萊蕪豬和杜長大豬盲腸和結(jié)腸微生物菌群結(jié)構(gòu)組成和功能分析

李 超,趙雪艷,王永軍,王彥平,任一帆,李菁璇,王懷中,王繼英*,宋勤葉

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,保定 071000;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250100;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250100;4.濟(jì)南市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心,濟(jì)南 250000)

動(dòng)物腸道微生物是一個(gè)非常復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),影響許多重要的宿主生理功能,如食物攝入、新陳代謝調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)激活、上皮細(xì)胞增殖和抗感染[1]。大量研究表明,不同品種豬具有不同的腸道菌群結(jié)構(gòu),與引進(jìn)豬種相比,地方豬種腸道微生物組成更豐富[2]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物菌群對豬脂肪沉積、飼料利用率、免疫抗性等有重要影響。He等[3]、Yang等[4]和Chen等[5]通過分析腸道微生物菌群與背膘厚、脂肪率等性狀的關(guān)系,鑒定出普雷沃氏菌屬(Prevotella)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等影響脂肪沉積的微生物類群。Bergamaschi 等[6]研究發(fā)現(xiàn),直腸微生物菌群中的厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)、擬桿菌屬(Bacteroides)、布氏桿菌屬(Blautia)等影響杜洛克、大約克和長白等瘦肉型豬的飼料利用率。Zhao等[7]通過研究宿主-微生物群相互作用,揭示乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭菌屬(Clostridia)和真桿菌屬(Eubacterium)等潛在有益菌介導(dǎo)了民豬對炎癥性腸病的抗性。

萊蕪豬是中國著名的地方豬品種,具有肉質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)良種質(zhì)特性[8],尤其是肌內(nèi)脂肪沉積能力特別強(qiáng),含量高達(dá)10%[9],是我國地方豬種資源的寶貴基因庫。系統(tǒng)研究萊蕪豬和杜長大(DLY)豬盲腸和結(jié)腸微生物菌群結(jié)構(gòu)組成和功能,鑒定影響萊蕪豬特性的微生物菌屬,將為從腸道菌群層面深入理解萊蕪豬特性奠定基礎(chǔ)。本研究以DLY豬為對比,系統(tǒng)研究自然生產(chǎn)狀態(tài)下萊蕪豬盲腸和結(jié)腸腸道食糜微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和功能,分析腸道菌群與背膘厚、血清生化指標(biāo)的相關(guān)性,研究腸道中優(yōu)勢菌種與其表型性狀的潛在聯(lián)系,為從腸道菌群層面深入理解萊蕪豬高脂肪沉積、耐粗飼和抗逆等特性作用機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

本研究中的12頭萊蕪豬去勢公豬來自萊蕪豬種豬繁育有限公司,6頭DLY豬去勢公豬來自萊蕪豬種豬繁育有限公司臨近的商品豬場。所有試驗(yàn)豬健康無腹瀉,且屠宰前3個(gè)月內(nèi)均未使用過抗生素。萊蕪豬和DLY豬分別參照國家標(biāo)準(zhǔn)《豬的營養(yǎng)需要量》(GB/T 39235—2020)的脂肪型豬和瘦肉型豬的標(biāo)準(zhǔn)配制。飼糧組成及營養(yǎng)水平詳見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Diet composition and nutrient level in this study(air-dry basis)

萊蕪豬日齡303 d,宰前體重為(95±5.8)kg,杜長大豬日齡192 d,宰前體重為(120±4.8)kg,均處于肥育后期。12頭試驗(yàn)動(dòng)物禁食24 h,電擊致暈后按照標(biāo)準(zhǔn)流程屠宰。屠宰時(shí)采血,3 000 r·min-1離心5 min,吸取血清于離心管中,置于-20 ℃冰箱中保存。收集盲腸和結(jié)腸食糜于無菌離心管中,液氮中速凍,置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 背膘厚和血清生化指標(biāo)測定

根據(jù)《瘦肉型豬胴體性狀測定技術(shù)規(guī)范》( NY/T 825—2004)[10]測量胴體背中線肩部最厚處、最后肋、腰薦結(jié)合處三點(diǎn)的皮下脂肪厚度,取3點(diǎn)平均值作為平均背膘厚。采用日立7100自動(dòng)生化分析儀測定血清中的總蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TCH)和二胺氧化酶(DAO)。

