冬季農(nóng)田不同深度土層及小麥根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

田澤遠(yuǎn)，張俊霞，張文俊，劉 彪，顧效綱，胡紅偉

（1.河南城建學(xué)院河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467036；2.江西理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，江西 贛州 341000）

土壤細(xì)菌多樣性對(duì)維持生態(tài)系統(tǒng)功能至關(guān)重要。土壤細(xì)菌群落具有驅(qū)動(dòng)地球化學(xué)循環(huán)、分解有機(jī)物、抑制土傳疾病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等功能［1］。影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的因素有很多，如pH、有機(jī)質(zhì)、氨和磷等［2］。土壤細(xì)菌群落的組成與土壤深度也相關(guān)。在土壤深處，細(xì)菌可利用的養(yǎng)分有限，生物量隨著深度增加呈指數(shù)下降［3］，但某些細(xì)菌的潛在活性可能高于表層土壤［4］。此外，即使在相隔幾微米至幾毫米的土壤環(huán)境中，物理和化學(xué)性質(zhì)、細(xì)菌豐度、群落組成和細(xì)菌活性也可能存在較大差異［5］。

植物根際是土壤細(xì)菌進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化、營(yíng)養(yǎng)吸收的重要場(chǎng)所。根際細(xì)菌有助于植物在養(yǎng)分同化之前將其轉(zhuǎn)化為可用的形式［6］。同時(shí)，植物根系能夠產(chǎn)生如氨基酸、有機(jī)酸、糖類和次生代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，被土壤細(xì)菌用于供能和生物量生產(chǎn)，從而促使更多有益細(xì)菌在土壤中定殖，形成密集復(fù)雜的根際微生態(tài)［7］。植物－土壤反饋是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要決定因素，尤其在農(nóng)業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)中。Fan等［8］通過對(duì)小麥根際細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，非根際土壤和根際土壤的細(xì)菌群落組成差異顯著，并且細(xì)菌多樣性與根系的距離成反比。此外，與非根際土壤相比，根際細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單［9］。

冬季是小麥休眠期，小麥停止生長(zhǎng)后，將營(yíng)養(yǎng)成分儲(chǔ)存在根部，為春季返青提供足夠養(yǎng)分，這一過程對(duì)小麥產(chǎn)量至關(guān)重要。研究這一時(shí)期農(nóng)田土壤及小麥根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)及共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，將有助于深入了解冬季小麥根際微生態(tài)及其響應(yīng)機(jī)制。本研究選擇河南省平頂山市汴城村附近農(nóng)田土壤及小麥根際土壤為研究對(duì)象，使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，選擇16SrRNA V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)細(xì)菌群落的多樣性及組裝機(jī)制進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 采樣區(qū)域概況與樣品采集

采樣點(diǎn)位于河南省平頂山市汴城村附近農(nóng)田（33°40′53.05＂N，113°17′15.17＂E），該區(qū)域?qū)俅箨懶约撅L(fēng)氣候，年降水量500～600 mm。農(nóng)田為多年小麥－玉米連作耕地，土壤類型為褐土，質(zhì)地為壤質(zhì)土。2020年1月，采用五點(diǎn)取樣法，使用直徑為5.5 cm的空心桿手動(dòng)螺旋鉆采集垂直深度為0～20 cm的農(nóng)田土壤樣品，標(biāo)記為非根際（FG）樣品（0≤FG－A≤5 cm、5＜FG－B≤10 cm、10＜FG－C≤15 cm、15＜FG－D≤20 cm），在各點(diǎn)附近采集小麥根際土壤，標(biāo)記為GJ樣品（GJ：4～10 cm）。將同類型土壤樣品混合均勻后，分為兩份，樣品保存于－40℃超低溫冰箱。

1.2 土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定

土壤樣品自然風(fēng)干并過100目篩網(wǎng)后用于理化參數(shù)測(cè)定。參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》［10］測(cè)定土壤中的氨氮（NH＋4－N）、硝酸鹽（NO－3－N）、亞硝酸鹽（NO－2－N）、總磷（TP）和總有機(jī)碳（TOC）。采用濃H2SO4－H2O2法消解，使用凱氏定氮儀（KjeFlex K360，Switzerland）測(cè)定土壤凱氏氮（TKN）。采用電位法，使用pH計(jì)（Hanna HI98130，Italy）測(cè)量pH值。

