運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊宰后肌肉能量代謝的影響

陳聰慧,段春輝,楊欣雨,夏 翠,郭云霞,紀(jì)守坤,嚴(yán) 慧,劉月琴,張英杰

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 保定 071000)

動(dòng)物在流動(dòng)、轉(zhuǎn)群、屠宰過程中不可避免要經(jīng)歷運(yùn)輸應(yīng)激[1],運(yùn)輸應(yīng)激是多種應(yīng)激原共同作用的結(jié)果,包括運(yùn)輸前抓捕、裝車,運(yùn)輸過程中溫濕度和環(huán)境變化等。研究表明,運(yùn)輸應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物呼吸急促、心跳加速、驚懼不安,隨著機(jī)體水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量流失,內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、免疫功能下降,易引起各種呼吸性及消化性疾病,不同程度地影響畜禽的生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。因此,探索運(yùn)輸應(yīng)激影響動(dòng)物健康及代謝的機(jī)制,對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激的緩解及防治具有重要的生產(chǎn)意義。動(dòng)物在運(yùn)輸過程中為了適應(yīng)應(yīng)激帶來的不利影響,機(jī)體能量代謝加強(qiáng),無氧糖酵解及脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)加劇[4]。機(jī)體維持能量動(dòng)態(tài)平衡的同時(shí)積累了大量代謝產(chǎn)物,肌肉中乳酸的累積使肉品質(zhì)劣化[5]。研究表明,腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)在畜禽宰后肌肉糖酵解過程中起重要調(diào)節(jié)作用[6]。AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子,也是影響肌肉纖維類型轉(zhuǎn)化的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,可調(diào)節(jié)細(xì)胞能量水平[7]。AMPK可通過調(diào)節(jié)肌肉中的乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)/丙二酰輔酶A肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyl transferase 1, CPT)途徑,影響脂肪酸代謝[8]。因運(yùn)輸而引發(fā)的應(yīng)激性疾病嚴(yán)重?fù)p害了羊肉品質(zhì)及養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益,運(yùn)輸應(yīng)激已變成養(yǎng)羊業(yè)迅速發(fā)展過程中迫切需要解決的生產(chǎn)問題。揭示運(yùn)輸應(yīng)激影響糖酵解的機(jī)制是減緩應(yīng)激、改善肉質(zhì)、提高動(dòng)物福利和經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵,目前關(guān)于羊的運(yùn)輸應(yīng)激機(jī)制研究較少。本試驗(yàn)擬研究運(yùn)輸后羔羊肌肉糖酵解及能量代謝水平的變化規(guī)律及不同干預(yù)方式對(duì)能量代謝的影響,為緩解羔羊運(yùn)輸應(yīng)激、改善羊肉品質(zhì)、提高動(dòng)物福利提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及管理

本試驗(yàn)于2021年6月1日—2021年6月30日在張家口蘭海畜牧養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)前對(duì)圈舍、飼養(yǎng)工具等進(jìn)行徹底消毒。選用體況良好、健康無病、4月齡、平均體重為(19.06±0.76) kg的湖羊公羔60只,所有試驗(yàn)羊均在同一棟舍內(nèi)。由羊場(chǎng)提供基礎(chǔ)飼糧,每日7:00和17:00飼喂2次,保證每日所有羔羊的料槽中均有剩料,飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 全混合日糧(Total Mixed Rations; TMR)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 TMR diet composition and nutrient levels(DM basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

60只羔羊隨機(jī)分為3組,每組20只,每組5個(gè)重復(fù),運(yùn)輸當(dāng)天記為試驗(yàn)第0天,在第0、7、14天每組每個(gè)重復(fù)中任選1只羔羊,每組共5只進(jìn)行屠宰。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,電解多維組于運(yùn)輸前2 d至運(yùn)輸后7 d在飼糧中給每只羔羊添加電解多維375 mg·d-1,新霉素組于第0～7天在飼糧中給每只羔羊添加200 mg·d-1新霉素進(jìn)行治療。飼喂前先將電解多維粉和新霉素粉充分混合少量飼糧后,確保添加物被每只羔羊完全攝入,再自由采食基礎(chǔ)飼糧。各組羔羊分群飼養(yǎng)。電解多維主要成分及含量見表2。

