索拉非尼聯(lián)合吳茱萸堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤作用*

陳 慧,寧 琳,蔡 麗,陳天宇,歐陽(yáng)昌漢

(1.成都東軟學(xué)院健康醫(yī)療科技學(xué)院,四川 成都 611844;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院;3.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院)

原發(fā)性肝癌已成為全球常見(jiàn)癌癥,也是全球癌癥相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)公布了2020年全球肝癌的發(fā)病率與死亡率分別位居所有惡性腫瘤第6位與第3位[1]。據(jù)國(guó)家癌癥中心的數(shù)據(jù)顯示,肝癌已成為我國(guó)第4位常見(jiàn)惡性腫瘤,中國(guó)肝癌死亡率占全球肝癌總死亡數(shù)的一半以上[2]。目前,肝癌的治療方法主要包括肝切除、肝移植、局部消融、肝動(dòng)脈化療栓塞和藥物治療等[3]。索拉非尼(sorafenib,Sora)是治療晚期HCC的一線抗癌藥,但由于其敏感性和耐藥性問(wèn)題,使患者服用后無(wú)法達(dá)到良好治療作用[4],因此,需要更有效的治療藥物或治療方式。吳茱萸堿(evodiamine,Evo)是一種從中草藥吳茱萸中提取的生物堿,在多種腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型中均證實(shí)具有較強(qiáng)的抗腫瘤及化療增敏作用[5]。但吳茱萸堿聯(lián)合索拉非尼能否發(fā)揮協(xié)同抗肝細(xì)胞癌的效應(yīng)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討Sora與Evo聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡的影響,為肝癌的有效治療提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

索拉非尼(批號(hào):S739708;純度:99.89%)、吳茱萸堿(批號(hào):S238202;純度:99.76%),均購(gòu)自美國(guó)Selleck公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、PBS緩沖液、CCK-8均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;RIPA緩沖液、Annexin V-FITC/PI均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;一抗GAPDH、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3,二抗山羊抗兔IgG-HRP均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世界科技有限公司);倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);電泳儀(美國(guó) Bio-Rad 公司);自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SYNGENE公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞系均在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并在含有5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞毒性測(cè)定與協(xié)同指數(shù)計(jì)算

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2細(xì)胞,以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后分組進(jìn)行處理,分為空白對(duì)照組、Sora單獨(dú)用藥組(0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20、50μmol/L)、Evo單獨(dú)用藥組(0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20、50μmol/L)、Sora與Evo聯(lián)合用藥組,以上每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞與不同劑量的Sora、Evo或其組合物共同孵育24h后,每孔加入10μL CCK-8溶液,37℃避光溫育2h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度來(lái)評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,計(jì)算公式如下:生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%,并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制數(shù)(IC50),同時(shí)使用Compu Syn軟件計(jì)算協(xié)同指數(shù)(combination index,CI),CI<1表示協(xié)同作用,CI=1表示相加效應(yīng),CI>1表示拮抗作用[6]。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2細(xì)胞,以1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后,將細(xì)胞與不同劑量的Sora、Evo或其組合物共同孵育24h。胰蛋白酶消化并收集各組細(xì)胞,離心,加入預(yù)冷PBS緩沖液洗滌,再加入binding buffer 0.5mL輕柔吹打重懸細(xì)胞,避光加入10μL FITC/PI溶液孵育20min,于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡程度。

1.3.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌HepG2細(xì)胞,以1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后分組進(jìn)行處理,以DMSO為對(duì)照組,單用Sora 5μmol/L、Evo 1μmol/L及其聯(lián)合用藥組為實(shí)驗(yàn)組。藥物作用24h后,于冰上用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度,取20μg蛋白樣品上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2h,膜與一抗在4℃下孵育過(guò)夜,PBS洗滌,室溫與二抗孵育1h,PBS洗滌,ECL試劑顯影。使用Image J分析各目的蛋白的灰度值,用GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定

不同濃度的Sora與Evo分別處理HepG2細(xì)胞24、48、72h,采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示(圖1),隨著Sora與Evo藥物濃度的增大,HepG2細(xì)胞的存活率都有明顯的降低;隨著藥物作用時(shí)間的增加,腫瘤細(xì)胞的存活率同樣有所下降。同時(shí),表1顯示了不同藥物組對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50,隨著藥物作用時(shí)間的增加,IC50值越來(lái)越小,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,選擇48h作為藥物處理時(shí)間。上述結(jié)果提示Sora與Evo殺傷肝癌細(xì)胞HepG2均具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性,這為Sora與Evo協(xié)同治療肝癌提供了可能性。

表1 不同藥物組對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50(n=6,μmol/L)

圖1 Sora和Evo對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖抑制作用的時(shí)間與濃度相關(guān)性

