益腎通癃顆粒調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路對人前列腺癌PC3 細(xì)胞荷瘤裸鼠的干預(yù)作用

朱文雄，袁軼峰，彭 濤，陳立蔓，陳其華，張 熙*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；3.湖南省腦科醫(yī)院（湖南中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院），湖南 長沙 410021

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是排名第二位的男性惡性腫瘤。有數(shù)據(jù)顯示，2007 年我國PCa 男性發(fā)病率為8.31/10 萬，到2017 年已上升到17.63/10萬，10 年間每年以21.22%的速度遞增，提示我國此病發(fā)病率正持續(xù)快速增長，其中55～80 歲的中老年群體的年均增速高達(dá)26.38%[1]。隨著老齡化的加劇，飲食習(xí)慣的改變，診療水平的提高，PCa 的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的持續(xù)增長趨勢，已成為嚴(yán)重影響老年男性健康的惡性腫瘤[2]。 PCa 極易引起膀胱出口梗阻、下尿路癥狀和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，不僅對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，由此衍生出的一系列情緒異常，如抑郁、焦慮等，使病人的幸福感更大程度地降低，但在此階段卻沒有確切有效的治療方法[3-4]。 PCa 的發(fā)病機(jī)制并沒有完全明確，目前普遍認(rèn)可的PCa 發(fā)病機(jī)制主要與前列腺細(xì)胞增殖/凋亡異常、炎癥應(yīng)激、腫瘤細(xì)胞免疫耐受、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡、組織重構(gòu)等相關(guān)[5-6]。

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療PCa 的方法主要有手術(shù)、放療、內(nèi)分泌治療、化療和免疫治療等，西藥主要有黃體生成素釋放激素類似物和非類固醇類抗雄激素藥物，它們雖然能發(fā)揮一定的療效，但在服藥過程中可能會伴隨很多不良反應(yīng)，包括過敏、骨質(zhì)疏松、心血管系統(tǒng)損害、男性乳房女性化以及性功能障礙等，同時這種疾病在后期往往會發(fā)展成去勢抵抗型PCa，并出現(xiàn)全身多處轉(zhuǎn)移的情況，導(dǎo)致治療效果和預(yù)后不佳[7-8]。 國家級名老中醫(yī)陳其華教授結(jié)合自身多年的臨證經(jīng)驗，將PCa 癥積的本質(zhì)和病機(jī)概括為“腎虛血瘀”，并確定了補(bǔ)腎益氣、化瘀散結(jié)的治法，創(chuàng)制了益腎通癃湯。前期研究已證實，益腎通癃湯治療PCa 真實有效[9]，其能夠下調(diào)PC3 細(xì)胞中Bcl-2、Cyclin E1 的表達(dá)，上調(diào)Bax、Cyclin D1 的表達(dá)，而這些多為Wnt 信號通路的下游靶基因[10]。 故本課題組設(shè)計了動物實驗，以益腎通癃湯超微中藥飲片（免煎顆粒）為研究對象，探究其調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路對人前列腺癌PC3 細(xì)胞荷瘤裸鼠的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級雄性BALB/c-nu 小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。湖南省實驗動物質(zhì)量合格證號：430727201101457224，實驗動物設(shè)施使用證明：430727207245002513。倫理審批號：ZYFY20211008-41。所有動物置于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物房每日定時飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗細(xì)胞系 本研究選擇的是人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞PC 3，屬于雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系，為中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院王蔭槐教授團(tuán)隊饋贈。

1.1.3 實驗藥物 益腎通癃顆粒由補(bǔ)骨脂15 g、蒙古黃芪30 g、熟地黃15 g、三棱10 g、莪術(shù)10 g 組成，所有中藥購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院超微顆粒藥房，由湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)。 中藥超微顆粒經(jīng)煮沸的蒸餾水沖泡、濃縮，分別制成生藥濃度為0.55、1.10、2.20 g/mL 的藥液。 Indocyanine green-001（ICG-001），Wnt 信號通路阻斷劑，凱立德生物醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司，規(guī)格：50 mg/支，批號：847591-62-2。

