基于小鼠骨骼肌損傷模型分析丹參素對骨骼肌損傷后修復(fù)再生的促進作用

薛霖莉,孫 睿,郝曉靜,曹校瑞,王海東,盧嘉茵*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部,晉中 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,晉中 030801)

全身骨骼肌占機體體重的40%左右,身體任何一個姿勢都由一系列的肌群協(xié)調(diào)完成,它們是運動系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]。骨骼肌損傷為外科常見病,多發(fā)于負重、不當運動、交通事故以及自然災(zāi)害中,是日常生活中的常見損傷[3]。雖然骨骼肌有一定自愈能力,但通常過程緩慢,且愈合不完全,容易形成瘢痕組織,引發(fā)二次損傷[4]。其發(fā)病率高、預(yù)后不良,會嚴重影響人和動物的正常生活和生長[5]。因此,促進肌肉損傷后的修復(fù)進程和提高其修復(fù)質(zhì)量具有重要的理論與實踐意義。

骨骼肌損傷后再生修復(fù)是極其復(fù)雜的過程,起初表現(xiàn)為肌纖維壞死斷裂,肌組織出血、水腫、炎癥細胞浸潤,刺激機體啟動修復(fù)[6],隨后肌衛(wèi)星細胞(muscle satellite cells,MSCs)被激活,表達生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs),如MyoD(Myogenic differentiation 1)、Myf-5(myogenic factor 5)等,大量增殖為成肌細胞,最終分化、融合為肌纖維[7]。肌肉再生的同時會合成肌動蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)等重要的功能蛋白。再生纖維的特點是橫截面積小,且有中間核[2]。此后,再生骨骼肌成熟,成纖維細胞及膠原纖維出現(xiàn),后期彈性纖維出現(xiàn),形成瘢痕組織[8-9]。因此,受損肌肉再生以及瘢痕組織形成趨于平衡才能保證最終的愈合質(zhì)量。

目前,治療骨骼肌損傷的方式繁多,包括傳統(tǒng)的冰敷[10]、針灸[11]、推拿[12],以及抗炎西藥[13]、射頻熱凝[14]、手術(shù)治療[15]等,這些方法盡管可以影響修復(fù)過程,但是大多價格昂貴,療效參差不齊,伴隨副作用且不能完全改善癥狀。中醫(yī)學(xué)認為筋絡(luò)破損,脈絡(luò)受阻,血瘀氣滯是創(chuàng)傷部位的基本病理變化,可以通過促進血液循環(huán),消除瘀血,補充氣血進行治療[16]。近年來,由于人們健康意識的提高以及對部分抗生素的管控,中草藥因其天然高效、毒副作用小而受到歡迎,越來越多的人利用中草藥治療骨骼肌損傷[17-18]。目前,犬、貓運動造成的損傷在寵物醫(yī)療方面也有中醫(yī)療法的介入,包括骨骼肌的損傷等。

有研究表明,丹參能夠有效地促進MyHC Ⅱb(myosin, heavy polypeptide 4)表達[19],降低Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)表達[20]。并且可以加快肌肉力量恢復(fù)的速度,縮短傷口愈合時間[21],改善受損肌肉的生物力學(xué)指標,從而最終提高愈合質(zhì)量。丹參注射液也可減輕創(chuàng)面炎癥,促進傷口愈合[22]。還可減輕線粒體損傷,抑制炎性因子釋放,加快病灶清除,促進損傷細胞修復(fù)[23]。丹參素(Danshensu,DSS)是運用現(xiàn)代先進生產(chǎn)工藝從傳統(tǒng)中藥丹參中分離提純的一種高純度芳香酸類化合物,是丹參水溶性成分中的主要藥效成分之一,也是目前研究最熱的丹參單體成分之一[24]。丹參素在體內(nèi)可被快速吸收,且消除速率比較慢,在臨床上主要用于心血管疾病,并且療效顯著[25]。研究證明,丹參素具有減少血小板粘附和聚集以及清除自由基、抗炎、抗纖維化等作用[26-27]。關(guān)于丹參素能否促進骨骼肌再生,目前沒有報道。