1.3 DNA 提取、PCR擴(kuò)增和16S rDNA高通量測序

使用土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒(Qiagen, Valencia, California, USA)提取盲腸和結(jié)腸食糜中總基因DNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(NanoDrop,德國)測量提取的DNA的濃度和純度,并在1% (w/v)瓊脂糖凝膠上評(píng)估完整性。質(zhì)控合格后,使用特異性引物341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域[11]。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度等量混樣,充分混勻后使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,并使用Universal DNA Gel Extraction Kit (TianGen, 北京, 中國)純化目的條帶。使用NEB-Next?Ultra DNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)構(gòu)建測序文庫。文庫用Qubit 2.0熒光計(jì)(Thermo Scientific)量化后,由諾禾致源(中國北京)利用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行雙末端測序,測序讀段長度為250 bp。

1.4 16S rDNA測序數(shù)據(jù)處理

根據(jù)Barcode和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7)[12]對reads進(jìn)行拼接,得到原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags);原始Tag使用QIIME(V1.9.1)[13]進(jìn)行如下質(zhì)量控制得到高質(zhì)量的Tags(Clean tags):a)Tag截取:將原始Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?b)Tag長度過濾:經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集,進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。經(jīng)過以上處理后得到的高質(zhì)量Tag序列通過VSEARCH[14]與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對檢測和去除嵌合體序列,并得到最終的有效Tag數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001)[15]對樣本的全部有效Tags進(jìn)行聚類,以默認(rèn)的97%序列一致性(Identity)將有效Tag序列聚類成為分類操作單元(OTUs),同時(shí)選取出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。使用Mothur方法與SILVA138[16]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[17]對OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1),獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平(門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計(jì)各樣本的微生物菌群組成。使用MUSCLE[18](Version 3.8.31)軟件進(jìn)行快速多序列比對,得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.5 腸道菌群多樣性及品種差異分析

使用QIIME(V 1.9.1)計(jì)算樣品的Simpson和Shannon等Alpha多樣性指標(biāo),并使用Wilcox檢驗(yàn)分析Alpha多樣性指數(shù)組間差異;使用QIIME軟件(V 1.9.1)計(jì)算 Bray-Curtis相異度以估計(jì)群落結(jié)構(gòu)的差異,使用主坐標(biāo)分析(PCoA)對樣本的相似性或差異性進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

使用LEfSe[19]開展品種間物種差異判別分析以鑒定顯著性影響萊蕪豬和DLY豬的腸道微生物菌群,所用分析參數(shù)為:使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較OTU的相對豐度,P水平為0.05;將所得顯著不同的OTU用作線性判別分析(LDA)的輸入,以計(jì)算它們的效應(yīng)大小,選擇對數(shù)LDA得分閾值>3.5的OTU作為組間顯著不同的OTU。使用Metastats[20]對門、屬、種水平的各個(gè)分類單元在萊蕪豬和DLY豬之間的豐度差異進(jìn)行比較檢驗(yàn)。

1.6 腸道菌群與背膘厚、血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

使用R語言計(jì)算背膘厚和血清生化指標(biāo)與豐度前40的腸道微生物菌屬豐度之間的Spearman相關(guān)系數(shù),將獲得的相關(guān)系數(shù)數(shù)值矩陣通過R語言pheatmap程序包繪制相關(guān)性熱圖。

1.7 腸道菌群功能預(yù)測

使用Tax4Fun[21]對16S rDNA基因測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能預(yù)測,并使用熱圖可視化前35個(gè)KEGG通路的統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié) 果

2.1 背膘厚和血清生化指標(biāo)檢測

萊蕪豬和DLY豬的背膘厚和血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果見表2?？梢钥闯?萊蕪豬和DLY豬具有不同的品種特點(diǎn),二者的背膘厚、部分血清生化指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)。萊蕪豬的背膘厚和TP顯著高于DLY豬(P<0.05),GLU、TG和HDL-C均顯著低于DLY豬(P<0.05)。