2.2 Sora和Evo聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制具有協(xié)同作用

采用Compu Syn軟件計(jì)算兩藥聯(lián)用的CI。結(jié)果顯示,兩藥在5種不同濃度下聯(lián)用時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的CI均小于1,表明Sora和Evo聯(lián)用呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng),能更好地抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖(圖2,表2)。

表2 Sora和Evo對(duì)HepG2細(xì)胞聯(lián)合作用的CI值

a.不同濃度Sora和Evo聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響(與Sora組比較,*P<0.05,**P<0.01;與Evo組比較,#P<0.05);b.HepG2細(xì)胞中Sora和Evo聯(lián)合處理的等效線圖;斜邊左下角,協(xié)同作用。圖2 Sora和Evo聯(lián)合在HepG2細(xì)胞中的作用評(píng)價(jià)

2.3 Sora和Evo聯(lián)用對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法評(píng)估藥物對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Sora或Evo單獨(dú)用藥組細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.01);與Sora或Evo單獨(dú)用藥組相比,聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.01),提示Sora與Evo聯(lián)合用藥后,能夠顯著提高其誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡的能力(圖3)。

與Control組比較,**P<0.01;與Sora組比較,##P<0.01;與Evo組比較,&&P<0.01。圖3 Sora、Evo及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

2.4 Sora和Evo聯(lián)用誘導(dǎo)細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加

采用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Sora或Evo使Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05,P<0.01),使Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與單獨(dú)用藥組相比,聯(lián)合用藥可進(jìn)一步上調(diào)細(xì)胞Bax、Cleaved caspase-3蛋白(P<0.05,P<0.01)及下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。表明兩藥聯(lián)用增強(qiáng)了對(duì)HepG2細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的抑制,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖4)。

與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與Sora組比較,#P<0.05,##P<0.01;與Evo組比較,&P<0.05,&&P<0.01。圖4 Sora、Evo及聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

3 討 論

索拉非尼是晚期HCC患者的唯一全身治療選擇,但由于其頻發(fā)的耐藥性導(dǎo)致藥物治療效果不理想,探索更有效的治療策略來(lái)增強(qiáng)其抗腫瘤活性具有重要臨床意義。Wang等[7]報(bào)道葫蘆素B聯(lián)合索拉非尼可通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-3和caspase-9水平產(chǎn)生協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。Li等[8]研究表明青蒿琥酯可在體內(nèi)外顯著增強(qiáng)索拉非尼對(duì)HCC細(xì)胞系和荷Huh7腫瘤小鼠的抗癌作用,其機(jī)制與氧化誘導(dǎo)的溶酶體活化、誘導(dǎo)鐵死亡和提高索拉非尼敏感性有關(guān)。以上研究均證實(shí)了索拉非尼聯(lián)合中藥可增強(qiáng)HCC的治療效果,激發(fā)我們進(jìn)一步探索更有效的聯(lián)合治療藥物。

吳茱萸堿是一種喹唑啉咔啉生物堿,具有抗腫瘤、保護(hù)心臟和調(diào)節(jié)代謝性疾病等藥理活性[9]。研究表明吳茱萸堿不僅對(duì)多種惡性腫瘤具有顯著的抗腫瘤作用,還與部分抗腫瘤藥物聯(lián)合也可發(fā)揮協(xié)同增效作用[10]。本研究結(jié)果顯示,索拉非尼和吳茱萸堿單獨(dú)應(yīng)用可明顯抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng),其在48h的IC50值分別為5.263μmol/L和1.454μmol/L。兩藥采用不同濃度聯(lián)用時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的CI均小于1,表明兩藥聯(lián)用具有協(xié)同作用。

通過(guò)靶向程序性細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡是臨床上有效消除癌細(xì)胞的療法,若腫瘤細(xì)胞逃避凋亡,則可發(fā)生腫瘤耐藥。既往研究表明[11],索拉非尼聯(lián)合ASC-J9?可顯著抑制p-STAT3表達(dá)及其下游基因CCL2和Bcl2表達(dá),從而抑制HCC進(jìn)展。吳茱萸堿可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積和氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào),引發(fā)氧化應(yīng)激,從而激活細(xì)胞凋亡[12]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡分析表明,索拉非尼與吳茱萸堿均能夠促進(jìn)HepG2的凋亡,兩藥聯(lián)用后,促凋亡作用更加顯著,兩藥聯(lián)用組Bax、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平降低,以上結(jié)果表明索拉非尼與吳茱萸堿聯(lián)合使用具有協(xié)同促凋亡作用。

本研究首次證實(shí)索拉非尼聯(lián)合吳茱萸堿可明顯抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖并顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為索拉非尼聯(lián)合吳茱萸堿作為HCC的新化療方案提供了理論依據(jù),但需進(jìn)一步研究以闡明其抗腫瘤作用分子機(jī)制,為有效治療肝癌患者提供證據(jù)。