苓三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制

實(shí)驗(yàn)方法參照sigma公司α-葡萄糖苷酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,固定α-葡萄糖苷酶為2U/mL,加入不同濃度(1.05、4.20、8.40、16.80、33.6μg/mL)的茯苓三萜分為5組,再將每組分為樣品管、樣品對(duì)照管、空白管、空白對(duì)照管,樣品管和樣品對(duì)照管加入0.2mL同濃度茯苓三萜,空白對(duì)照管和空白對(duì)照管加入等體積PBS,樣品管和空白管中加入0.2mL酶,樣品對(duì)照管和空白對(duì)照管中加入等體積PBS,混合均勻后,加入PBS 5mL、GSH 0.2mL,混合均勻,37℃水浴5min,加入0.5mL PNPG,37℃水浴20min,分別取以上各管混合溶液2mL,加入8mL Na2CO3終止反應(yīng)后,立即在400nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(A)值。每個(gè)濃度樣品同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行測(cè)定并取平均值(下同)。按公式:

釆用分光光度法測(cè)定α-葡萄糖苷酶活力,使用IBM SPSS Statistics26計(jì)算相應(yīng)的IC50值。

1.4.2 不同濃度的茯苓三萜對(duì)α-淀粉酶的抑制

參照潘玥等[13]實(shí)驗(yàn)方法,并進(jìn)行略微改動(dòng)。固定α-葡萄糖苷酶為2U/mL,不同濃度(3.20、6.40、9.60、12.80、19.20μg/mL)的茯苓三萜混懸液分為5組,再將每組分為樣品管、樣品對(duì)照管、空白管、空白對(duì)照管,樣品管和樣品對(duì)照管加入200μL同濃度茯苓三萜,空白管和樣品對(duì)照管加入等體積PBS;樣品管和空白管中加入200μL酶,樣品對(duì)照管和空白對(duì)照管中加入等體積PBS,混合均勻后加入于37℃水浴10min,再加入1%可溶性淀粉溶液200μL,混勻后于37℃水浴10min,加入800μL的DNS溶液終止反應(yīng),反應(yīng)液置于沸水中加熱5min后取出,于冰水浴中迅速冷卻,最后用PBS補(bǔ)足到5mL混勻,采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,根據(jù)下列計(jì)算公式計(jì)算抑制率:

使用IBM SPSS Statistics 26計(jì)算相應(yīng)的IC50值。

1.5 不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)酶抑制動(dòng)力學(xué)研究

1.5.1 不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型

(1)抑制可逆與否的判斷。參照賀水花等[14]實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行適當(dāng)改動(dòng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取0.2mL不同濃度的茯苓三萜(0、1.05、4.20、8.40、16.80μg/mL),在一系列不同濃度的酶濃度下(0.5、1、2、4 U/mL),其他試劑及反應(yīng)條件同1.4.1,測(cè)定其反應(yīng)吸光值,在上述酶濃度下測(cè)定反應(yīng)吸光值,并按照公式:

計(jì)算反應(yīng)速率,然后根據(jù)酶反應(yīng)速率與酶濃度之間的變化關(guān)系作圖,并判斷其抑制類(lèi)型可逆與否。

(2)抑制競(jìng)爭(zhēng)類(lèi)型的判斷。參照1.4.1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。固定α-葡萄糖苷酶的濃度,吸取0.2mL不同濃度(0、1.05、4.20、8.40、16.80μg/mL)的茯苓三萜溶液作為抑制劑,測(cè)定不同PNPG濃度(2、4、6、8、10mmol/L)對(duì)α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)速率,以底物的濃度為倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo),將1/V對(duì)1/[S]進(jìn)行l(wèi)ineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖分析,觀察米氏常數(shù)Km和酶促反應(yīng)最大速率Vmax,確定抑制類(lèi)型,即:

1.5.2 不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶抑制類(lèi)型

(1)抑制可逆與否的判斷。實(shí)驗(yàn)參照關(guān)媛等[15]研究方法并略作修改,固定底物濃度,改變酶濃度(0.25、0.5、1、2 U/mL),反應(yīng)時(shí)間30min,540 nm分光光度分別測(cè)定不同濃度的茯苓三萜溶劑(0、3.20、6.40、12.80、19.20μg/mL)反應(yīng)體系的吸光值,按照1.5.1(1)的方法計(jì)算反應(yīng)速率,根據(jù)酶反應(yīng)速率與酶濃度之間的變化關(guān)系作圖,并判斷其抑制類(lèi)型可逆與否。

(2)抑制競(jìng)爭(zhēng)類(lèi)型的判斷。參照1.5.1(2)的方法稍作改動(dòng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取不同濃度的茯苓三萜溶劑(1.60、3.20、6.40、12.80、19.20μg/mL)作為抑制劑,加入2U/mL的酶溶液0.2mL,混勻,分別加入0.2mL不同濃度(0.1%、0.2%、0.4%)的淀粉底物溶液,按照1.4.2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),540nm分光光度測(cè)吸光值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 26版及Graphpad grism 8統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與圖表分析。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由表1和圖1可以看出,不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。隨著茯苓三萜濃度的提高,抑制效果越強(qiáng),其IC50值為1.40μg/mL。

圖1 茯苓三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

表1 不同濃度的茯苓三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.2 對(duì)α-淀粉酶的抑制活性

由表2和圖2可以看出不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶具有抑制作用,且隨著濃度的提高,抑制效果不斷增強(qiáng),其IC50值為10.43μg/mL。