表2 萊蕪豬和杜長大豬背膘厚和血清生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of backfat thickness and serum biochemical parameters between Laiwu and DLY pigs

2.2 測序數(shù)據(jù)概述

萊蕪豬和DLY豬的盲腸、結(jié)腸腸道微生物菌群16S rRNA 測序數(shù)據(jù)如表3所示。本研究共得到2 105 633個(gè)高質(zhì)量的有效tag序列,平均每個(gè)樣本為 58 490個(gè),有效tag序列的平均長度為409 bp,Q20和Q30的平均值分別為98.39% 和94.79%,表明本研究測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。

表3 16S rDNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)性描述Table 3 Summary statistics for the 16S rDNA sequencing data

2.3 腸道微生物菌群多樣性分析

基于97%的序列一致性將有效Tag序列聚類,共獲得了6 642個(gè)OTUs。萊蕪豬和DLY豬盲腸和結(jié)腸共有和特異的OTU韋恩圖(圖1)顯示,萊蕪豬、DLY豬盲腸和結(jié)腸4個(gè)腸段中共有的OTU數(shù)量為1 130個(gè),占所有OTU總數(shù)的17.01%;萊蕪豬盲腸和結(jié)腸共有OTU數(shù) 1 722個(gè),DLY豬盲腸和結(jié)腸的共有OTU 1 251個(gè);萊蕪豬和DLY豬盲腸和結(jié)腸共有OTU 分別為1 454和 1 372個(gè)。特異OTU分析顯示,萊蕪豬盲腸和結(jié)腸特異OTU分別為708和2 825個(gè),DLY豬盲腸和結(jié)腸特異OTU分別為690和283個(gè)。萊蕪豬盲腸和DLY豬盲腸的特異OTU數(shù)量基本一致,而萊蕪豬結(jié)腸的特異OTU數(shù)量遠(yuǎn)高于DLY豬結(jié)腸的特異OTU數(shù)量。

DLYCA代表杜長大豬盲腸,DLYCO代表杜長大豬結(jié)腸,LWCA代表萊蕪豬盲腸,LWCO代表萊蕪豬結(jié)腸,下同DLYCA means caecum of DLY pig, DLYCO means colon of DLY pig, LWCA means caecum of Laiwu pig, LWCO means colon of Laiwu pig, the same as below圖1 萊蕪豬和杜長大豬盲腸和結(jié)腸共有和特異分類操作單元(OTUs)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of common and unique operational taxonomic units (OTUs) of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs

萊蕪豬和DLY豬盲腸和結(jié)腸微生物菌群的Alpha多樣性見圖2所示,可以看出利用Simpson和Shannon指數(shù)分析的Alpha多樣性結(jié)果基本一致。萊蕪豬盲腸Simpson指數(shù)高于DLY豬,且萊蕪豬與DLY豬在盲腸的Simpson指數(shù)上的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05),表明萊蕪豬比DLY豬具有更豐富的盲腸微生物多樣性。

左為Simpson指數(shù),右為Shannon指數(shù),*表示P<0.05Left. Simpson index; Right. Shannon index, *. P<0.05圖2 萊蕪豬和杜長大豬盲腸和結(jié)腸微生物的Alpha多樣性比較Fig.2 Comparison of microbial alpha diversity of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs

為衡量樣本或組間的微生物組差異,根據(jù)Bray-Curtis相異度繪制PCoA圖(圖3)?？梢钥吹?萊蕪豬盲腸(LWCA)、萊蕪豬結(jié)腸(LWCO)、DLY豬盲腸(DLYCA)和DLY豬結(jié)腸(DLYCO)4組樣本相對聚集在一起,組間有一定程度重疊。DLY豬盲腸樣本分布最為集中,表明DLY豬樣本盲腸微生物一致性最高。DLY豬盲腸與結(jié)腸樣本只有少許重疊,而萊蕪豬盲腸與結(jié)腸樣本重疊較多,表明萊蕪豬盲腸與結(jié)腸微生物菌群的相似度更高。萊蕪豬盲腸樣本與DLY豬盲腸樣本、萊蕪豬結(jié)腸樣本與DLY豬結(jié)腸樣本均有部分重疊,表明不同豬種同一腸段的菌群之間有一定的相似性。

