α2珠蛋白基因Questembert變異聯(lián)合-α3.7 缺失導(dǎo)致α-地中海貧血一家系的遺傳學(xué)研究

張?chǎng)嘻?陽(yáng)鑫妙 唐克鋒 李雯雯 沈國(guó)松

α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致的α-珠蛋白鏈合成障礙引起的遺傳性溶血性貧血，它是最常見(jiàn)的常染色體單基因遺傳病，其基因缺陷包括大片段丟失（占95%）和α-珠蛋白基因血紅蛋白A1 帶（HbA1）、血紅蛋白A2 帶（HbA2）變異。病情嚴(yán)重程度與α-珠蛋白鏈減少的程度直接相關(guān)[1]。本研究對(duì)1 例嚴(yán)重溶血性貧血疑似α-地中海貧血的患兒和家系進(jìn)行致病基因分析，發(fā)現(xiàn)了中國(guó)人群罕見(jiàn)的α-地中海貧血致病型變異，并對(duì)先證者母親羊水進(jìn)行產(chǎn)前診斷，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，男，4 歲，貧血嚴(yán)重。2021 年5 月20 日因母親再次妊娠至湖州市婦幼保健院遺傳咨詢門診就診?；純簽樽阍路置洌冈衅诤突純撼錾鷷r(shí)無(wú)異常，患兒出生后1 個(gè)月，呈現(xiàn)貧血狀態(tài)，2 個(gè)月起開始輸血治療，現(xiàn)每4 周輸血400 mL，42 個(gè)月時(shí)行脾切除手術(shù)?；純褐卸蓉氀?，皮膚黏膜黃染出血。父母非近親婚配，父親籍貫江蘇，母親籍貫貴州，父親表型正常；母親此次為自然妊娠中期，胎兒B 超檢查顯示為雙絨雙羊雙胎，無(wú)其他異常；母親及其家系有多名貧血及脾腫大或脾切除史者。收集患兒父母及母親家系貧血成員相關(guān)病歷，并進(jìn)行血液學(xué)相關(guān)檢查。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：2022-J-110），患兒父母與家系成員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血常規(guī)和Hb 電泳檢測(cè) 收集患兒、患兒父母及母親家系部分成員非空腹外周靜脈血2 mL，EDTA 抗凝。先采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定，再采用Sebia capalliary2 毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行Hb 成分分析。

1.2.2 常見(jiàn)地中海貧血基因檢測(cè) 抽取患兒和父母的非空腹外周靜脈血2 mL，EDTA 抗凝。母親孕18 周穿刺取羊水10 mL，進(jìn)行DNA 提取及熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。試劑由廈門致善生物技術(shù)有限公司提供，采用“多色熒光PCR 熔解曲線（MMCA）”技術(shù)，按照基因診斷試劑盒的操作說(shuō)明在羅氏熒光定量PCR Lightcycler 480Ⅱ上進(jìn)行中國(guó)人常見(jiàn)α-地中海貧血基因（包括3種缺失型變異：-SEA、-α3.7、-α4.2，3 種常見(jiàn)非缺失型變異：HbCS、HbWS、HbQS）檢測(cè)。

1.2.3 血液系統(tǒng)疾病Panel 檢測(cè) 將患兒、患兒父母及母親家系成員的外周血及母親羊水送至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)該所提供的血液系統(tǒng)疾病Panel 檢測(cè)項(xiàng)目，從先證者樣本中提取DNA，構(gòu)建文庫(kù)，使用IDTxGen?Exome Research panel v1.0 雜交捕獲試劑完成目標(biāo)區(qū)域捕獲，采用Illumina NovaSeq 完成高通量測(cè)序（測(cè)序讀長(zhǎng)為2×150 bp）。通過(guò)生物信息學(xué)分析，并結(jié)合當(dāng)前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的行業(yè)指南和醫(yī)學(xué)知識(shí)，篩選出與表型相關(guān)的靶向外顯子組區(qū)域的（可能）致病性變異，并對(duì)其設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行Sanger 測(cè)序驗(yàn)證，引物序列HbA2-F：5'-CAGGATTGGGCGAAGCCCT-3'，HbA2-R：5'-GAGGTCCTTGGTCTGAGACAGG-3'；并對(duì)父母、母親家系及母親羊水進(jìn)行該變異位點(diǎn)的Sanger 驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)檢測(cè)樣本的質(zhì)控分析貫穿整個(gè)過(guò)程，并選用8～10 個(gè)高頻單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)作為樣本身份標(biāo)識(shí)。

