烏蕨活性成分含量測定方法

陳 明，段 萍

(1.黔南民族醫(yī)學高等專科學校，貴州 都勻 558013；2.黔南州檢驗檢測院食品藥品檢驗所，貴州 都勻 558000)

烏蕨Stenolomachusanum(L.)Ching為鱗始蕨科烏蕨屬多年生草本植物，別名烏韭、大葉金花草等[1-2]。從上世紀90年代至今，國內學者對烏蕨的活性成分及含量測定方法進行了大量研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的活性成分主要為黃酮類及酚酸類，包括葒草苷、葒草苷-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、芹菜素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素吡喃葡萄糖苷、丁香酸、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸、2，5-二羥基苯甲酸甲酯 、鄰苯二甲酸-二(2-乙基-己基)酯、對羥基苯甲酸、對甲氧基苯甲酸、4-O-β-D- (6-O-gentisoylglucopyranosy1)vanillic acid、2-O-β-D- (6-O-gentisoylglucopyranosy1)gentisicacid及6，7-二羥基香豆素等[3-4]。對活性成分含量測定方法的研究文獻也比較豐富。筆者認為烏蕨活性成分含量測定的方法取得了顯著的進步，基本可滿足制定烏蕨質量標準的有關需要，現(xiàn)綜述如下。

1 烏蕨中酚酸類成分的含量測定方法

酚酸類是烏蕨的主要活性成分，含量較高的是原兒茶酸及原兒茶醛。對酚酸類的含量測定傳統(tǒng)上采用可見分光光度法，目前大多研究者采用高效液相色譜法。

1.1 可見光分光光度法 龔曉莉等[5]研究認為，烏蕨總酚酸的提取采用水和75%乙醇為溶劑，在57℃超聲30 min效果最佳。總酚酸的測定方法為：以原兒茶酸為對照品，配制對照品溶液；以0.3%十二烷基硫酸鈉及6%FeCl3～0.9%K3[Fe(CN)](1∶0.9)混合溶液為顯色劑，混勻，在暗處放置5 min，加0.1 mol/L HC1至刻度，混勻，在暗處放置30 min。以試劑為空白，在717 nm波長處測定吸光度，以濃度C(g/ml)為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。原兒茶酸含量在0.440～3.083 g/ml范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。該方法測定的含量為烏蕨總酚酸含量。

1.2 高效液相色譜法 隨著高效液相色譜儀等精密儀器在基層的逐步普及，陳明等[6]采用HPLC法對烏蕨中酚酸類成分含量測定方法進行了有關研究，色譜條件為：色譜柱迪馬Diamonsil ODS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm )、Agilent ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.4%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～20 min，98%～92% A；20～35 min，92%～98% A；35～40 min，98%A；流速：1.0 ml/min；進樣量：5 μl；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm。理論板數(shù)以原兒茶醛峰計算不低于3 000。原兒茶酸在0.161 8～1.213 0 μg/ml內呈良好的線性關系；原兒茶醛在0.060 3～0.452 2 μg/ml內呈良好的線性關系。該方法同時測定了烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量，與可見分光光度法相比，結果更為準確、精密度高，重復性、穩(wěn)定性好。

2 烏蕨中黃酮類成分的含量測定方法

烏蕨中另一類主要活性成分是黃酮類，主要包括：葒草苷、葒草苷-2″-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、芹菜素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素吡喃葡萄糖苷等。其藥理活性廣泛，有抗炎、抗菌、抗氧化、解毒、降血糖等作用。在上世紀70～90年代的藥品質量標準中，主要采用分光光度法測定總黃酮含量，目前則逐步轉向采用更精密的高效液相色譜法。

2.1 可見分光光度法 主要對烏蕨的總黃酮進行測定，為黃酮類成分含量傳統(tǒng)測定方法?；痉椒閇7-8]：以蘆丁為對照品配置不同濃度的標準溶液，于波長 510 nm處測定吸光度，繪制標準曲線并計算出回歸方程；樣品在相同條件下測定吸光度，與標準曲線對比即得相應的總黃酮含量。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 高效液相色譜法測定烏蕨中牡荊苷的含量 凌宏斌等[9]采用HPLC法對烏蕨中黃酮類活性成分牡荊苷(牡荊素)的含量進行測定。色譜條件采用Dionex-Cl8(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；乙腈-0.2%冰醋酸水溶液(23∶77)為流動相；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μl；檢測波長270 nm。在此色譜條件下，牡荊苷峰理論板數(shù)不小于3 000，分離度大于1.5。結果表明牡荊苷在0.009～0.180 mg/ml濃度范圍內線性關系良好。