試驗(yàn)羔羊于2021年6月8日09:00—17:00經(jīng)歷8 h運(yùn)輸:采用三層半掛車裝載,車廂長(zhǎng)13 m,寬2.55 m,高4 m,車廂內(nèi)無間隔,沒有進(jìn)行栓系等任何措施。運(yùn)輸距離約為350 km,運(yùn)輸途中禁食禁水,運(yùn)輸結(jié)束回圈舍12 h內(nèi)僅提供飲水。

運(yùn)輸后第0、7、14天每重復(fù)分別隨機(jī)挑選1只羔羊(每處理組5只)屠宰,宰前24 h禁食,2 h禁水。取右胴體背最長(zhǎng)肌置于凍存管并標(biāo)注,置于-80 ℃貯存。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 糖酵解潛力(glycolysis potential; GP) 準(zhǔn)確稱取肌肉組織并按重量(g)∶體積(mL)=1∶10比例加入預(yù)冷的生理鹽水,高速研磨后置于離心管中,2500 r·min-1,離心10 min,取上清液并用生理鹽水5倍稀釋。

采用酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)肌肉中AMPK活性。根據(jù)Monin和Sellier[9]的方法,測(cè)定肉中糖原、游離葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate, G-6-P)及乳酸(lactic acid, LA)的含量,按如下公式計(jì)算肌肉GP:

糖酵解潛力(μmol·g-1)=2×[糖原含量(μmol·g-1)+游離葡萄糖含量(μmol·g-1)+G-6-P含量(μmol·g-1)]+LA含量(μmol·g-1)。

1.3.2 糖酵解酶活測(cè)定 肌酸激酶(creatine kinase, CK)、己糖激酶(hexokinase, HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)采用生化方法檢測(cè),試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 基因及蛋白表達(dá)

1.3.3.1 引物設(shè)計(jì):以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因,參照GenBank中肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)、AMPKα1、AMPKα2、脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)、CPT-1、ACC、GAPDH基因的mRNA序列,運(yùn)用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物送至北京六合華大基因科技有限公司合成,見表3。

表3 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列Table 3 Nucleotide sequences of specific primers for real-time quantitative PCR analysis

1.3.3.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:TRIzol法提取肌肉中總RNA。超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。依據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,程序設(shè)置:25 ℃ 5 min;42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 s。

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT q-PCR):用熒光定量PCR儀(ABIStep One PlusTM),GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,每個(gè)樣本分別用待檢測(cè)基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增,3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt計(jì)算法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,計(jì)算方法如公式所示:

ΔΔCt=ΔCt(試驗(yàn)樣品)-ΔCt(基準(zhǔn)樣品);

ΔCt(試驗(yàn)樣品)=Ct(試驗(yàn)樣品,目的基因)-Ct(試驗(yàn)樣品,內(nèi)參基因);

ΔCt(基準(zhǔn)樣品)=Ct(基準(zhǔn)樣品,目的基因)-Ct(基準(zhǔn)樣品,內(nèi)參基因)。

1.3.3.4 Western blot:提取肌肉組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳,凝膠電泳結(jié)束后,從凝膠分離的蛋白質(zhì)帶分別用非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育和檢測(cè)。利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光拍照,AlphaEaseFC軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行灰度分析,結(jié)果以目的蛋白與GAPDH灰度值比值顯示。Western blot所用抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件中單因素ANOVA分析同時(shí)間不同處理、同處理不同時(shí)間各指標(biāo)的變化差異,Duncan’s法進(jìn)行多重比較。一般線性模型(GLM)分析處理及時(shí)間的影響。Western blot條帶結(jié)果利用AlphaEaseFC軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行灰度分析,結(jié)果以目的蛋白與GAPDH灰度值比值顯示,隨后用SPSS 23.0進(jìn)行雙因素分析。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌糖酵解潛力及AMPK活性的影響