圖3 萊蕪豬和杜長大豬盲腸和結(jié)腸微生物菌群的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis by the bacterial microbiota of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs

2.4 腸道微生物菌群分類學(xué)統(tǒng)計(jì)

本研究檢測的6 642個(gè)OTUs中,4 750個(gè)(占總數(shù)的 71.51%)可在Silva數(shù)據(jù)庫中注釋,門、綱、目、科、屬和種水平的注釋率分別為64.50%、62.15%、56.55%、46.69%、31.11%、6.68%。

在門水平上(圖 4A),萊蕪豬和DLY豬均以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)為優(yōu)勢菌門,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)豐度之和分別占萊蕪豬盲腸微生物的92.86%和結(jié)腸微生物的91.15%,占DLY豬盲腸微生物的96.13%和結(jié)腸微生物的96.51%。品種間比較,萊蕪豬盲腸和結(jié)腸中的厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度占比均低于DLY豬,其中盲腸的差別達(dá)到顯著水平(69.16%vs. 89.59%,P<0.05,圖5A)。此外,萊蕪豬結(jié)腸和盲腸中的廣古菌門(Euryarchaeota)和梭桿菌門(Fusobacteriota)相對豐度分別為2.47%和2.54%,遠(yuǎn)高于DLY豬結(jié)腸和盲腸中的這2個(gè)門的相對豐度(0.06%和0.01%),但沒有達(dá)到顯著差異(P>0.05)。

在屬水平上(圖4B),萊蕪豬和DLY豬盲腸和結(jié)腸微生物豐度最高的菌屬均為土孢桿菌屬(Terrisporobacter),占比為15.64%～32.50%。在萊蕪豬和DLY豬盲腸中微生物豐度排名第2、3位的屬分別為蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)和狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1),在萊蕪豬結(jié)腸中微生物豐度排名第2、3位的屬分別為狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)和蘇黎世桿菌屬(Turicibacter),而在DLY豬結(jié)腸中微生物豐度排名第2、3位的屬分別為鏈球菌屬(Streptococcus)和狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)。品種間比較,萊蕪豬盲腸中(Oscillospiraceae_UCG-007)和候選單胞生糖菌屬(Candidatus_Saccharimonas)的相對豐度顯著低于DLY豬(0.004 347 % 和0.019 69%vs.0.013 30% 和0.158%,P<0.05,圖5B、5C)。另外,萊蕪豬結(jié)腸中甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)、活潑瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)和盲腸中的梭桿菌屬(Fusobacterium)的相對豐度遠(yuǎn)高于DLY豬對應(yīng)菌屬的相對豐度(2.47%、3.11%和2.54%vs.0.03%、0.22%和0.01%),萊蕪豬結(jié)腸中的鏈球菌屬(Streptococcus)和乳酸菌屬(Lactobacillus)相對豐度遠(yuǎn)小于DLY豬對應(yīng)菌屬的相對豐度(0.7%和2.21%vs.15.50%和15.37%),但差異均沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖4 萊蕪豬和杜長大豬盲腸和結(jié)腸微生物菌群前10個(gè)門(A)和前10個(gè)屬(B)相對豐度組成Fig.4 Relative abundance of the top 10 bacterial microbiota at phylum (A) and genus (B) levels of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs

A. 厚壁菌門;B. Oscillospiraceae_UCG-007菌屬;C. 候選單胞生糖菌屬。* 表示差異顯著(P<0.05)A. Firmicutes; B. Oscillospiraceae_UCG-007; C. Candidatus_Saccharimonas. Significance is presented as * (P<0.05).圖5 萊蕪豬和杜長大豬盲腸微生物顯著差異菌門和屬Fig.5 Significantly different microbiota at phylum and genus levels of caecum in Laiwu and DLY pigs