本研究建立小鼠骨骼肌損傷模型,并使用丹參素進行治療,通過對組織形態(tài)學(xué)以及促進骨骼肌修復(fù)、再生和抑制纖維化的相關(guān)因子分析,探討丹參素對骨骼肌損傷后修復(fù)的影響,為丹參素這種中藥單體改善肌肉修復(fù)速度和質(zhì)量的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),這也將為治療犬、貓和賽馬在運動過程中造成的損傷提供藥物治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理

清潔級6周齡C57BL/6雄性健康小鼠購于山西省人民醫(yī)院實驗動物中心。按要求分籠飼養(yǎng),自由采食飲水,光照周期為白天黑夜交替,12 h:12 h。試驗過程中嚴格按照動物倫理規(guī)范執(zhí)行。

隨機選取體重相近的21只小鼠分為損傷對照組(9只,每組3只),損傷治療組(9只,每組3只),空白對照組(3只)。氯化鋇試劑購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,分子式為 BaCl2·2H2O,純度≥99.5%。小鼠骨骼肌損傷模型的建立參考文獻[28],給予小鼠0.05 mg·kg-1丁丙諾啡,異氟醚麻醉小鼠,將無菌 1.2% BaCl2溶液以劑量為3.2 mL·kg-1注入小鼠腓腸肌 (gastrocnemius, GAS)。將小鼠放回到籠中,直至可以移動為止,6～8 h后給小鼠0.025 mg·kg-1丁丙諾啡。損傷2 h后治療組進行丹參素注射治療(大連美侖生物技術(shù)有限公司,純度≥95%,批號:J0509A,劑量為30 mg·kg-1,丹參素用生理鹽水進行溶解),連續(xù)注射3、5和7 d,損傷對照組與空白對照組進行生理鹽水注射,分別在連續(xù)治療3、5和7 d后分離損傷組與治療組的腓腸肌,制作石蠟切片,提取總蛋白和RNA備用。

1.2 EB(伊文思藍,Evans blue)染色

取材前 20～24 h,試驗組小鼠腹腔注射 0.5% EB染料0.005 mL·g-1,每組 3 只小鼠,注射后,動物放回籠中,隨意進食和飲水,之后采用頸脫法處死小鼠,取腓腸肌組織進行觀察,并拍照。

1.3 石蠟切片制備和染色

石蠟切片制備:將取得的腓腸肌組織進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片與貼片。

HE (蘇木精-伊紅)染色:將切片置于染缸內(nèi)進行脫蠟、復(fù)水后,蘇木精染色2 min,伊紅染色2 s,梯度酒精脫水,中性樹膠封片觀察。

Masson染色:將切片置于染缸內(nèi)進行脫蠟、復(fù)水、溫?zé)崴春?使用核染液染色60 s,漿染液染色40 s,黃色分色液分色8 min,直至觀察到膠原纖維部分褪成淡粉紅色,棄去分色液,藍色復(fù)染液染色5 min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察。

1.4 RNA提取和qRT-PCR(quantitative real-time PCR)

Trizol法提取樣品總RNA,測定其濃度后反轉(zhuǎn)錄。在NCBI上檢索小鼠MyoD、MyoG(myogenin)、MSTN(myostatin)、Pax7(paired box 7)、IL-6(interleukin 6)、IL-10(interleukin 10)、PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor gamma)、F4/80(adhesion G protein-coupled receptor E1,ADGRE1/ F4/80)、Collagen Ⅰ(collagen, type I alpha 1)、α-SMA(actin alpha 2, smooth muscle, aorta)和β-actin序列,利用Premier 5.0軟件設(shè)計PCR擴增引物,送北京華大基因公司合成。引物序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

按照SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒說明書進行QRT-PCR,通過2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達量變化。

