miR-206、miR-125、miR-21 在乳腺癌新輔助化療療效和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值

高建朝 王思思 張志生 張京力 李曉霞 馬 科 馮志林 周海豐 王展海

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 張家口 075000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1]。新輔助化療是指對(duì)無遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者在手術(shù)治療前，以系統(tǒng)性化療作為治療的第1步，可有效減輕術(shù)前腫瘤負(fù)擔(dān)，提高手術(shù)成功率，或變不可保乳為可保乳，變不能手術(shù)為能手術(shù)，即病理完全緩解（pathological complete response，pCR）[2-3]。有研究結(jié)果顯示，非pCR者無法從新輔助化療中獲益，且可能延誤手術(shù)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致預(yù)后不良[4]。因此，尋找特異性標(biāo)志物，早期預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效及其預(yù)后具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其表達(dá)水平可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，可作為臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[5]。有研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者miR-206、miR-125、miR-21表達(dá)均明顯異常[6-7]，但是否可作為評(píng)估新輔助化療療效和患者預(yù)后的指標(biāo)尚需進(jìn)一步研究。為此，本研究擬探討miR-206、miR-125、miR-21在新輔助化療療效和患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021年7月—2022年7月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院診斷并接受新輔助化療的乳腺癌患者82例（乳腺癌組），均為女性，年齡36～58歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合《中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）》[8]中乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；2）初治，且無遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移；3）未接受過化療和內(nèi)分泌治療，可完成治療和隨訪；4）患者及其家屬均知情同意。選取同期河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院健康體檢者40名作為正常對(duì)照組，均為女性，年齡29～55歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）全身體檢結(jié)果正常；2）知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病，處于妊娠期或哺乳期。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（202012067）

1.2 方法

1.2.1 臨床資料和樣本收集

收集所有對(duì)象的臨床資料，包括年齡、性別、體重指數(shù)、月經(jīng)情況、腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑、臨床分期、病理分級(jí)、Ki-67表達(dá)情況。采集乳腺癌患者新輔助化療前和正常對(duì)照者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血3 mL，1 096×g離心5 min，分離血清，保存待測(cè)。

1.2.2 血清miR-206、miR-125、miR-21檢測(cè)

采用TRIzol試劑（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）提取總RNA，將RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖北艾普蒂生物工程有限公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模版進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。ALLin-One miRNA qPCR Kit試劑盒購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司，檢測(cè)儀器為ProFlex PCR儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。U6上游引物為5'-TGCGGGTGCTCGCTICGCAGC-5'，下游引物為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；miR-206上游引物為 5'-TGGAATGTAAGGAAGTG-3'，下游引物為5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；miR-125上游引物為5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游引物為5'-GCTGTCAACATACGC-TACGTA-3'；miR-21上游引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，下游引物為5'-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3'。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 新輔助化療方案

采用TAC方案（多西紫杉醇75 mg/m2，多柔比星50 mg/m2，環(huán)磷酰胺500 mg/m2）進(jìn)行新輔助化療。以3周為1個(gè)周期，共6個(gè)周期。參考實(shí)體瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[9]，將療效分為完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、進(jìn)展。以完全緩解+部分緩解為化療有效，以穩(wěn)定+進(jìn)展為化療無效。

1.2.4 隨訪

通過微信或電話方式對(duì)所有患者隨訪1年，隨訪終點(diǎn)事件為全因死亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用Bartlett方差齊性檢驗(yàn)和Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)確認(rèn)數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，2個(gè)組之間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用Ridit檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析評(píng)估乳腺癌患者新輔助化療療效的影響因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估各項(xiàng)指標(biāo)判斷新輔助化療療效的效能。采用Kaplan-Meier生存曲線評(píng)估乳腺癌患者的生存情況。采用Cox回歸分析評(píng)估影響乳腺癌患者生存率的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組和正常對(duì)照組血清miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量比較

乳腺癌組血清miR-206、miR-125相對(duì)表達(dá)量低于正常對(duì)照組（P＜0.001），血清miR-21水平高于正常對(duì)照組（P＜0.001）。見表1。