由表4可知,處理極顯著影響了羔羊肌肉糖原水平(P<0.01),第14天新霉素組糖原水平顯著高于其他兩組(P<0.05)。處理對(duì)LA、G-6-P、游離葡萄糖、GP、AMPK活性均無顯著影響(P>0.05)。時(shí)間極顯著影響了羔羊肌肉糖原和游離葡萄糖水平(P<0.01),肌肉糖原在運(yùn)輸后呈上升趨勢(shì),對(duì)照組和電解多維組在第7天最高,新霉素組第14天最高;游離葡萄糖在0～14 d先升高后降低,在第7天最高。時(shí)間對(duì)LA、G-6-P、GP、AMPK活性無顯著影響(P>0.05)。處理×?xí)r間交互作用對(duì)羔羊肌肉糖酵解潛力及AMPK活性無顯著影響(P>0.05)。

表4 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊肌肉糖酵解潛力及AMPK活性的影響Table 4 Effects of different treatments of transportation stress on glycolysis potential and AMPK activity of lamb muscle

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌糖酵解相關(guān)酶活性的影響

由表5可知,處理及處理×?xí)r間對(duì)羔羊肌肉糖酵解相關(guān)酶活性無顯著影響(P>0.05)。時(shí)間極顯著地影響了羔羊肌肉HK及LDH活性(P<0.01),各組肌肉HK活性在運(yùn)輸后0～14天內(nèi)先升高后降低,第7天最高;肌肉LDH活性在運(yùn)輸后呈上升趨勢(shì),對(duì)照組和新霉素組在第7天最高,電解多維組第14天最高。時(shí)間對(duì)CK、PK活性無顯著影響(P>0.05)。

表5 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊肌肉糖酵解相關(guān)酶活性的影響Table 5 Effects of different treatments of transportation stress on glycolysis-related enzyme activities in lamb muscle

2.3 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌LKB1、AMPKα1、AMPKα2基因表達(dá)量的影響

由表6可知,處理顯著影響了LKB1的基因表達(dá)量(P<0.05),第7天新霉素組LKB1基因量顯著高于電解多維組(P<0.05);處理對(duì)羔羊肌肉AMPKα1、AMPKα2基因表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。時(shí)間極顯著地影響了AMPKα1、AMPKα2、LKB1表達(dá)量(P<0.01);各組AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因表達(dá)量在0～14 天內(nèi)均呈下降趨勢(shì)。處理及時(shí)間交互對(duì)AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。

表6 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊LKB1、AMPKα1、AMPKα2基因表達(dá)量的影響Table 6 Effects of different treatments oftransportation stress on gene expression of LKB1, AMPKα1 and AMPKα2 in lambs

2.4 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌FAS、CPT-1、ACC基因表達(dá)量的影響

由表7可知,處理及處理×?xí)r間對(duì)羔羊肌肉FAS、CPT-1、ACC基因表達(dá)均無顯著影響(P>0.05)。時(shí)間極顯著地影響了CPT-1基因表達(dá)量(P<0.01),顯著影響了ACC基因表達(dá)量(P<0.05),各組CPT-1及ACC在運(yùn)輸后7、14 d基因表達(dá)量均高于第0天;時(shí)間對(duì)羔羊肌肉FAS基因表達(dá)無顯著影響(P>0.05)。

表7 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊FAS、CPT-1、ACC基因表達(dá)量的影響Table 7 Effects of different treatments of transportation stress on gene expression of FAS, CPT-1 and ACC in lambs