1.5 蛋白提取和Western blot

1.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 丹參素促進肌肉損傷后修復(fù)再生

EB染料的積累可以識別肌纖維的損傷情況。結(jié)果顯示,損傷組與治療組肌纖維均于第1天就受到一定的損傷。第3天顏色最深、損傷最嚴重,隨后顏色慢慢變淺,損傷組自愈直至第9天,顏色也較對照組深。丹參素治療組,治療初期EB積累與損傷組無差別,從第5天開始,與損傷組相比,治療組明顯對EB攝取量更少,治療后第9天EB攝取量與空白對照組相近(圖1A)。

A.損傷組及治療組腓腸肌的EB染色;B. 損傷組及治療組腓腸肌的HE染色,標尺為100 μm;C. α-Actinin的蛋白相對表達水平;D. eMyHC的蛋白相對表達水平。*. P<0.05;**. P<0.01;. 損傷組;. 治療組A. EB staining of GAS in injure and treatment group; B. HE staining of GAS in injure and treatment group, Bar=100 μm; C. Relative expression levels of α-Actinin protein; D. Relative expression levels of eMyHC protein. *.P<0.05; **.P<0.01; .Injure;.Treatment圖1 丹參素促進肌肉損傷后修復(fù)再生Fig.1 Danshensu promotes repair and regeneration after muscle injury

HE染色結(jié)果顯示,治療組在第3天時,已有少數(shù)再生肌纖維,且肌纖維溶解不明顯,炎性細胞浸潤相較損傷組顯著減少。第5天時,治療組較損傷組細胞再生更多,且再生細胞排列更緊密,炎性細胞較少。當?shù)?天損傷組肌纖維大量再生時,治療組大部分細胞核已遷移至胞膜邊界,只能觀察到極少數(shù)炎性細胞與再生肌纖維,且新生肌纖維直徑大于損傷組,已基本完成損傷后修復(fù)再生(圖1B)。

以上兩種染色結(jié)果顯示,BaCl2注射導(dǎo)致肌肉受損,通過丹參素治療,受損肌肉修復(fù)更快、效果更理想。骨骼肌損傷后修復(fù)過程伴隨肌纖維的再生,Western blot結(jié)果顯示,治療后第5天輔肌動蛋白(α-actinin)含量明顯高于損傷組(圖1C),說明注射丹參素可以使細胞黏附作用更強,有利于損傷后細胞快速修復(fù),使得再生時細胞形態(tài)更整齊、細胞之間更緊密。觀察發(fā)現(xiàn),治療組的再生肌纖維標志物eMyHC蛋白表達在第5天時迅速上升(圖1D),與損傷組相比有顯著增加,與α-Actinin趨勢保持一致。因此,丹參素治療使肌肉再生更加迅速,并且第5天時修復(fù)效果顯著。

2.2 丹參素影響損傷后肌肉再生相關(guān)因子的表達

骨骼肌損傷后修復(fù)過程伴隨成肌分化與肌纖維的成熟,試驗進一步檢測了肌肉再生相關(guān)因子的表達。Western blot結(jié)果顯示,第5天時,丹參素治療后,治療組生肌決定因子MyoD、肌細胞分化標志物MyoG以及肌衛(wèi)星細胞標志物Pax7的蛋白表達水平與損傷組相比,表達量顯著增高(圖2A、B、D),治療組MSTN的表達明顯低于損傷組(圖2C)。這表明丹參素促進肌衛(wèi)星細胞增殖和分化,成肌相關(guān)蛋白在第5天達到峰值,丹參素加快受損肌肉修復(fù)再生進程。