表1 乳腺癌組和正常對(duì)照組血清miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 新輔助化療不同療效的乳腺癌患者臨床病理資料比較

82例乳腺癌患者新輔助化療結(jié)束后，19例完全緩解，38例部分緩解，22例穩(wěn)定，3例進(jìn)展?；熡行?7例，化療無效25例。化療無效組與化療有效組之間腫瘤直徑、臨床分期、病理分級(jí)和血清miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他指標(biāo)2個(gè)組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 乳腺癌患者新輔助化療療效的多因素Logistic回歸分析

以化療療效（化療有效=0，化療無效=1）作為因變量，將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目作為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，校正腫瘤直徑、臨床分期、病理分級(jí)后，血清miR-206、miR-125低表達(dá)和miR-21高表達(dá)是乳腺癌患者化療無效的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.438、0.432、4.512，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為0.232～0.826、0.257～0.725、2.886～7.054，P＜0.05]。見表3。

表3 乳腺癌患者新輔助化療療效多因素Logistic回歸分析

2.4 血清miR-206、miR-125、miR-21對(duì)新輔助化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測(cè)方程：Logit（P）=0.384 42-0.577 09×miR-206-0.514 14×miR-125+0.250 89×miR-21。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-206、miR-125、miR-21單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)判斷化療無效的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.795、0.761、0.782、0.899。見圖1、表4。

圖1 血清miR-206、miR-125、miR-21單項(xiàng)和聯(lián)合檢測(cè)判斷化療無效的ROC曲線

表4 血清miR-206、miR-125、miR-21新輔助化療療效預(yù)測(cè)價(jià)值

2.5 不同預(yù)后乳腺癌患者各項(xiàng)指標(biāo)比較

82例乳腺癌患者化療后隨訪1年，有61例生存（生存組），21例死亡（死亡組）。生存組與死亡組臨床分期、病理分級(jí)和血清miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其他指標(biāo)2個(gè)組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 死亡組和生存組各項(xiàng)指標(biāo)比較

2.6 血清miR-206、miR-125、miR-21判斷乳腺癌患者1年死亡的效能

采用Logistic回歸分析建立聯(lián)合檢測(cè)方程：Logit（P）=0.267 71-0.500 13×miR-206-0.477 99×miR-125+0.243 86×miR-21。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-206、miR-125、miR-21單項(xiàng)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)判斷乳腺癌患者1年死亡的AUC分別為0.757、0.698、0.676、0.838。見圖2、表6。

表6 血清miR-206、miR-125、miR-21判斷乳腺癌患者1年死亡的效能

2.7 不同血清miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量的乳腺癌患者1年生存率比較

根據(jù)ROC曲線得出的最佳臨界值將所有乳腺癌患者分為低表達(dá)（＜最佳臨界值）組和高表達(dá)組（≥最佳臨界值）。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-206高表達(dá)組、miR-125高表達(dá)組1年生存率分別高于血清miR-206低表達(dá)組和miR-125低表達(dá)組（P＜0.05），miR-21低表達(dá)組1年生存率高于miR-21高表達(dá)組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.8 乳腺癌患者1年死亡的危險(xiǎn)因素分析

以預(yù)后作為應(yīng)變量（生存=0，死亡=1），以血清miR-206、miR-125、miR-21相對(duì)表達(dá)量作為自變量（＜均值賦值為1，≥均值賦值為2），進(jìn)行Cox回歸分析。結(jié)果顯示，校正臨床分期、病理分級(jí)后，血清miR-206、miR-125低表達(dá)和miR-21高表達(dá)均為乳腺癌患者1年死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）分別為0.438、0.437、4.240，95%CI分別為0.253～0.758、0.271～0.706、2.624～6.852，P＜0.05]。見表7。