2.5 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白表達(dá)量的影響

由表8可知,處理及處理×?xí)r間交互作用對(duì)羔羊肌肉AMPKα1、AMPKα2、LKB1蛋白表達(dá)均無顯著影響(P>0.05)。時(shí)間顯著地影響了LKB1蛋白表達(dá)量(P<0.05)。處理有影響AMPKα1的趨勢(shì)(P<0.10)。各組AMPKα1、AMPKα2、LKB1蛋白表達(dá)量在0～14天內(nèi)均呈下降趨勢(shì),與基因表達(dá)基本一致。Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

從左至右依次為第0天對(duì)照組、電解多維組、新霉素組;第7天對(duì)照組、電解多維組、新霉素組;第14天對(duì)照組、電解多維組、新霉素組From left to right in turn, there were 0 d control group, multivitamin electrolysis group and neomycin group; Control group, multivitamin electrolysis group and neomycin group on the 7th day; Control group, multivitamin electrolysis group and neomycin group on 14th day圖1 Western blot檢測(cè)LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression levels of LKB1, AMPKα1, and AMPKα2 analyzed by Western blot

表8 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白表達(dá)量的影響Table 8 Effects of different treatments of transportation on stress proteins expression of LKB1, AMPKα1 and AMPKα2 in lambs

3 討 論

3.1 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌糖酵解潛力及AMPK活性的影響

屠宰后氧氣供應(yīng)中斷,肌肉中葡萄糖與糖原代謝方式從有氧轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧糖酵解[5]。運(yùn)輸應(yīng)激會(huì)使肌糖原無氧糖酵解加劇,肌肉中LA持續(xù)積累,pH下降,導(dǎo)致肉品質(zhì)劣化[10]。GP是動(dòng)物肌肉中糖酵解產(chǎn)生乳酸的底物總量:GP=2×(糖原含量+游離葡萄糖含量+G-6-P含量)+LA含量[9]。畜禽宰后糖原耗盡時(shí)糖酵解停止,AMPK活性不再升高,糖原及LA決定了GP[9]。研究發(fā)現(xiàn),肌糖原含量占pH24 h變化結(jié)果的40%～60%[11],GP顯著影響了肌肉pH與肉色[12]。此外,低GP導(dǎo)致干硬DFD(dark,firm and dry,DFD)牛肉發(fā)生率顯著提高,口感變差[13]。Cheng等[14]研究表明,維生素C對(duì)應(yīng)激動(dòng)物機(jī)體內(nèi)細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用。電解多維能夠改善因應(yīng)激引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境變化,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),增強(qiáng)機(jī)體抗病力,緩解應(yīng)激。新霉素口服后可以透過受損的消化道黏膜,進(jìn)入機(jī)體內(nèi)循環(huán)輸送到肝、腎、心、肺和腹腔等組織器官,有效減少疾病的發(fā)生并治療[15]。張挺[16]研究發(fā)現(xiàn),抗菌成分的添加使應(yīng)激小鼠糖原顯著提高,對(duì)其LA、GP水平無顯著影響。本研究運(yùn)輸前后應(yīng)用電解多維、運(yùn)輸后用新霉素使羔羊糖原水平提高,但對(duì)其GP沒有顯著影響,說明電解多維和新霉素可能對(duì)調(diào)節(jié)羔羊肌肉糖酵解速率有作用。電解多維組屠宰后LA含量高于對(duì)照組,而新霉素組低于對(duì)照組,說明電解多維及新霉素會(huì)影響機(jī)體糖酵解進(jìn)程,第7、14天電解多維組羔羊使機(jī)體無氧糖酵解過程加快,而運(yùn)輸后新霉素治療可能減緩了無氧糖酵解進(jìn)程。AMPK活性變化既反映機(jī)體正常能量代謝情況,也反映細(xì)胞應(yīng)激情況。AMPK可通過調(diào)節(jié)機(jī)體物質(zhì)代謝以維持細(xì)胞能量、調(diào)節(jié)機(jī)體的產(chǎn)能和耗能[17],通常在營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧、劇烈運(yùn)動(dòng)等狀況下被激活。研究表明,AMPK激活降低了畜禽肉色穩(wěn)定性、系水力、剪切力等品質(zhì)[18]。本試驗(yàn)中,隨著羔羊應(yīng)激后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),運(yùn)輸前后用電解多維及運(yùn)輸后用新霉素均未顯著影響AMPK活性,AMPK處于活化狀態(tài)。

