正交試驗設計優(yōu)選黔產(chǎn)鐵莧菜水煎法的提取工藝

魏學軍，李雪營，林先燕

(黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校，貴州 都勻 558013)

鐵莧菜作為常用中藥材被《中國藥典》(2020版)收錄，其功能以清熱利濕、收斂止血為主，主要含鞣質(zhì)、黃酮類、生物堿類等成分，臨床用途廣泛。在貴州苗族聚集區(qū)，因其內(nèi)服治療喘咳、腹瀉、紅白痢疾，外用止血的療效顯著，被《中華本草》(苗藥卷)收載，苗藥名為“海蚌含珠”[1]?，F(xiàn)有研究表明[2-4]，鐵莧菜中所含鞣質(zhì)的水解產(chǎn)物沒食子酸具有止瀉、平喘、抗菌消炎和止血的生物活性，這進一步驗證了該民族地區(qū)將其水煎服治療喘咳、腹瀉、紅白痢疾等癥狀的科學合理性。為保證其湯劑制備的應用療效和質(zhì)量，本文以沒食子酸得率為評價指標，對黔產(chǎn)鐵莧菜水煎法的提取工藝進行優(yōu)選，以期為實際應用提供科學的實驗性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 1260 Infinity II型液相色譜系統(tǒng)(北京安捷倫公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；低速離心機(德國HERAEUS)；真空干燥箱(上海金山公司)；電子天平(瑞士METTLER)。沒食子酸對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201906)，乙腈為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)，水為自制重蒸餾水，其他試劑均為AR級。鐵莧菜原藥材(樣品編號202007)采自黔南民族醫(yī)學高等?？茖W校原云宮校區(qū)植物園試驗田地，經(jīng)本校中藥教研室李香教授鑒定為大戟科植物AcalyphaaustralisL.的干燥全草。

1.2 方法

1.2.1 生品的制備[5]將凈制后的新鮮鐵莧菜摘取全葉，切成寬絲；根、莖切段，干燥后混勻即得。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取干燥至恒重過3號篩的鐵莧菜生品粉末1 g，按相關工藝提取，合并提取液，經(jīng)過濾、離心后定容至100 ml容量瓶中，冷藏備用。

1.2.3 沒食子酸含量測定的色譜條件 色譜柱選擇Diamonsil C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(4∶96)為流動相，檢測波長270 nm，室溫，流速控制為1 ml.min-1，進樣量取10 μl。沒食子酸對照品和供試品色譜見圖1。

圖1 沒食子酸對照品(A)和供試品(B)HPLC色譜圖

1.2.4 對照品溶液的制備 精密稱取對照品22.01 mg，用流動相定容至100 ml量瓶中，搖勻即得對照品貯備液；另取1 ml貯備液用流動相定容至10 ml量瓶中，搖勻即得對照品溶液。

1.2.5 標準曲線的制備 精密移取不同體積分數(shù)對照品溶液按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，以對照品溶液濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標制作標準曲線，得回歸方程：A=3.522 3×107C-1 025.493 5(r=0.999 9)。對照品在0.022 0～0.220 1 μg范圍線性關系良好。

1.2.6 方法學考察 取對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，按“1.2.3”項下色譜條件測定，峰面積RSD值2.13%，說明儀器精密度高。另取對照品溶液10 μl，按“1.2.3”項下色譜條件分別在 0、30、60、120、180、240 min測定，峰面積RSD值2.61%，說明對照品溶液在240 min內(nèi)穩(wěn)定。另稱取干燥至恒重過3號篩的鐵莧菜生品粉末1 g，5份，按實驗號1條件制備供試品溶液，微孔濾膜過濾，按“1.2.3”項下色譜條件測定，峰面積RSD值2.07%，說明該方法重現(xiàn)性好。取已知含沒食子酸量的鐵莧菜生品粉末1 g，5份，按實驗號1條件制備供試品溶液，微孔濾膜過濾，按“1.2.3”項下色譜條件測定，對照品平均回收率98.82%，RSD值 1.79%。

1.2.7 含量測定 精密移取不同實驗號樣品提取所得供試品溶液，微孔濾膜過濾，按“1.2.3”項下色譜條件測定并計算沒食子酸得率。

1.2.8 因素水平 根據(jù)單因素預試驗考察結果，固定提取2次，另選取固液比(A)、提取溫度 (B)、提取時間 (C)作為考察因素，各因素取3個水平。詳見表1。

表1 因素水平表

1.2.9 工藝優(yōu)選 按實驗號稱取9份樣品，每份1 g，依據(jù)正交試驗安排表進行提取并測定沒食子酸得率(表2)。數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件包分析處理，以直觀分析結合方差分析(表3)確定最優(yōu)工藝參數(shù)。

表2 正交試驗安排表及結果

表3 方差分析結果

2 結果

2.1 提取工藝 從表2的R值和K值作直觀分析，可選擇工藝參數(shù)為A3B3C3。表3方差分析結果表明，提取溫度(B)對沒食子酸得率影響顯著(P<0.05 )，故確定B3；提取時間(C)和固液比(A)對得率的影響無顯著性(P>0.05 )，從節(jié)約溶媒和時間的角度考慮，提取時間確定C1、固液比確定A1，得優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)為A1B3C1。

2.2 驗證試驗 稱取干燥至恒重過3號篩的鐵莧菜生品粉末5份，每份1 g，按優(yōu)選的最佳提取工藝參數(shù)制備供試品溶液，微孔濾膜過濾后按“1.2.3”項下色譜條件測定。結果顯示，沒食子酸平均得率為2.572 5 mg.g-1，RSD值1.71%，說明優(yōu)選的提取工藝科學合理，重現(xiàn)性好。

3 討論

水煎服是貴州苗族集聚區(qū)采用鐵莧菜治療喘咳、腹瀉、紅白痢疾等癥狀的常用方法，煎煮工藝的合理性，直接決定或影響藥物療效的發(fā)揮。本研究結果表明，不同煎煮工藝參數(shù)對指標性成分的含量有影響，尤其是煎煮溫度，水溫越高越利于沒食子酸的溶出。究其原因，可能與沒食子酸的化學性質(zhì)有關，沒食子酸具有極強的親水性，易溶于水、乙醇，尤其是沸水。

課題組前期的研究結果表明[6]，以乙醇為提取溶劑，采用回流法按優(yōu)選的工藝參數(shù)提取，沒食子酸平均得率(7.888 0 mg.g-1)顯著高于本研究水煎法的得率(2.572 5 mg.g-1)。該結果提示，不同提取方法和工藝對鐵莧菜中沒食子酸提取率的影響顯著，因而需要根據(jù)實際需求選擇科學合理的提取方法和工藝。