2 結(jié)果

2.1 先證者及家系成員檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 先證者及家系成員檢測(cè)結(jié)果

2.2 常規(guī)地中海貧血基因診斷 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者和其父親存在αα/-α3.7雜合缺失型突變。

2.3 DNA 變異信息 二代測(cè)序后提示先證者HbA2 基因3 號(hào)外顯子處有一個(gè)純合突變HbA2c.394T＞C（p.S132P），Sanger 測(cè)序驗(yàn)證母親攜帶該位點(diǎn)的雜合性變異，父親為野生純合，見(jiàn)圖1。母親家系的部分成員進(jìn)行該位點(diǎn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了8 名攜帶者；母親羊水細(xì)胞Sanger 測(cè)序雙胎均未攜帶此變異位點(diǎn)，見(jiàn)圖2，隨訪為健康雙胎女嬰。

圖1 HbA2 基因c.394T＞C 變異的Sanger 測(cè)序圖

圖2 患兒家系系譜圖

3 討論

α-珠蛋白基因位于16 號(hào)染色體上（16p13），每條染色體有2 個(gè)連鎖的α-珠蛋白基因，即HbA1 和HbA2基因。1 個(gè)或2 個(gè)α-珠蛋白基因的合成缺陷會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞參數(shù)發(fā)生輕度到中度的變化。大多數(shù)已確定的α-地中海貧血患者是由1 個(gè)或2 個(gè)重復(fù)α-珠蛋白基因的大量缺失引起，這是主要的致病突變，其余則是HbA1 和HbA2 基因點(diǎn)突變引起的非缺失型地中海貧血。此外，已經(jīng)報(bào)道了超過(guò)100 種不同的點(diǎn)突變。這些點(diǎn)突變?nèi)绻押塑账岵迦牒腿笔Т蠖嗯cα-珠蛋白基因正常表達(dá)的關(guān)鍵基因組區(qū)域相關(guān)[2]，通過(guò)多種機(jī)制減少或抑制α-珠蛋白鏈的合成，如影響轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、翻譯后加工等[3]。而一些由α-珠蛋白基因等位基因共同遺傳的非缺失型變異造成α-珠蛋白不穩(wěn)定變體的患者可能出現(xiàn)與地中海貧血中間型血紅蛋白H帶（HbH）病[4]相似的臨床和血液學(xué)結(jié)果。其中產(chǎn)生極不穩(wěn)定的α-珠蛋白變異體的，臨床癥狀（貧血、肝脾腫大、輸血頻次）更加嚴(yán)重[5]。因?yàn)椴环€(wěn)定的α-珠蛋白變異體可能沒(méi)有Hb 運(yùn)輸釋放氧氣和二氧化碳的作用，但它們具有高氧親和力，導(dǎo)致組織供氧減少，造成溶血和貧血，最終導(dǎo)致造血不良的骨髓擴(kuò)張，骨、肝、脾的髓外造血[3]。

第三外顯子突變引起第三外顯子編碼區(qū)域的螺旋H 的破壞，最終造成不穩(wěn)定的α2 珠蛋白鏈變體比較多見(jiàn)。H 螺旋從118 個(gè)氨基酸殘基延伸到138 個(gè)氨基酸殘基，在血紅蛋白四聚體中α1 和β1 單體的疏水接觸中起關(guān)鍵作用，或在α-珠蛋白穩(wěn)定蛋白（AHSP）（α-珠蛋白的分子伴侶）的形成中起關(guān)鍵作用[6]。H 螺旋的突變產(chǎn)生極不穩(wěn)定的Hb 變體[1]，并在紅細(xì)胞中沉淀，導(dǎo)致溶血，出現(xiàn)α 地中海表型[7-8]。如Hb Toyama（p.Leu135Arg）已證實(shí)其表達(dá)水平低于總Hb 的1%[9]；Hb Quong Sze（p.Leu125Pro）是在1 例HbH 病患者中發(fā)現(xiàn)的[10]；Hb Sun Prairie（p.Ala130Pro）[11]和Hb Attleboro（p.Ser138Pro）[12]為兩種低水平表達(dá)的不穩(wěn)定Hb 導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的溶血。