1.3 PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

稱量0.1 g土樣，采用E.Z.N.ATMMag－Bind Soil DNA Kit試劑盒提取土壤樣品DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。利用16S rRNA V4區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列分別為515F（5′－GTGCCAGCMGCCGCGGTAA－3′）和806R（5′－GGACTACVSGGGTATCTAAT－3′）。使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，高通量測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究所獲數(shù)據(jù)已上傳至NCBI，SRA序列號(hào)為PRJNA776557。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于97%相似度，使用Usearch 7.1對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Unit）分類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU代表序列［11］。使用Mothur 1.30.1進(jìn)行細(xì)菌群落Alpha多樣性分析。使用R的vegan包進(jìn)行細(xì)菌群落Beta多樣性分析和冗余分析（RDA）。使用SPSS25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜線性相關(guān)性分析。使用R的hmisc和igraph包分析細(xì)菌群落之間的相關(guān)性，并使用Gephi 0.9.2（R＞0.6，p＜0.05）進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。利用Excel 2019進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 土壤樣品理化性質(zhì)

土壤理化參數(shù)如圖1所示。土壤pH值介于4.33～5.81，呈酸性，并隨土壤深度增加而增加。TOC含量在各樣品之間存在顯著差異（p＜0.05），且隨土壤深度的增加而減少，GJ中含量最高。TP含量在各樣品之間差異不顯著，介于1.40～1.60 g／kg。NO－2－N和NO－3－N含量最高值分別出現(xiàn)在FG－D（22.4 mg／kg）和FG－B（6.91 g／kg），均顯著高于其他樣品（p＜0.05）。GJ樣品中NH＋4－N和TKN含量均顯著高于其他樣品（p＜0.05），分別為58.4 mg／kg和0.72 g／kg，并隨土壤深度增加而減少。

圖1 土壤樣品理化參數(shù)

2.2 土壤樣品細(xì)菌多樣性

土壤樣品Alpha多樣性指數(shù)如表1所示。文庫(kù)覆蓋率均大于94%，說明取樣合理，樣本OTU覆蓋度已經(jīng)趨近飽和。GJ樣品OTU數(shù)目最少，最高值出現(xiàn)在FG－C。香農(nóng)指數(shù)最低值和辛普森指數(shù)最高值均出現(xiàn)在GJ，表明GJ樣品中細(xì)菌多樣性最低。根據(jù)香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)變化趨勢(shì)，可知細(xì)菌多樣性隨著土壤深度增加而增加。此外，基于OTU的樣本聚類樹分析（見圖2），不同樣本細(xì)菌群落可分為兩個(gè)大類，即GJ、FG－A和FG－B聚類，F(xiàn)G－C和FG－D聚類。

表1 土壤樣品Alpha多樣性指數(shù)

圖2 基于OTU的樣本聚類圖

2.3 土壤樣品細(xì)菌群落組成

基于門水平的微生物群落相對(duì)豐度前10的物種，繪制物種相對(duì)豐度柱狀圖（見圖3（a））。變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）在所有樣品中均為優(yōu)勢(shì)菌門。其中，變形菌門在GJ（38.79%）、FG－A（51.03%）和FG－B（40.58%）中豐度最高；酸桿菌門在FG－C（30.58%）和FG－D（31.65%）中豐度最高。相較于農(nóng)田土壤柱狀樣，小麥根際土壤樣品中放線菌門的豐度明顯高于土壤柱狀樣中放線菌門的豐度，而酸桿菌門則相反。此外，在柱狀樣中，變形菌門和擬桿菌門的豐度隨土壤深度增加而減少，而酸桿菌門則呈相反趨勢(shì)。

基于屬水平的微生物群落相對(duì)豐度前20的物種，繪制物種相對(duì)豐度柱狀圖（見圖3（b））。Gp6、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、Gp4、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是所有樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬。其中，節(jié)桿菌屬在GJ（19.21%）中豐度最高，芽單胞菌屬在FG－A（4.59%）中豐度最高，屬于酸桿菌門的Gp6在FG－B（5.21%）、FG－C（34.79%）和FG－D（37.53%）中豐度最高。相較于農(nóng)田土壤柱狀樣，小麥根際土壤樣品中節(jié)桿菌屬的豐度最高，而Gp6的豐度最低。此外，在柱狀樣中，Gp6的豐度隨土壤深度的增加而增加，而Gp4的豐度則隨土壤深度的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。

2.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析（見圖4），RDA1解釋總變異量的69.26%，RDA2解釋總變異量的26.38%，二者共同解釋了細(xì)菌群落變異量的95.64%，能夠較好地反映出微生物群落與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系。由圖4可知，樣品GJ、FG－C和FG－D細(xì)菌群落與pH呈正相關(guān)，且FG－C和FG－D聚類。FG－A、FG－B細(xì)菌群落與pH呈負(fù)相關(guān)，與TKN、TOC和NH＋4－N呈正相關(guān)。