此外,為了鑒定顯著影響萊蕪豬和DLY豬盲腸和結(jié)腸的特定微生物菌群,本研究進(jìn)一步使用LEfSe開展組間物種差異判別分析(圖6)。從圖6中可以看出,萊蕪豬盲腸中檢測到的特異菌屬最多,包括變形菌門(Proteobacteria)中的大腸志賀桿菌屬(Escherichia_Shigella)、厚壁菌門(Firmicutes)中的克里斯滕森菌科_R-7菌屬(Christensenellaceae_R_7_group)和顫螺旋菌科(UCG-005屬)、梭桿菌門(Fusobacteria)中的梭菌屬(Fusobacterium)等特異菌屬。在DLY豬盲腸中檢測到的特異菌屬包括厚壁菌門(Firmicutes)中的蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)和消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)中的Intestinibacter、真桿菌屬成員(unidentified_Eubacterium_coprostanoligenes_group)等。在萊蕪豬結(jié)腸檢測到的特異菌屬包括厚壁菌門(Firmicutes)中的狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、放線菌門(Actinobacteriota)中的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)等。在DLY豬結(jié)腸中檢測到的特異菌屬包括厚壁菌門(Firmicutes)中的乳酸菌屬(Lactbbacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和(Subdoigranulum)等。

圖6 萊蕪豬和杜長大豬盲腸和結(jié)腸微生物群落LEfSe多級(jí)物種差異判別分析結(jié)果Fig.6 Bacterial taxa differentially represented in the corresponding segment of caecum and colon of Laiwu and DLY pigs identified by LEfSe

2.5 腸道菌群豐度與背膘厚和血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

為探討腸道菌群豐度與背膘厚和血清生化指標(biāo)間的關(guān)系,本研究計(jì)算了腸道微生物菌群前40個(gè)菌屬的豐度與背膘厚、TP、GLU、TG和HDL-C在兩品種顯著差異指標(biāo)間的Spearman相關(guān)系數(shù),詳見圖7。由圖7可知,腸道微生物菌屬豐度與背膘厚和部分血清生化指標(biāo)具有的顯著相關(guān)性(P<0.05),且盲腸和結(jié)腸的微生物菌屬與各性狀的相關(guān)模式不同。例如盲腸中背膘厚與擬桿菌屬(Bacteroides)、顫螺菌科成員(Oscillospiraceae-UCG-005)、擬梭菌屬(Clostridioides)、歐陸森氏菌屬(Olsenella)和小桿菌屬(Dialister)呈顯著正相關(guān),與蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)和腸桿菌屬(Intestinibacter)呈顯著負(fù)相關(guān);結(jié)腸中背膘厚與狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacte)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)、擬梭菌屬(Clostridioides)、羅氏菌屬(Rothia)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)與呈顯著正相關(guān),與鏈球菌屬(Streptococcus)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)和陰溝桿菌屬(Agathobacter)呈顯著負(fù)相關(guān)。

圖7 豬盲腸(左)和結(jié)腸(右)微生物菌群與背膘厚和血清生化指標(biāo)相關(guān)性熱圖Fig.7 Correlation heatmap between caecum(left) and colon(right) bacterial microbiota and backfat thickness and serum biochemical parameters in Laiwu and DLY pig

2.6 腸道細(xì)菌群落功能預(yù)測分析

為探討腸道菌群影響宿主表型的機(jī)理,利用Tax4fun對萊蕪豬和DLY豬盲腸和結(jié)腸微生物菌群進(jìn)行了功能預(yù)測分析(圖8)?？梢钥闯?盲腸和結(jié)腸微生物菌群的功能主要富集在代謝、免疫、信息處理等通路。與結(jié)腸相比,盲腸富集了更多的通路。品種間比較,萊蕪豬和DLY豬微生物菌群功能富集的通路有很大不同。萊蕪豬盲腸和結(jié)腸富集了異種生物降解和代謝、輔助因子和維生素代謝、能量代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸代謝、多酮類和萜類化合物的代謝等代謝相關(guān)通路;細(xì)胞過程和信號(hào)、細(xì)胞群落-原核生物、細(xì)胞生長和死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等細(xì)胞過程相關(guān)通路;衰老、癌癥、內(nèi)分泌和代謝疾病、免疫系統(tǒng)等生物體系統(tǒng)和疾病相關(guān)通路。DLY豬盲腸和結(jié)腸富集了其他氨基酸代謝、核苷酸代謝、碳水化合物代謝、脂類物質(zhì)代謝、多糖生物合成與代謝等代謝相關(guān)通路;轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù)、翻譯、折疊、分類和降解等遺傳信息處理相關(guān)通路;抗藥性、傳染病等疾病相關(guān)通路。