1.1.4 主要試劑 還原型5XSDS 上樣緩沖液、1.0 mol/L Tris·HCl（pH 6.8）、10% SDS、TEMED、PBST 緩沖液、30%Acr/Bic、RIPA 裂解液、SuperECL Plus 超敏發(fā)光液（長沙Abiowell 生物科技有限公司，批號分別為AWB0055、AWB0074、AWT0047、AWB0068、AWI0130、AWB0020、AWB0136、AWB0005）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，批號：583794）；顯影液、定影液（上海佳信科技有限公司，批號分別為BW-61、BW-62）。

1.1.5 主要儀器 搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-92）；恒溫箱（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C）；切片刀（德國萊卡公司，型號：M199）；包埋機(jī)（常州中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-A）；精密pH 計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號：E-201-C）；普通冰箱（合肥榮事達(dá)電子電器集團(tuán)有限公司，型號：BCD-245F）；光學(xué)顯微鏡（廈門Motic 電氣股份有限公司，型號：BA210T）；臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C）；旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B）；磁力攪拌器（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號：JB-13）；電子天平（美國雙杰（兄弟）集團(tuán)有限公司，型號：JJ224BC）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）。

1.2 研究方法

1.2.1 建立PC3 細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型 先采用Matrigel 和無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基按照1∶1 比例混勻制備成瘤基質(zhì)，再用成瘤基質(zhì)將經(jīng)過復(fù)蘇、培養(yǎng)、 消化的PC3 細(xì)胞調(diào)制至1×107/mL 的單細(xì)胞懸液。所有動物術(shù)前12 h 禁食不禁飲，用乙醚麻醉裸鼠后用75%乙醇對腋下進(jìn)行消毒，在消毒部位注射0.1 mL PC3 單細(xì)胞懸液，并用無菌紗布輕輕按揉該部位。接種完畢后各組裸鼠自由飲食，每日觀察成瘤情況。 1周后部分裸鼠腋下可觸及粟粒大小的皮下移植瘤，3周后可見直徑約8 mm 的瘤體，提示造模成功。

1.2.2 荷瘤裸鼠的分組及給藥 從造模成功的荷瘤裸鼠中選取60 只瘤體大小較為一致的隨機(jī)平均分為6 組，即模型對照組、陽性藥物組、益腎通癃顆粒低/中/高劑量組和聯(lián)合用藥組，予以相應(yīng)的藥物干預(yù)，每次0.2 mL，每天1 次，連續(xù)4 周。 小鼠給藥的臨床等效劑量是根據(jù)人和小鼠體表面積比值進(jìn)行換算的。體表面積折算的等效劑量比率為人（70.0 kg）：小鼠（20 g）=384.20∶1。 人的益腎通癃顆粒給藥劑量為生藥80 g/d，故小鼠的等效給藥劑量為0.22 g/d，即為中劑量。 具體干預(yù)措施詳見表1。

表1 各組給藥情況一覽表

每天動態(tài)觀察各組裸鼠生命體征及食飲情況。給藥結(jié)束后，所有動物禁食不禁飲24 h，用10%水合氯醛溶液麻醉裸鼠并固定在鼠板上，從股靜脈處抽取血液標(biāo)本，靜置2 h 后3 000 r/min 速度離心10 min，-80 ℃冰箱保存。仔細(xì)分離并取出瘤體后，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 HE 染色法觀察各組腫瘤組織的病理變化 60 ℃烤片12 h。先將切片置于二甲苯中15 min，3 次。然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇中，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min。 蘇木精染1～5 min，蒸餾水沖洗，PBS 返藍(lán)。伊紅染1 s，蒸餾水沖洗。梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級5 min。 取出后置于二甲苯10 min，2 次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在各組腫瘤組織中的表達(dá)情況 60 ℃烤片12 h，切片脫蠟至水，熱修復(fù)抗原，孵育一抗（PCNA），孵育二抗，最后進(jìn)行DAB 顯色：滴加預(yù)制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌；蘇木精復(fù)染5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS 返藍(lán)；各級乙醇（60%～100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2 次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.2.5 原位末端標(biāo)記法檢測各組腫瘤組織的細(xì)胞凋亡情況 石蠟切片先依次經(jīng)過脫蠟、烘片、再脫蠟、水合、漂洗、封閉等處理，樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50 μL TdT 酶反應(yīng)液，37 ℃避光反應(yīng)60 min；每個樣本上滴加50 μL Streptavidin-HRP 標(biāo)記工作液，37 ℃避光反應(yīng)30 min；每個樣本上滴加50 μL DAB 工作液，室溫顯色反應(yīng)30 s～5 min；顯色后的樣本片浸入1×PBS 漂洗3 次，每次5 min；將樣本上滴加蘇木精染液，染色30 s～5 min，蒸餾水沖洗干凈后浸入1%鹽酸甲醇溶液中分化5 s，立即用蒸餾水沖洗干凈。 分別用70%、85%、95%、無水乙醇浸洗5 min。 用二甲苯浸2 次，每次10 min。 晾干后加中性樹膠和蓋玻片，光鏡下觀察拍照。