A. MyoD的蛋白相對表達水平;B. MyoG的蛋白相對表達水平;C. MSTN的蛋白相對表達水平;D. Pax7的蛋白相對表達水平;E. MyoD的mRNA相對表達水平;F. MyoG的mRNA相對表達水平;G. MSTN的mRNA相對表達水平;H. MSTN的mRNA相對表達水平。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;.損傷組;.治療組A. Relative expression levels of MyoD protein; B. Relative expression levels of MyoG protein; C. Relative expression levels of MSTN protein; D. Relative expression levels of Pax7 protein; E. Relative expression levels of MyoD mRNA; F. Relative expression levels of MyoG mRNA; G. Relative expression levels of MSTN mRNA; H. Relative expression levels of Pax7 mRNA; *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001; . Injure;. Treatment圖2 丹參素對肌肉再生相關(guān)因子蛋白的影響Fig.2 Effect of Danshensu on muscle regeneration related factor protein

QRT-PCR結(jié)果顯示,損傷后第3天時,生肌決定因子MyoD、肌細胞分化標志物MyoG以及肌衛(wèi)星細胞標志物Pax7的基因表達水平都顯著高于正常對照組(圖2E、F、H),而肌肉生長抑制素MSTNmRNA表達呈下降趨勢(圖2G)。治療組Pax7 mRNA表達水平較損傷組更高、MSTNmRNA含量也更低,說明丹參素治療在損傷最嚴重時,促進受損肌纖維修復(fù),此情況持續(xù)到第7天受損肌肉基本恢復(fù)前。第5天,治療組MyoGmRNA水平明顯高于損傷組,MSTNmRNA水平顯著低于損傷組,說明丹參素治療可以促進肌衛(wèi)星細胞激活,同時對MSTN產(chǎn)生拮抗作用,從而加快修復(fù)進程。

2.3 丹參素抑制肌肉損傷后炎癥

巨噬細胞是損傷區(qū)域內(nèi)的主要炎癥細胞,在肌肉再生過程中表達有一定規(guī)律性。QRT-PCR結(jié)果顯示,損傷組與治療組的促炎因子IL-6基因表達水平早期均急劇上升,之后呈明顯下降趨勢。第3、7天時,治療組IL-6 mRNA表達顯著低于損傷組(圖3A)?？寡滓蜃覫L-10初期表達量較低,治療組第5天時,IL-10 mRNA達到峰值,表達水平顯著高于損傷組(圖3B)。巨噬細胞特異性標志物F4/80不論是轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白表達水平均在損傷后急劇升高,治療后,第3天時F4/80表達高于損傷組,第7天時表達顯著低于損傷組,第5天的F4/80蛋白表達低于損傷組(圖3C、D)。以上結(jié)果表明,肌肉損傷刺激巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子,吞噬組織碎片和壞死肌纖維。丹參素治療后炎性因子水平受到抑制,炎癥程度明顯降低,抗炎性因子顯著增加,丹參素可以加快M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)變進程。

A. IL-6的mRNA相對表達水平;B. IL-10的mRNA相對表達水平;C. F4/80的mRNA相對表達水平;D. F4/80的蛋白相對表達水平。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;.損傷組;.治療組A. Relative expression levels of IL-6 mRNA; B. Relative expression levels of IL-10 mRNA; C. Relative expression levels of F4/80 mRNA; D. Relative expression levels of F4/80 protein; *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001; . Injure;. Treatment圖3 丹參素對炎癥相關(guān)因子的影響Fig.3 Effects of Danshensu on inflammation-related factor genes

2.4 丹參素減輕損傷修復(fù)后肌肉纖維化的程度

Masson染色結(jié)果顯示,第7天時,治療組細胞間膠原纖維明顯少于損傷組(圖4A)。為進一步檢測丹參素治療對損傷肌肉愈合后纖維化的影響,對肌肉纖維化標志性因子Collagen Ⅰ以及α-SMA的蛋白表達水平進行測定。結(jié)果顯示,丹參素治療第3天纖維化相關(guān)因子表達與損傷組無明顯差異,當治療5、7 d后,治療組Collagen Ⅰ以及α-SMA的蛋白表達水平均顯著低于損傷組(圖4B、C)。與對照組相比,損傷組和治療組的Collagen Ⅰ mRNA和α-SMA mRNA在后期均顯著升高。在第5、7天時,治療組纖維化基因表達均顯著低于損傷組(圖4D、E)。因此,丹參素治療可能通過抑制Ⅰ型膠原過度分泌以及減少成纖維細胞增生,從而抑制小鼠骨骼肌損傷后肌纖維化。