而HbA2 基因c.394T＞C（p.Ser132Pro），又稱為Hb Questembert 變異，可引起H 螺旋中132 位極性中性氨基酸（絲氨酸）轉(zhuǎn)變?yōu)榉菢O性疏水性氨基酸（脯氨酸），導(dǎo)致H 螺旋結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的破壞。迄今為止該變異有少量報(bào)道，其表型主要是結(jié)合了地中海貧血和周圍溶血性貧血的特征。該變異首次于1993 年在法國(guó)Questembert 地區(qū)的一個(gè)先天性Heinz 小體貧血8 例患者的家系中被報(bào)道[13]。該家系為HbA2 基因c.394T＞C變異，功能試驗(yàn)證實(shí)該變異影響了從mRNA 轉(zhuǎn)錄、剪接到蛋白的空間結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，產(chǎn)生了極不穩(wěn)定α-珠蛋白鏈，且其在紅細(xì)胞中表達(dá)水平非常低，造成患者造血功能障礙和周圍性溶血。另1 例報(bào)道為希臘雅典的2 歲重度溶血性貧血患兒，其HbA1 基因的c.394T＞C 變異，并且在反式位置檢出-α3.7缺失[14]。

本研究中，Hb Questembert 變異在家系中攜帶者表現(xiàn)為輕到中度地中海貧血，地中海貧血特征要嚴(yán)重于αα/-α3.7缺失型攜帶者。而先證者測(cè)序?yàn)镠bA2 的c.394T＞C 的純合變異是由于合并反式-α3.7缺失造成，其α-地中海貧血基因型為αQuestembertα/-α3.7。由于HbA2基因編碼的mRNA 的穩(wěn)定水平比HbA1 基因高3 倍[15]，HbA2 上的點(diǎn)突變對(duì)α-珠蛋白鏈影響可能更大[13]。本例先證者對(duì)比希臘雅典患者，具有典型的地中海貧血血液學(xué)特征和嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，其表型傾向于非缺失型HbH 病。

地中海貧血非缺失型變異攜帶者Hb 成分很多沒(méi)有明顯的變化，常規(guī)的PCR 法也難以檢測(cè)。然而，隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，許多α-地中海貧血病的鑒定變得更加容易。因此，臨床上要對(duì)地中海貧血保持高度敏感性，必要時(shí)應(yīng)用遺傳咨詢，以降低母親懷孕期間嚴(yán)重的并發(fā)癥和杜絕中重型α-地中海貧血患兒的出生。Hb Questembert 變異首次在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)，豐富了中國(guó)人群α-地中海貧血突變譜，且經(jīng)過(guò)家系驗(yàn)證，該變異可導(dǎo)致典型的α-地中海貧血，為該家系在遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷中提供重要依據(jù)。

遺傳性血紅蛋白病，包括α-地中海貧血癥的遺傳咨詢是至關(guān)重要的，至少可以最大限度地減少巴特血紅蛋白胎兒積液綜合征的發(fā)生，該綜合征可能導(dǎo)致新生兒死亡和懷孕期間母親的嚴(yán)重健康并發(fā)癥。只有當(dāng)臨床結(jié)果準(zhǔn)確區(qū)分α-珠蛋白基因型和其他相關(guān)基因型，且表現(xiàn)與各種形式的α-地中海貧血相同時(shí)，遺傳咨詢才有意義。隨著遺傳咨詢技術(shù)的發(fā)展，許多α-地中海貧血病遺傳修飾因子的鑒定變得更加容易，并記錄了它們對(duì)各種表型的影響。