1.2.6 Western blot 檢測Wnt 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 剪取組織，用冰預(yù)冷，PBS 漂洗，加入RIPA 裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊，離心提取細(xì)胞總蛋白。 配制分離膠和濃縮膠，取200 μL 蛋白上清，加入50 μL 5×loading buffer 混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷進(jìn)行樣品準(zhǔn)備。再依次經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育及二抗孵育等步驟，最后進(jìn)行ECL 顯色曝光測定Wnt1、Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、APC蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7 免疫組織化學(xué)法檢測Wnt 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 實驗方法步驟與“1.2.4”類似，所有樣品先60 ℃烤片12 h， 再將切片依次置于二甲苯，100%、95%、85%、75%乙醇，蒸餾水中放置脫蠟至水。將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）中加熱、煮沸、冷卻、洗滌以修復(fù)抗原，加入1%高碘酸以滅活內(nèi)源性酶。 滴加適當(dāng)稀釋的一抗進(jìn)行孵育，4 ℃過夜，PBS 沖洗5 min×3 次。 滴加50～100 μL 兔抗小鼠IgG 抗體-HRP 多聚體，37 ℃孵育二抗30 min，PBS 沖洗5 min×3 次。 最后進(jìn)行DAB 顯色，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采取SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料滿足獨(dú)立性、正態(tài)性及方差齊性時，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），滿足正態(tài)性和方差齊性的多重比較采用LSD 法和Dunnett 法；資料不滿足正態(tài)性和方差齊性時，采用秩和檢驗，多重比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗。 P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤組織的病理變化

各組荷瘤裸鼠皮下移植瘤瘤體組織HE 切片均可見大量的PC3 細(xì)胞。 模型對照組腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，大小不一，排列紊亂，細(xì)胞核增大，核染色深，核分裂象，核仁數(shù)量多。陽性藥物組，益腎通癃顆粒低、中、高劑量組和聯(lián)合用藥組均可見程度不一的腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，部分呈空泡樣壞死，細(xì)胞核變形及破碎，部分細(xì)胞核發(fā)生裂解，其中聯(lián)合用藥組的病理變化最為明顯。 詳見圖1。

圖1 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的病理變化（HE，×400）

2.2 各組腫瘤組織細(xì)胞增殖情況比較

與模型對照組比較，其余5 組荷瘤裸鼠腫瘤組織的增殖指數(shù)均降低（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，益腎通癃顆粒低、中、高劑量組的增殖指數(shù)高于陽性藥物組（P＜0.01），而聯(lián)合用藥組的增殖指數(shù)低于陽性藥物組（P＜0.01）；隨著益腎通癃顆粒給藥劑量的逐漸增高，瘤體組織的增殖指數(shù)也隨之逐漸下降（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見表2 及圖2。

圖2 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的細(xì)胞增殖情況（×400）

表2 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的增殖指數(shù)（±s，n=10）

表2 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的增殖指數(shù)（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，##P＜0.01；與益腎通癃顆粒低劑量組比較，△△P＜0.01；與益腎通癃顆粒中劑量組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與益腎通癃顆粒高劑量組比較，□□P＜0.01。

組別模型對照組陽性藥物組益腎通癃顆粒低劑量組益腎通癃顆粒中劑量組益腎通癃顆粒高劑量組聯(lián)合用藥組F 值P 值增殖指數(shù)0.853 3±0.040 3 0.206 7±0.045 5**0.611 7±0.075 7**##0.426 7±0.041 8**##△△0.360 0±0.046 5**##△△○0.096 7±0.039 3**##△△○○□□182.867 0.000