2.2.2 HPLC-DAD雙波長法同時測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的含量 為更為高效便捷地測定黃酮類活性成分的含量，胡燕珍等[10]采用HPLC-DAD雙波長法同時測定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛、牡荊苷的含量。色譜條件為：色譜柱Dikmatech Diamonsil Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫；檢測波長：260 nm(原兒茶酸、原兒茶醛)、340 nm(牡荊苷)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃ ；進樣量：10 μl。原兒茶酸線性范圍0.050 3～0.502 6 μg；原兒茶醛線性范圍0.056 4～0.564 0 μg；牡荊苷線性范圍0.143 0～1.430 4 μg。

2.2.3 雙波長高效液相色譜法同時測定烏蕨6種主要活性成分含量 烏蕨的主要活性成分包括酚酸類、黃酮類，為實現(xiàn)便捷高效地同時測定烏蕨的多種活性成分，陳明等[11]通過長期反復摸索，提出了采用雙波長高效液相色譜法同時測定烏蕨6種主要活性成分含量的方法，可以實現(xiàn)同時測定黃酮類、酚酸類主要活性成分。色譜條件為：賽默飛A型C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫：0～5 min(8%A)，5～15 min(8%A～10%A)，15～30 min(10%A～27%A)，30～31 min(27%A～8%A)，31～40 min(8%A)，原兒茶酸、原兒茶醛檢測波長為280 nm，葒草苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、木犀草苷檢測波長為350 nm，柱溫30℃，流速1.0 ml/min，進樣量5 μl。原兒茶酸線性范圍0.161 9～1.214 4 μg；原兒茶醛線性范圍0.063 7～0.477 9 μg；葒草苷線性范圍0.083 5～0.626 5 μg；牡荊素鼠李糖苷線性范圍0.238 5～1.788 5 μg；牡荊素線性范圍0.077 8～0.583 7 μg；木犀草苷線性范圍0.026 3～0.197 0 μg。

2.2.4 一測多評法測定烏蕨中5個黃酮成分含量 在總結有關含量測定方法研究成果的基礎上，萬紅才等[12]采用一測多評法對烏蕨中5個黃酮類成分進行含量測定。色譜條件為：安捷倫C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以5%四氫呋喃乙腈溶液(A)-0.4%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～20 min，15%A；20～35 min，15%A→18%A；35～40 min，18%A→35%A；40～41 min，35% A→15%A；41～50 min，15%A)，流速1.0 ml/min ，檢測波長360 nm，柱溫30℃，進樣量10 μl。線性范圍：葒草苷0.098 4～0.983 5 μg、牡荊素葡萄糖苷0.081 8～0.817 8 μg、牡荊素鼠李糖苷0.094 2～0.941 6 μg、牡荊素0.099 5～0.995 4 μg、木犀草苷0.080 3～0.803 4 μg。待測組分相對校因正子測定及計算：以牡荊素為內參物，計算待測成分葒草苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷的相對校正因子，按照相對校正因子計算公式：fx/r = (Cr ×Ax)/ (Cx×Ar)，式中Cr為參照物濃度，Ar為參照物峰面積，Cx為待測組分濃度，Ax為待測組分峰面積，分別計算葒草苷、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、木犀草苷的校正因子分別為0.772、1.368、1.380、0.731，RSD分別為1.2%、0.47%、0.97%、0.60%。相對校正因子耐用性考察：按上述色譜條件，分別用儀器(安捷倫、賽默飛、島津)和色譜柱(安捷倫、賽默飛、歐姆尼)對相對校正因子和相對保留時間進行考察，結果相對校正因子的RSD在1.5%～0.35%之間，相對保留時間(待測成分峰保留時間T與內參物峰保留時間TR，Tx=T/TR)的RSD在1.3%～0.50%之間，說明相對校正因子和相對保留時間不同儀器和色譜柱條件下的耐用性良好。

3 小結

烏蕨作為一種在我國廣泛分布的常見天然藥物，在少數(shù)民族地區(qū)被長期使用并多次收錄進入地方標準，在傳統(tǒng)醫(yī)學中有較高地位。為保證藥物的質量，對其有效成分進行科學檢測具有重要意義。烏蕨活性成分的含量測定方法比較多，如紫外-可見分光光度法操作簡便、經(jīng)濟實用、儀器普及率高，易于在基層單位推廣使用，適用于植物中總黃酮、總酚酸含量的粗略測定；缺點是不能準確檢測每一種活性成分的含量，不能夠檢測出含量較低的活性成分，精密度不高、專屬性不強。HPLC法可將各活性成分進行分離測定，精密度高、專屬性強，能夠實現(xiàn)微量測定，目前應用較廣。同時，隨著技術手段的不斷進步，測定精度增高、測定時間縮短、操作程序進一步簡化，節(jié)約資源、減少污染是測定方法發(fā)展的必然趨勢[13]。就目前科研單位及生產(chǎn)企業(yè)的設備條件而言，高效液相色譜法已經(jīng)能夠基本滿足烏蕨質量控制的需要，可以推廣使用。