3.2 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌糖酵解相關(guān)酶活性的影響

宰后糖酵解代謝速率直接影響pH的下降程度和速率,而糖酵解速率與控制其糖酵解的限速酶HK、PK和LDH等有關(guān)[19]。CK是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下調(diào)節(jié)能量代謝的重要靶點(diǎn)[20],存在于動(dòng)物肌肉、心與腦等組織的線粒體和細(xì)胞漿中。維生素A、C和E可清除自由基緩解機(jī)體氧化應(yīng)激,保護(hù)機(jī)體細(xì)胞膜免受損害[21]。本試驗(yàn)中,電解多維及新霉素對(duì)肌肉CK活性無影響,運(yùn)輸后14 d內(nèi)各組肌肉CK活性也無顯著變化,而在之前的研究中,運(yùn)輸后14 d內(nèi)各組羔羊血清CK活性均上升,且電解多維組及新霉素組血清CK含量均低于對(duì)照組,運(yùn)輸應(yīng)激使血清CK持續(xù)性升高,說明血清CK更能反映機(jī)體應(yīng)激情況[22-23]。HK是糖酵解途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵酶,可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為G-6-P,促進(jìn)糖酵解的發(fā)生并有效補(bǔ)充細(xì)胞ATP能量[24]。PK和LDH作為糖酵解途徑的關(guān)鍵末端酶,厭氧條件下分別將磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸、丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸[25]。LDH主要存在于心肌、肝、腎、骨骼肌或肺等動(dòng)物組織中,其升高說明骨骼肌損傷或疲勞、存在肝炎等疾病[26]。肌肉LA的積累取決于細(xì)胞膜酶LDH和線粒體之間對(duì)來自糖酵解的丙酮酸的競(jìng)爭(zhēng)[27]。Zhang等[28]研究表明,3 h的運(yùn)輸應(yīng)激后肉雞肌肉中HK、PK、LDH均顯著上升,表明肌肉ATP的耗竭可能通過激活HK活性觸發(fā)糖酵解機(jī)制,隨后PK和LDH的活性增加,代謝物磷酸烯醇-丙酮酸和丙酮酸累積。本試驗(yàn)中處理有影響PK的趨勢(shì),電解多維組PK活性最低。本研究中,各組羔羊肌肉HK活性在運(yùn)輸后第0～14天先升高后降低,第7天最高;運(yùn)輸后第0、7、14天,三組間PK均無顯著變化,電解多維及新霉素治療對(duì)PK活性沒有明顯的調(diào)控作用,說明羔羊應(yīng)激的糖酵解機(jī)制調(diào)節(jié)和肉雞一樣可能更依賴于HK,較高的HK活性可能代表著較高的糖酵解速率。運(yùn)輸后第0天,電解多維組肌肉LDH顯著高于對(duì)照組和新霉素組,其可能的原因是電解多維的預(yù)防性添加有助于保護(hù)細(xì)胞膜完整性,防止肌細(xì)胞損傷。對(duì)照組及新霉素組第0天LDH顯著低于第7、14天,說明運(yùn)輸應(yīng)激使肌肉損傷或疲勞,LDH大量釋放,隨著運(yùn)輸后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸修復(fù)。

3.3 運(yùn)輸應(yīng)激不同干預(yù)方式對(duì)羔羊背最長(zhǎng)肌相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