圖8 基于Tax4fun在第二層級(jí)上的功能預(yù)測的熱圖聚類Fig.8 The heatmap of microbial functions at the second level predicted by Tax4fun

3 討 論

3.1 盲腸與結(jié)腸微生物菌群的多樣性和組成

目前,豬腸道微生物研究主要集中在對消化道的糞便或直腸微生物菌群研究[22-24]。然而,由于解剖結(jié)構(gòu)和生理特性的差異,豬的腸道各部位菌群在種類、豐度上也明顯不同[25-26]。糞便只能定性地反映腸道的菌群種類,卻不能定量反映不同腸段的菌群豐度[27]。盲腸的結(jié)構(gòu)有利于食糜停留,結(jié)腸中食糜的流通速度緩慢,豬的盲腸和結(jié)腸給予細(xì)菌大量增殖的機(jī)會(huì),是豬主要的發(fā)酵器官。本研究中萊蕪豬盲腸和結(jié)腸的Shannon指數(shù)為5.52和5.31,低于譚占坤等[28]報(bào)道的放牧藏豬、舍飼藏豬和DLY豬盲腸的Shannon指數(shù)8.68、7.48和7.21以及Shang等[29]報(bào)道的藏豬和約克夏豬結(jié)腸的Shannon指數(shù)5.68和6.22。且本研究中萊蕪豬盲腸和結(jié)腸的微生物多樣性高于Yang等[4]報(bào)道的萊蕪豬的空腸和回腸的Shannon指數(shù)(1.8～2.4)以及Holman等[26]薈萃分析的十二指腸、空腸和回腸的Shannon指數(shù)(1.87、3.06和2.72),表明盲腸和結(jié)腸的微生物多樣性高于小腸腸段。

本研究中,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)是盲腸和結(jié)腸腸道微生物中豐度占比最高的菌門(圖4),厚壁菌門和擬桿菌門豐度之和分別占萊蕪豬盲腸和結(jié)腸微生物的92.86%和91.15%,占DLY豬盲腸和結(jié)腸微生物的96.13%和96.51%。這與Isaacson和Kim[30]研究中豬盲腸和結(jié)腸有超過90%的細(xì)菌歸屬于厚壁菌門和擬桿菌門的結(jié)果相一致。而且,本研究發(fā)現(xiàn),與DLY豬相比較,萊蕪豬具有獨(dú)特腸道菌群組成。在門水平上,萊蕪豬盲腸和結(jié)腸中的厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度占比均低于DLY豬,其中盲腸的差別達(dá)到顯著水平(69.16%vs. 89.59%)。對人類和小鼠的研究表明,在肥胖個(gè)體糞便微生物菌群研究中,厚壁菌門(Firmicutes)的豐度占比例較大[31],而擬桿菌門(Bacteroidota)的比例較低[32],與本文中的研究不一致。這種差異可能是由于物種以及糞便微生物組和盲腸腸道微生物組成的差異所致。萊蕪豬盲腸和結(jié)腸微生物中占比例較高菌屬為土孢桿菌屬(Terrisporobacter)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)和狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1),這與石寶明等[2]報(bào)道的金華豬和藏豬腸道微生物豐度較高的菌屬種類有著較高的一致性。

3.2 盲腸與結(jié)腸微生物菌群對宿主背膘厚、血清生化指標(biāo)表型的影響

萊蕪豬是我國華北黑豬的典型代表,具有很強(qiáng)的脂肪沉積、抗病和耐粗飼能力。DLY豬是我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的商品豬種,以生長速度快、瘦肉率高著稱。本研究發(fā)現(xiàn),除了背膘厚外,萊蕪豬與DLY豬的部分血清生化指標(biāo)(TP、GLU、TG和HDL-C)也存在著顯著差異性(P<0.05,表1)。血清生化指標(biāo)是反映機(jī)體健康狀況、內(nèi)環(huán)境平衡及養(yǎng)分消化代謝的重要參數(shù),這些指標(biāo)可能通過影響消化代謝進(jìn)而影響生產(chǎn)性能。本研究開展了腸道微生物菌屬豐度與背膘厚、兩品種間顯著差異血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)了一些與這些性狀顯著相關(guān)的腸道微生物類群(P<0.05),這些微生物類群可能對萊蕪豬和DLY豬的重要性狀有重要影響。