表7 乳腺癌患者1年死亡的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

新輔助化療是乳腺癌治療的重要組成部分。乳腺癌患者采用新輔助化療治療達(dá)pCR后，其遠(yuǎn)期預(yù)后較好[10]，但仍有＜5%的患者新輔助化療過程中會(huì)出現(xiàn)進(jìn)展，甚至喪失手術(shù)機(jī)會(huì)[11]。故尋找可有效預(yù)測(cè)乳腺癌新輔助化療療效的生物標(biāo)志物，指導(dǎo)個(gè)體化治療具有重大意義。

miRNA是一類短鏈非編碼RNA，通過介導(dǎo)靶基因mRNA降解，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，影響其生物學(xué)行為和耐藥的發(fā)生[12]。miR-206定位在6號(hào)染色體，可參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[13]。覃舒婷等[7]的研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者癌組織miR-206呈低表達(dá)，與雌激素受體呈負(fù)相關(guān)（r=-0.274，P＜0.05），且無病生存期明顯縮短。有研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者miR-206表達(dá)與臨床特征密切相關(guān)，有望成為評(píng)估內(nèi)分泌治療敏感性的指標(biāo)[7，14]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清miR-206相對(duì)表達(dá)量顯著降低，miR-206可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，與文獻(xiàn)報(bào)道[7，14]一致；血清miR-206低表達(dá)是化療無效（OR=0.438，95%CI為0.232～0.826）和1年死亡（HR=0.438，95%CI為0.253～0.758）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究結(jié)果顯示，細(xì)胞周期阻滯可有效增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性[14-15]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）4是一類絲/蘇氨酸激酶，通過結(jié)合細(xì)胞周期素D，促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，其過表達(dá)參與乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展[16]。CDK4是miR-206直接作用的靶標(biāo)，miR-206或可通過作用于細(xì)胞周期關(guān)鍵因子CDK4，抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并有效提高化療藥物敏感性，改善患者預(yù)后，但確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。

miR-125包括miR-125a（染色體19q13）與miR-125b（染色體21q21.1和11q24.1），參與細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等多過程。有研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者癌組織和腫瘤細(xì)胞中miR-125均呈低表達(dá)，且與惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清miR-125相對(duì)表達(dá)量顯著降低，提示miR-125可能起抑癌基因的作用；另外，miR-125低表達(dá)還是化療無效（OR=0.432，95%CI為0.257～0.725）和1年死亡（HR=0.437，95%CI為0.271～0.706）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。miR-125是原癌基因ETSI的直接靶點(diǎn)，其可通過調(diào)控ETSI抑制細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制腫瘤[19]。細(xì)胞周期阻滯具有一定的化療增敏作用，這可能是miR-125高表達(dá)患者在接受新輔助化療更易達(dá)到化療有效且預(yù)后更好的重要因素。也有研究結(jié)果顯示，miR-125b可通過調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞中的側(cè)群細(xì)胞，誘導(dǎo)化療耐藥表型[20]。目前，miR-125在乳腺癌耐藥，尤其是新輔助化療耐藥中的具體機(jī)制尚不明確，還需對(duì)此深入研究。

miR-21是目前研究較多、與惡性腫瘤關(guān)系密切的miRNA之一。miR-21在乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)[21]，提示miR-21發(fā)揮著致癌作用，其靶基因是抑癌基因。有研究結(jié)果表明，miR-21作為一個(gè)促癌miRNA，其表達(dá)與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、增殖指數(shù)等密切相關(guān)[22]。但關(guān)于miR-21在乳腺癌新輔助化療療效及預(yù)后中的價(jià)值目前還鮮有研究。本研究結(jié)果顯示，miR-21高表達(dá)可作為乳腺癌新輔助化療無效（OR=4.512，95%CI為2.886～7.054）及1年死亡（HR=4.240，95%CI為2.624～6.852）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但miR-21參與化療抵抗的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-206、miR-125、miR-21聯(lián)合檢測(cè)判斷乳腺癌患者新輔助化療無效和1年死亡的AUC分別為0.899、0.838，具有較高的診斷效能，可為乳腺癌患者新輔助化療療效的判斷和預(yù)后評(píng)估提供更有效的量化參考依據(jù)。

綜上所述，乳腺癌患者血清miR-206、miR-125、miR-21表達(dá)均異常，可作為患者接受新輔助化療療效和預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。