2.3 各組腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況比較

與模型對照組相比，其他組細(xì)胞凋亡指數(shù)均升高（P＜0.01）；益腎通癃顆粒低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡指數(shù)低于陽性藥物組（P＜0.01），聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡指數(shù)高于陽性藥物組（P＜0.01）；益腎通癃顆粒各組隨著給藥劑量的逐漸加大，細(xì)胞凋亡的發(fā)生率也顯著增高（P＜0.01），劑量和藥效呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。詳見表3 及圖3。

圖3 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的細(xì)胞凋亡情況（×400）

表3 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的凋亡指數(shù)（±s，n=10）

表3 各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的凋亡指數(shù)（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，**P<0.01；與陽性藥物組比較，##P<0.01；與益腎通癃顆粒低劑量組比較，△△P<0.01； 與益腎通癃顆粒中劑量組比較，○○P<0.01；與益腎通癃顆粒高劑量組比較，□□P<0.01。

組別模型對照組陽性藥物組益腎通癃顆粒低劑量組益腎通癃顆粒中劑量組益腎通癃顆粒高劑量組聯(lián)合用藥組F 值P 值凋亡指數(shù)0.148 3±0.044 5 0.601 7±0.063 4**0.298 3±0.028 6**##0.370 0±0.030 3**##△△0.468 3±0.041 7**##△△○○0.801 7±0.047 1**##△△○○□□164.783 0.000

2.4 Western blot 檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況

與模型對照組相比，給藥5 組荷瘤裸鼠瘤體組織的Wnt1、Wnt3a、β-catenin、APC、p-GSK-3β 蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.01），其中GSK-3β 蛋白的表達(dá)水平升高（P＜0.01）；益腎通癃顆粒的藥效不及陽性藥物ICG-001（P＜0.05，P＜0.01）；但其與ICG-001聯(lián)合用藥時可發(fā)揮協(xié)同增效的作用，對Wnt 信號通路的阻斷作用效果優(yōu)于陽性藥物組（P＜0.01）。 詳見表4及圖4。

圖4 Western blot 檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況

表4 Western blot 檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)水平（±s，n=10）

表4 Western blot 檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)水平（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，**P<0.01；與陽性藥物組比較，#P<0.05，##P<0.01；與益腎通癃顆粒低劑量組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與益腎通癃顆粒中劑量組比較，○○P<0.01；與益腎通癃顆粒高劑量組比較，□□P<0.01。

組別模型對照組陽性藥物組益腎通癃顆粒低劑量組益腎通癃顆粒中劑量組益腎通癃顆粒高劑量組聯(lián)合用藥組F 值P 值Wnt1 0.420 0±0.035 8 0.145 0±0.024 3**0.295 0±0.025 1**##0.263 3±0.048 9**##0.191 7±0.014 7**#△△○○0.101 7±.0232**#△△○○□□84.735 0.000 Wnt3a 0.415 0±0.027 4 0.231 7±0.031 9**0.315 0±0.028 8**##0.263 3±0.043 2**△0.233 3±0.040 3**△△0.148 3±0.027 9**##△△○○□□42.656 0.000 β-catenin 0.513 3±0.046 8 0.163 3±0.031 4**0.440 0±0.031 6**##0.305 0±0.055 8**##△△0.240 0±0.040 5**##△△○○0.075 0±0.024 3**##△△○○□□103.966 0.000組別模型對照組陽性藥物組益腎通癃顆粒低劑量組益腎通癃顆粒中劑量組益腎通癃顆粒高劑量組聯(lián)合用藥組F 值P 值GSK-3β 0.100 0±0.031 6 0.273 3±0.049 7**0.416 7±0.028 8**##0.435 0±0.024 3**##0.473 3±0.108 0**##0.615 0±0.068 9**##△△○○□□53.374 0.000 p-GSK-3β 0.383 3±0.021 6 0.170 0±0.026 1**0.308 3±0.035 4**##0.280 0±0.026 1**##0.261 7±0.039 2**##△△0.076 7±0.019 7**##△△○○□□84.264 0.000 APC 0.536 7±0.056 8 0.186 7±0.031 4**0.346 7±0.039 8**##0.261 7±0.030 6**##△△0.196 7±0.028 8**△△○○0.080 0±0.016 7**##△△○○□□115.167 0.000