圖4 細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的RDA分析

2.5 細(xì)菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

使用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析評(píng)估前150 OTUs的細(xì)菌相互作用（見圖5）。該網(wǎng)絡(luò)生成了98個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 527條邊，平均度為31.16，網(wǎng)絡(luò)直徑為9，模塊度為1.27，平均聚類系數(shù)為0.76，平均路徑長(zhǎng)度為3.67（見圖5（a））?；陲@著的斯皮爾曼相關(guān)性（ρ＞0.6，p＜0.05），總共預(yù)測(cè)了7個(gè)模塊（見圖5（b））。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小與連接程度成正比；邊的粗細(xì)與斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)成正比。綠色線表示顯著負(fù)相關(guān)，紅色線表示顯著正相關(guān)。節(jié)點(diǎn)越大，表明它與其他節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)越多，連線越寬，表明兩節(jié)點(diǎn)之間的相關(guān)性越強(qiáng)?；诖?，與其他10個(gè)以上節(jié)點(diǎn)有緊密聯(lián)系的OTU被定義為關(guān)鍵分類群，表明它們?cè)诿總€(gè)細(xì)菌群落的組成和功能方面均具有重要的作用（見圖5（b））。本研究中，Povalibacter、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Gp6、Gp4、Gaiella、Subtercola等節(jié)點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)主要模塊中最重要的基礎(chǔ)單元分類群，表明這些細(xì)菌為細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌并在其中起關(guān)鍵作用（見圖5（a））。

圖5 基于全部土壤樣本中前150個(gè)OTUs的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

樣品采集區(qū)域土壤為褐土，與其他類型土壤相比，褐土有機(jī)質(zhì)和全氮含量比較低。對(duì)于作物而言，褐土缺乏氮素營(yíng)養(yǎng)［12］，在作物播種前一般需對(duì)農(nóng)田施肥。本研究中5個(gè)土壤樣品pH值介于4.33～5.81，呈酸性。這主要是因?yàn)檗r(nóng)田土壤長(zhǎng)期施用氮肥，在氮肥轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的過程中，導(dǎo)致土壤中Ca、Mg等堿性離子流失，從而引起土壤pH降低［13］。理化性質(zhì)和空間分布能夠極大地影響細(xì)菌群落的組裝，從而導(dǎo)致細(xì)菌群落豐富度和多樣性的差異［14］。由RDA分析可知，F(xiàn)G－A在TKN、TOC、NH＋4－N上的投影距箭頭較近，表明FG－A中細(xì)菌群落對(duì)土壤中TKN、TOC、NH＋4－N的響應(yīng)較為敏感，而GJ在pH上的投影距箭頭較近，表明pH對(duì)GJ中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。

結(jié)果表明，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，這與Li等［15］和Chang等［16］對(duì)農(nóng)田的研究結(jié)果一致。不同于非根際土壤樣品，在小麥根際土壤中，變形菌門豐度最高，其次為放線菌門，與Fan等［17］的研究結(jié)果相似。此外，變形菌門在FG－A和FG－B中豐度最高。一般認(rèn)為變形菌和放線菌是富營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，對(duì)土壤中C、N循環(huán)有顯著的促進(jìn)作用［18］。植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)常表現(xiàn)出與非根際土壤之間的顯著差異，而本研究中基于OTU的樣本聚類結(jié)果顯示，GJ、FG－A和FG－B之間相互聚類，表明它們的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征相似，可能是因?yàn)樾←溤诙咎幱谛菝咂冢捣置谖镙^少，對(duì)根際細(xì)菌的影響有限［19］，且該時(shí)期小麥根系長(zhǎng)度約為10 cm，與FG－A和FG－B土壤樣品處于同一深度?？梢?，本研究中土壤深度是冬季農(nóng)田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因子。

隨著土壤深度的變化，土壤中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量也會(huì)發(fā)生改變［20］。本研究中，農(nóng)田土壤柱狀樣品中的變形菌門和酸桿菌門的相對(duì)豐度隨土壤深度增加呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化趨勢(shì)。酸桿菌門的相對(duì)豐度隨土壤深度增加逐漸增加，而變形菌門則相反。這是由于變形菌門大多由異養(yǎng)細(xì)菌構(gòu)成，適合在C、N含量豐富的環(huán)境中生存［21］，而酸桿菌門被認(rèn)為是寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，主要生存在營(yíng)養(yǎng)不良且有機(jī)碳濃度較低的酸性環(huán)境中［22］。本研究的土壤理化參數(shù)結(jié)果顯示，隨土壤深度的增加，NH＋4－N和TOC含量減少，故變形菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度隨土壤深度呈相反趨勢(shì)。