A．第7天損傷組和治療組的腓腸肌Masson染色,標尺為100 μm; B. Collagen Ⅰ的蛋白相對表達水平;C. α-SMA的蛋白相對表達水平;D. Collagen Ⅰ的mRNA相對表達水平;E. α-SMA的mRNA相對表達水平。*. P<0.05;**. P<0.01;.損傷組;.治療組A. Masson staining of GAS in injure and treatment groups on 7 days, bar=100 μm; B. Relative expression levels of Collagen Ⅰ protein; C. Relative expression levels of α-SMA protein; D. Relative expression levels of Collagen Ⅰ mRNA; E. Relative expression levels of α-SMA mRNA; *. P<0.05, **. P<0.01; . Injure;. Treatment圖4 丹參素對肌肉纖維化相關(guān)因子蛋白表達的影響Fig.4 The effect of Danshensu on muscle fibrosis related factor protein expression

2.5 丹參素改善肌肉損傷后肌間脂肪的生成

骨骼肌損傷初期,脂肪組織填充受損部位,為后續(xù)肌肉修復(fù)構(gòu)建良好的再生環(huán)境。QRT-PCR結(jié)果顯示,治療組PPARγ mRNA水平于第5天達到高峰,且基因表達水平明顯高于損傷組,5 d后表達下降,第7天治療組的PPARγ mRNA水平仍然高于損傷組(圖5A)。蛋白結(jié)果顯示,第3、5天時,治療組PPARγ蛋白水平顯著高于損傷組(圖5B)。綜上所述,丹參素治療能夠在損傷初期增加肌間脂肪含量。

A. PPAR-γ mRNA相對表達水平;B. PPAR-γ蛋白相對表達水平。*. P<0.05;**. P<0.01;***. P<0.001;.損傷組;.治療組A. Relative expression levels of PPAR-γ mRNA; B. Relative expression levels of PPAR-γ protein;*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001; . Injure;. Treatment圖5 丹參素對肌肉損傷后脂肪因子的影響Fig.5 Effects of Danshensu on fat factor after muscle injury

3 討 論

在骨骼肌損傷后不同時間段,肌纖維會發(fā)生不同變化,因此對肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察可以作為判斷肌肉損傷及修復(fù)效果的依據(jù)。本試驗通過進行HE染色發(fā)現(xiàn),第3天時丹參素治療組已有少量再生肌纖維形成,并且炎性細胞浸潤弱于損傷組,說明治療縮短了損傷后的炎性進程,促進新生肌纖維形成。并且7 d后,明顯觀察到治療組肌纖維再生明顯且排列更緊密,當損傷組還在大量再生時,治療組已經(jīng)進入損傷后期重塑階段。

肌衛(wèi)星細胞的激活決定了骨骼肌本身的修復(fù)能力,不論是轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白表達水平,相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示損傷后肌再生過程中,肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化扮演了重要的角色[29]。在本研究中,治療組在第5天時Pax7含量達到峰值。肌增殖標記物MyoD與分化標志物MyoGmRNA均于肌肉損傷第3天顯著升高,后期呈下降趨勢,而蛋白表達第5天到達峰值。對于肌再生負調(diào)控因子MSTN來說,治療組表現(xiàn)出更明顯的抑制作用。因此,丹參素促進了損傷后修復(fù)過程中肌衛(wèi)星細胞的激活及分化。

試驗前期從組織學(xué)角度以及分子層面研究發(fā)現(xiàn),丹參素治療組成肌纖維正調(diào)節(jié)因子均表達上升,證實丹參素治療使肌肉肌衛(wèi)星細胞更迅速激活。之后檢測與新生肌纖維直接相關(guān)的蛋白表達情況,結(jié)果顯示α-Actinin與eMyHC含量在第5天迅速上升,明顯高于損傷組,說明在第5天時修復(fù)效果最好,這與HE染色在第5天觀察到大量中心核細胞產(chǎn)生且細胞之間排列更加緊密的結(jié)果保持一致。