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

與模型對照組相比，給藥5 組荷瘤裸鼠瘤體組織的Wnt1、Wnt3a、β-catenin、APC、p-GSK-3β 蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.01），其中GSK-3β 蛋白的表達(dá)水平升高（P＜0.01）；聯(lián)合用藥組對Wnt 信號通路的阻斷作用優(yōu)于陽性藥物組（P＜0.01）；益腎通癃顆粒各劑量組對Wnt 信號通路的阻斷效果弱于陽性藥物組（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見表5 及圖5。

圖5 免疫組化法檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況（×400）

表5 免疫組化法檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（±s，n=10）

表5 免疫組化法檢測各組腫瘤組織Wnt 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（±s，n=10）

注：與模型對照組比較，**P<0.01；與陽性藥物組比較，#P<0.05，##P<0.01；與益腎通癃顆粒低劑量組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與益腎通癃顆粒中劑量組比較，○○P<0.01；與益腎通癃顆粒高劑量組比較，□P<0.05，□□P<0.01。

組別模型對照組陽性藥物組益腎通癃顆粒低劑量組益腎通癃顆粒中劑量組益腎通癃顆粒高劑量組聯(lián)合用藥組F 值P 值組別Wnt1 0.639 7±0.041 3 0.273 2±0.018 8**0.524 5±0.042 3**##0.396 3±0.042 1**##△△0.314 5±0.032 2**#△△○○0.224 3±0.014 4**#△△○○□□133.220 0.000 Wnt3a 0.800 8±0.047 3 0.318 7±0.014 7**0.595 7±0.053 4**##0.542 2±0.029 0**##△0.373 7±0.051 2**#△△○○0.291 0±0.017 9**△△○○□□152.919 0.000 β-catenin 0.733 5±0.040 9 0.393 3±0.053 1**0.628 7±0.023 5**##0.570 7±0.019 8**##△0.481 0±0.062 3**##△△○○0.355 2±0.024 2**△△○○□□75.917 0.000模型對照組陽性藥物組益腎通癃顆粒低劑量組益腎通癃顆粒中劑量組益腎通癃顆粒高劑量組聯(lián)合用藥組F 值P 值GSK-3β 0.218 8±0.033 9 0.609 8±0.071 3**0.307 5±0.031 1**##0.370 8±0.026 0**##△0.460 5±0.042 5**##△△○○0.813 2±0.042 8**##△△○○□□147.785 0.000 p-GSK-3β 0.831 2±0.018 6 0.415 5±0.021 3**0.748 2±0.028 0**##0.550 3±0.030 3**##△△0.497 0±0.039 9**##△△○○0.351 8±0.025 5**##△△○○□□268.425 0.000 APC 0.814 0±0.089 9 0.323 5±0.031 2**0.575 3±0.086 4**##0.429 2±0.057 4**#△△0.348 0±0.085 8**△△0.253 8±0.034 4**△△○○□54.156 0.000

3 討論

目前，PCa 的發(fā)病原因和機(jī)制還沒有被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)完全解釋清楚[11]，現(xiàn)在可以確認(rèn)的是一些危險因素，比如年齡、人種、遺傳、飲食、激素、地理環(huán)境等等。 目前得到普遍認(rèn)可的PCa 發(fā)病機(jī)制主要與PCa細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等生物學(xué)過程異常有關(guān)[12-13]。而在這些腫瘤發(fā)生相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程中，信號通路的調(diào)控作用有著無可比擬的重要性[14-15]。 新近研究發(fā)現(xiàn)，Wnt、PI3K/AKT、NF-κB、TGF-β/Smads、Notch、JAK/STAT 等信號通路在PCa 的發(fā)病中扮演了重要角色。 Wnt 是一種廣泛存在于無脊索動物和脊索動物之中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫等生物學(xué)過程的基因，其在多種細(xì)胞活性、細(xì)胞更新、調(diào)節(jié)生物發(fā)育過程及維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[16-17]。β-catenin 是20 世紀(jì)80 年代后期被人類發(fā)現(xiàn)的一種進(jìn)化守恒分子，是一種由CTNNB1基因編碼，在介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和相關(guān)信號傳導(dǎo)、內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，也是Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵核效應(yīng)分子[18]。 Wnt/β-catenin信號通路參與了維持上皮細(xì)胞表型、細(xì)胞生長分化等過程[19-20]，在胚胎生長發(fā)育、器官纖維化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中具有關(guān)鍵意義。 在PCa 的模型中，Wnt/β-catenin 信號通路的表達(dá)被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和EMT 過程[21]。 因此，對它積極開展相關(guān)研究，可以幫助尋找最佳的PCa 治療靶點(diǎn)。