圖2 茯苓三萜對(duì)α-淀粉酶的抑制活性

表2 不同濃度的茯苓三萜對(duì)α-淀粉酶的抑制率

2.3 不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)酶動(dòng)力學(xué)研究

2.3.1 不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型

(1)抑制可逆與否的判斷。抑制類(lèi)型可分為可逆和不可逆兩類(lèi),可通過(guò)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析。由圖3可知α-葡萄糖苷酶活力的抑制動(dòng)力學(xué)曲線部分重合且均基本通過(guò)原點(diǎn),加入不同濃度的茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)與未加抑制劑的α-葡萄糖苷酶活力的抑制動(dòng)力學(xué)曲線均基本通過(guò)原點(diǎn),可判斷不同濃度的茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型為可逆抑制類(lèi)型。

圖3 不同濃度茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)曲線

(2)抑制競(jìng)爭(zhēng)類(lèi)型的判斷。由圖4可知,隨著茯苓三萜濃度的提高,其對(duì)應(yīng)的雙倒數(shù)曲線的橫截距越小,縱截距越大,酶反應(yīng)的最大反應(yīng)速率(Vmax)減小,米氏常數(shù)(Km)升高,依據(jù)圖線趨勢(shì)所看,所有直線基本相交于x軸負(fù)半軸,可判斷該動(dòng)力學(xué)曲線符合線性非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)曲線的特點(diǎn)。茯苓三萜抑制劑與酶的非活性部位相結(jié)合,形成抑制物-酶的絡(luò)合物后會(huì)進(jìn)一步再與底物結(jié)合,根據(jù)此種抑制類(lèi)型機(jī)理,分析可知酶與底物結(jié)合成底物酶絡(luò)合物后,其中有部分再與抑制物結(jié)合,導(dǎo)致了酶催化反應(yīng)速率的降低,減少產(chǎn)物葡萄糖的生成,從而可達(dá)到延緩血糖升高的目的。

圖4 不同濃度茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型曲線

2.3.2 不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶的抑制類(lèi)型

(1)抑制可逆與否的判斷。以酶濃度作為橫坐標(biāo),初速率為縱坐標(biāo)繪制曲線,如圖5所示,加入不同濃度的茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)(1.60、3.20、6.40、12.80、19.20μg/mL),固定α-淀粉酶濃度為1U/mL,由圖5可知,加入不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)的α-淀粉酶活力的抑制動(dòng)力學(xué)曲線均趨向于通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn),且濃度的提高,斜率越小,反應(yīng)初始速率越小,可判斷不同濃度的茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶抑制類(lèi)型為可逆抑制類(lèi)型。

圖5 不同濃度的茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)曲線

(2)抑制競(jìng)爭(zhēng)類(lèi)型的判斷。由圖6可知,隨著抑制劑濃度增高,酶反應(yīng)的最大反應(yīng)速率(Vmax)減小,米氏常數(shù)(Km)升高,所有直線相交于第一象限,可判斷該動(dòng)力學(xué)曲線符合線性混合型抑制動(dòng)力學(xué)曲線的特點(diǎn)。

圖6 不同濃度茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-淀粉酶抑制類(lèi)型曲線

3 討 論

茯苓為藥食兩用的中藥大品種,藥用歷史悠久,在治療糖尿病等疾病上有顯著效果,且毒副作用小,具有巨大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。茯苓三萜是其主要的活性成分之一,但對(duì)茯苓三萜治療糖尿病疾病的研究很少,因此,本文較為系統(tǒng)地研究了不同濃度的茯苓三萜物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性并對(duì)其酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析,探究其降血糖活性。研究結(jié)果顯示不同濃度的茯苓三萜類(lèi)物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制活性,且濃度越高,抑制活性越強(qiáng),三萜濃度逐漸提高后,抑制作用達(dá)到一定程度趨于平穩(wěn)。酶動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示:α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為可逆非競(jìng)爭(zhēng)抑制類(lèi)型,對(duì)α-淀粉酶的抑制類(lèi)型為可逆混合抑制類(lèi)型。

以酶濃度為橫坐標(biāo),初速率為縱坐標(biāo),當(dāng)測(cè)定酶活力的體系中不存在抑制劑時(shí),速率直線通過(guò)原點(diǎn),當(dāng)有不可逆抑制劑存在時(shí),其速率直線不通過(guò)原點(diǎn),不可逆抑制劑的作用相當(dāng)于將原點(diǎn)平行向右移動(dòng);若有一定量的可逆性抑制劑時(shí),因?yàn)橐种苿┑牧渴呛愣ǖ?可得到一條通過(guò)原點(diǎn)而斜率較低的直線;以底物的濃度為倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo),若所有曲線(不同的抑制劑濃度)的交點(diǎn)在y軸上,則表明化合物為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑;若在x軸上則表明化合物為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑;若交點(diǎn)不在坐標(biāo)軸上則表明化合物為混合性抑制劑[16]。因此,根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)結(jié)果可知:茯苓三萜對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制類(lèi)型,對(duì)α-淀粉酶的抑制類(lèi)型為混合抑制類(lèi)型。

為了進(jìn)一步證明茯苓三萜物質(zhì)的降血糖活性,我們后期將進(jìn)行體內(nèi)藥理試驗(yàn)及作用機(jī)制的研究,研究結(jié)果可為茯苓作為α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑及其降血糖功能藥品、食品的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。