有研究表明中藥可以減輕損傷后炎癥反應(yīng),促進肌纖維生成與成熟,減少結(jié)締組織增生[30-31]。這種說法與本試驗丹參素治療骨骼肌損傷時效果一致。自從Hough第一次提出延遲性肌肉酸痛概念,之后骨骼肌損傷發(fā)生原因受到國內(nèi)外廣泛研究,已經(jīng)提出了肌細胞代謝能量紊亂學(xué)說、肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)學(xué)說、機械損傷學(xué)說、自由基和脂質(zhì)過氧化學(xué)說以及炎性損傷假說[32]。本試驗研究表明,治療組與對照組相比,在肌肉再生過程中表達了更低的促炎因子與更高的抗炎因子,M1型巨噬細胞促進肌衛(wèi)星細胞的激活,而M2型巨噬細胞促進肌衛(wèi)星細胞融合與分化成熟。本試驗中M1型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)變,符合骨骼肌損傷后再生規(guī)律。丹參素治療組通過干預(yù)炎癥反應(yīng),使得炎性因子表達降低或炎癥進程加快,促進損傷肌肉再生。齊田田等[33]研究表示,丹參水溶性成分可以舒張冠脈、拮抗鈣超載、調(diào)節(jié)能量代謝、活性氧代謝、保護內(nèi)皮、抑制炎性反應(yīng)、細胞凋亡和調(diào)控自噬抗心肌缺血及再灌注損傷。因此,丹參素推動了骨骼肌損傷后修復(fù)過程中的炎癥進程。

朱文輝等[34]研究發(fā)現(xiàn)損傷部位注射黃芪、丹參治療,MyHC Ⅱb表達明顯高于自然愈合組,且Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯下降[19]。所以,丹參素可能是促進骨骼肌損傷后的修復(fù)再生,延緩骨骼肌纖維化的重要成分。本試驗研究表明,肌肉損傷后膠原纖維標志性因子Collagen Ⅰ以及成纖維細胞標志性因子α-SMA均呈緩慢上升趨勢,而丹參素治療后兩個因子表達明顯下降,說明丹參素抑制了肌肉纖維化,有助于減少瘢痕組織。PPARγ主要表達于脂肪組織及免疫系統(tǒng),參與前脂肪細胞分化成脂肪細胞以及單核細胞分化為巨噬細胞,與脂肪細胞分化和機體免疫關(guān)系密切。本試驗研究發(fā)現(xiàn),治療后PPARγ水平上升,且與損傷組存在明顯差異。推測PPARγ前期的表達量升高有助于刺激巨噬細胞釋放炎性因子,并引導(dǎo)骨骼肌內(nèi)脂肪組織產(chǎn)生,有助于促進肌纖維修復(fù)。祁美武和周曉[35]觀察放療大鼠腿部肌肉纖維化的情況,發(fā)現(xiàn)注射脂肪干細胞可以相對降低TGF-β1的速度,對肌肉纖維化起到一定的延緩作用,表明脂肪細胞可能會減緩肌肉纖維化,與本試驗經(jīng)丹參素治療后纖維化相關(guān)因子表達降低具有一致性。

越來越多的中藥用來治療犬、貓運動造成的損傷,本研究針對丹參素加速骨骼肌損傷后修復(fù)的功能進行了基礎(chǔ)探索,表明丹參素將在治療犬、貓骨骼肌損傷中發(fā)揮重要的作用,這在寵物醫(yī)療行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本試驗證明傳統(tǒng)中藥丹參的提取物丹參素單體成分對骨骼肌再生的積極作用,其可抑制骨骼肌纖維化,改善肌肉修復(fù)速度與質(zhì)量,為后續(xù)臨床治療動物骨骼肌損傷提供候選藥物參考。