結(jié)腸中的甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)與背膘厚呈顯著正相關(guān)。甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)屬于廣古菌門(Euryarchaeota),可能在宿主的能量代謝和脂肪沉積中起著至關(guān)重要的作用,將人類甲烷短桿菌接種到無菌小鼠的模型試驗(yàn)證明了這一點(diǎn)[33]。而且,人類肥胖癥研究中發(fā)現(xiàn),肥胖個(gè)體利用h2產(chǎn)甲烷菌數(shù)量明顯高于瘦人個(gè)體[34]。梭桿菌屬(Fusobacterium)和大腸桿菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)與TG呈顯著負(fù)相關(guān)。人類肥胖研究證明梭桿菌屬(Fusobacterium)和大腸桿菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)的豐度占比在肥胖人群中同樣大幅度增加[35]。而且梭桿菌屬(Fusobacterium)和大腸桿菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)均為萊蕪豬LEfSe差異判別分析結(jié)果中的特異菌,說明梭桿菌屬(Fusobacterium)和大腸桿菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)可能通過影響萊蕪豬血清中TG從而影響了萊蕪豬的脂肪沉積。萊蕪豬結(jié)腸中的活潑瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)相對豐度遠(yuǎn)高于DLY豬(3.11%vs. 0.22%),擬桿菌屬(Bacteroides)為LEfSe物種差異判別分析中鑒定出的萊蕪豬盲腸微生物菌屬。以往研究表明,擬桿菌屬(Bacteroides)在飼喂高纖維日齡的豬腸道中豐度顯著提高[36],活潑瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)是豬腸道微生物中纖維素和半纖維素分解的重要細(xì)菌菌屬[37],這兩個(gè)菌屬,通過分解宿主消化系統(tǒng)的纖維素來獲取營養(yǎng),可能是導(dǎo)致萊蕪豬高纖維消化能力的主要因素之一,當(dāng)然這也可能是由于萊蕪豬飼喂高纖維傳統(tǒng)日糧造成的菌群差異。羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus_reuteri)是國際上公認(rèn)的益生乳酸菌,可改善腸道菌群分布,拮抗有害菌定植,避免罹患腸道疾病。前期研究表明,羅伊氏乳桿菌Lactobacillus_reuteri與背膘厚呈負(fù)相關(guān)[38],具有降低膽固醇[39]和預(yù)防肥胖[40]的作用。本研究中羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus_reuteri)在DLY豬結(jié)腸中豐度占比遠(yuǎn)高于萊蕪豬(2.34%vs. 0.33%),為DLY豬LEfSe差異判別分析結(jié)果中的特異菌,故可能是影響DLY豬低背膘厚、高生長速度的菌屬之一。

動(dòng)物腸道微生物與宿主之間相互選擇與適應(yīng),構(gòu)成一個(gè)相對穩(wěn)定的超有機(jī)體。宿主遺傳特征、飲食、環(huán)境和抗生素使用等因素均可影響腸道微生物的多樣性和功能[41]。本研究初步探索自然生產(chǎn)狀態(tài)下萊蕪豬腸道微生物的特點(diǎn),以后研究中需要在控制飼養(yǎng)環(huán)境、飼糧和體重(或日齡)一致的情況下進(jìn)一步研究分析,以驗(yàn)證本研究中結(jié)果。

4 結(jié) 論

本研究分析了自然生產(chǎn)狀態(tài)下萊蕪豬和DLY豬育肥階段腸道微生物菌群組成、結(jié)構(gòu)和功能,初步探索了萊蕪豬腸道微生物的特點(diǎn)。萊蕪豬具有與DLY豬不同的盲腸和結(jié)腸微生物菌群多樣性和相對豐度,且萊蕪豬盲腸微生物菌群多樣性顯著高于DLY豬;萊蕪豬腸道內(nèi)的一些微生物菌群與脂肪沉積、耐粗飼和抗逆性強(qiáng)等有關(guān),可能是影響萊蕪豬特性的原因之一。