Griffiths等［23］對(duì)英國(guó)各地超過1 000個(gè)土壤剖面樣品中細(xì)菌群落的多尺度空間分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)pH值與酸桿菌門豐度呈反比，Rousk等［24］的研究也得出類似結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，酸桿菌門的豐度隨著pH值的增加而增加。土壤pH是影響酸桿菌豐度和多樣性的重要環(huán)境因子，但其他環(huán)境因素不可忽視。本研究中，pH值隨土壤深度的增加呈遞增趨勢(shì)，但NH＋4－N、TOC和TKN的含量則隨之降低，形成了相對(duì)寡營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境，為寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌酸桿菌門營(yíng)造了適宜的生存環(huán)境。Barns等［25］研究發(fā)現(xiàn)，大量酸桿菌門亞群在低pH環(huán)境中不適宜生存，也會(huì)導(dǎo)致酸桿菌門總豐度減少，Jones等［26］的研究結(jié)果也證實(shí)了該發(fā)現(xiàn)。在屬水平上，節(jié)桿菌屬是GJ的主要優(yōu)勢(shì)菌屬。節(jié)桿菌被認(rèn)為是專性好氧菌，植物根系的泌氧作用促進(jìn)了節(jié)桿菌在小麥根際土壤中的富集。另一方面，隸屬于酸桿菌門的亞群Gp6、Gp4和Gp1的相對(duì)豐度隨pH值呈現(xiàn)出不同趨勢(shì)，其中Gp6和Gp4的相對(duì)豐度隨pH值呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，而Gp1相對(duì)豐度隨pH值呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，這與Turlapati等［27］對(duì)30個(gè)土壤樣品中的酸桿菌亞群的研究結(jié)果相似。

共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析揭示了細(xì)菌之間的相互作用，能夠?qū)?xì)菌結(jié)構(gòu)和組裝模式進(jìn)行全面的了解。其中，高度相關(guān)的基礎(chǔ)單元分類群對(duì)細(xì)菌群落的功能起著關(guān)鍵作用［28］。本研究表明，在具有緊密聯(lián)系的不同微小生境中，細(xì)菌組成以及細(xì)菌間的相互作用均具有獨(dú)特性。例如，在Module 1中存在大量的變形菌門和少量的酸桿菌門和放線菌門細(xì)菌，其中伯克霍爾德菌屬（Burkholderia），戴氏菌屬（Dyella），馬賽菌屬（Massilia）在Module 1中起著關(guān)鍵作用。伯克霍爾德菌屬因其具有生物防治效果并且能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)而被大量報(bào)道［29］。戴氏菌屬為兼性厭氧細(xì)菌，能夠?qū)⑾跛猁}還原成亞硝酸鹽，促進(jìn)反硝化進(jìn)程［30］。馬賽菌屬?gòu)V泛存在于植物根際環(huán)境中，能夠增強(qiáng)植物抗逆性，還具有降解多環(huán)芳烴的功能［31］。在Module 2中，酸桿菌門占據(jù)較高的豐度，特別是Gp6和Gp4兩個(gè)亞群，Navarrete等［32］的研究也得出類似的結(jié)論。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在Module 1與Module 2交界處存在大量的顯著負(fù)相關(guān)，而這兩個(gè)Module內(nèi)部則存在大量的顯著正相關(guān)，表明Module 1與Module 2之間可能存在著競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，而在各自內(nèi)部各節(jié)點(diǎn)之間存在緊密的合作關(guān)系。

4 結(jié)論

（1）對(duì)農(nóng)田不同深度土壤（0≤FG－A≤5 cm、5＜FG－B≤10 cm、10＜FG－C≤15 cm、15＜FG－D≤20 cm）及小麥根際土壤（GJ）的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。在門水平上，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門；在屬水平上，節(jié)桿菌屬在小麥根際土壤中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，Gp6則在柱狀土壤中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

（2）酸桿菌門相對(duì)豐度隨土壤pH值的增加而增加。RDA分析結(jié)果表明，TKN、TOC、NH＋4－N和pH是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征差異的關(guān)鍵環(huán)境因子。此外，基于OTU的樣本聚類樹分析，表明GJ、FG－A和FG－B相互聚類。

（3）共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析表明，不同模塊的細(xì)菌組成以及細(xì)菌間的相互作用均有所差異。Module 1和Module 2內(nèi)部各節(jié)點(diǎn)之間存在大量合作關(guān)系，但Module 1與Module 2之間處于競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)。