AMPK是異源三聚體酶,在感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)能量平衡和調(diào)控肌肉糖酵解方面發(fā)揮著重要作用[29]。AMPK可通過兩種信號(hào)激活:肝激酶B1(LKB1)介導(dǎo)和鈣調(diào)素依賴蛋白激酶介導(dǎo)[30]。在應(yīng)激情況下,LKB1是引起AMPK活化的主要原因,尤其是在肌肉組織中。而鈣調(diào)素依賴蛋白激酶激活A(yù)MPK主要與肝細(xì)胞中磷酸和鈣、氫陽離子濃度增加密切相關(guān),與肌細(xì)胞能量代謝相關(guān)性較小[31]。本試驗(yàn)中,處理顯著影響了LKB1基因表達(dá)量,電解多維抑制了LKB1基因及蛋白表達(dá),應(yīng)激緩解效果最好。Hu等[32]研究表明,饑餓應(yīng)激使雞PM[33](快速糖酵解肌肉)的AMPKα2基因表達(dá)量顯著降低。Zhang等[28]研究表明,宰前運(yùn)輸應(yīng)激顯著增加了雞胸大肌LKB1和AMPKα2基因水平,對(duì)AMPKα1表達(dá)無顯著影響,應(yīng)激通過上調(diào)LKB1和AMPKα2表達(dá)激活A(yù)MPK。本研究中,隨著運(yùn)輸后飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組羔羊肌肉AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因及蛋白表達(dá)量均逐漸下降,機(jī)體應(yīng)激逐漸緩解;運(yùn)輸后14 d內(nèi)新霉素組AMPKα1、AMPKα2、LKB1基因及蛋白表達(dá)量持續(xù)高于電解多維組及對(duì)照組,在第7天停止用藥后AMPK途徑基因表達(dá)量仍處于較高水平,新霉素治療可能并未有效抑制AMPK途徑的激活。

低能量條件下AMPK可以磷酸化特異性的酶和位點(diǎn),增加ATP生成,降低ATP消耗。研究表明,AMPK可通過促進(jìn)大分子分解補(bǔ)充機(jī)體能量,并能保持脂肪代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)[34]。AMPK途徑的激活可通過磷?；疉CC調(diào)節(jié)脂肪酸代謝,減少機(jī)體丙二酰輔酶A含量,促進(jìn)CPT-1蛋白活化,加速脂肪酸氧化。FAS是機(jī)體碳水化合物合成代謝轉(zhuǎn)化為脂肪酸的關(guān)鍵酶,可催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A形成長(zhǎng)鏈脂肪酸[35]。本研究中,運(yùn)輸應(yīng)激后隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),羔羊肌肉FAS表達(dá)量無變化,運(yùn)輸后14 d脂肪合成情況未受影響。在脂肪酸的代謝途徑中,ACC是丙二酰輔酶A合成的關(guān)鍵限速酶。丙二酰輔酶A又是脂肪酸關(guān)鍵合成前體物,也是CPT-1進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化的高效抑制物質(zhì)。ACC失活,CPT-1的抑制減少,糖原和脂肪酸合成減少,脂肪酸氧化增加,釋放大量能量[36]。Désert等[37]研究表明,饑餓應(yīng)激抑制了肉雞肝組織中的脂肪酸合成并促進(jìn)了脂肪酸β氧化。本研究中,運(yùn)輸后第0天電解多維組CPT-1表達(dá)量顯著高于其余兩組,電解多維的補(bǔ)充一定程度上可間接為機(jī)體供能。Hu等[32]研究表明,禁食24 h組ACC水平低于自由采食組,禁食24 h后補(bǔ)飼24 h組肉雞ACC水平高于自由采食組及禁食24 h組,應(yīng)激顯著下調(diào)了ACC基因表達(dá),誘導(dǎo)了骨骼肌中脂肪酸生物合成的抑制,再補(bǔ)飼ACC表達(dá)逐漸上升。與本研究結(jié)果一致,運(yùn)輸后ACC和CPT-1表達(dá)量上升,表明脂肪酸氧化仍在加劇進(jìn)行,持續(xù)為機(jī)體補(bǔ)充能量。

4 結(jié) 論

綜上所述,羔羊運(yùn)輸前、后添加電解多維可改善肌肉能量代謝狀態(tài),抑制運(yùn)輸誘導(dǎo)的AMPK途徑激活。