國家級名老中醫(yī)陳其華教授認(rèn)為，前列腺相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的“精室”“男子胞”，為奇恒之腑，其形似腑，功同臟，執(zhí)行藏精和排精兩大功能，隸屬于中醫(yī)的腎系統(tǒng)。精室為病，應(yīng)多從腎論治。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，可將PCa 歸為“癥瘕”“積聚”“精室?guī)r”等范疇。所謂癥瘕，或言積聚，是指因正氣虧虛，臟腑失和，氣滯、血瘀、痰濁蘊(yùn)結(jié)于腹中，形成結(jié)塊，或脹或痛為主要臨床特征的病證。 正如《靈樞·百病始生》載：“積之始生，得寒乃生。 ”《難經(jīng)·五臟積病》云：“積者，陰氣也。 ”《活法機(jī)要·正虛與積聚》則道：“壯人無積，虛人則有之，脾胃怯弱，氣血兩衰，四時有感，皆能成積。 ”《景岳全書·雜證謨》有云：“凡汁沫凝聚，旋成癥塊者，皆積之類，其病多在血分，血有形而靜也。 ”PCa 的發(fā)病應(yīng)緊緊抓住兩個字， 一個是“虛”，所謂“虛損生積”；一個是“瘀”，所謂“血瘀致癥”。 “腎虛血瘀”是對PCa 癥積本質(zhì)和病機(jī)的高度概括[22]。 故在治療上當(dāng)以補(bǔ)腎益氣、化瘀散結(jié)，并由此確定了補(bǔ)腎活血法治療PCa 的基本方藥——益腎通癃湯。 方用熟地黃、黃芪為君，熟地黃味甘，性微溫，歸肝、腎經(jīng)，功可滋補(bǔ)肝腎、益精填髓；黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，功可益氣健脾、利水行滯。補(bǔ)骨脂味苦、辛，性溫，歸腎、脾經(jīng)，功能補(bǔ)腎助陽、縮尿固精，增君藥溫補(bǔ)之能，強(qiáng)君藥化氣之效，故為臣藥。莪術(shù)味辛、苦，性溫，三棱味辛、苦，性平，同歸肝、脾二經(jīng)，均行破血消癥、行氣止痛之效，莪術(shù)、三棱常相須為用，助君臣藥行活血祛瘀、消癥化積之能，共為佐藥。五藥相合，共育補(bǔ)腎益氣、化瘀散結(jié)之功效，切中PCa“腎虛血瘀”之病機(jī)，已在我院臨床應(yīng)用多年，療效較好。

前期本研究團(tuán)隊通過模塊化聚類處理、關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 分析和KEGG 分析，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)，構(gòu)建了益腎通癃湯的有效成分、藥物靶點(diǎn)基因與PCa 疾病靶點(diǎn)的映射網(wǎng)絡(luò)，篩選預(yù)測出的可能靶點(diǎn)涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，抑制血管新生，降低氧化應(yīng)激，細(xì)胞外基質(zhì)降解，生長因子信號傳導(dǎo)，AR 調(diào)節(jié)，阻礙EMT 進(jìn)程等，尤其集中在調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡方面[23]。 Wnt/β-catenin 信號通路在PCa 發(fā)病中占有重要地位，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)異常行為關(guān)系密切，很有可能是益腎通癃湯干預(yù)PCa 的潛在靶點(diǎn)。 結(jié)果顯示，益腎通癃超微顆?？梢杂行Ц纳迫饲傲邢侔┕寝D(zhuǎn)移細(xì)胞PC3 荷瘤裸鼠皮下移植瘤瘤體組織的病理改變，給藥5 組可見程度不一的腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，部分呈空泡樣壞死，細(xì)胞核變形及破碎，部分細(xì)胞核發(fā)生裂解，其中聯(lián)合用藥組的病理變化最為明顯。 益腎通癃顆粒還可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且藥效呈濃度依賴性。 Western blot 及免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益腎通癃顆粒可以下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因Wnt1、Wnt3a、β-catenin、APC 蛋白的表達(dá)，上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)基因GSK-3β 蛋白的表達(dá)，降低p-GSK-3β 蛋白的活性，且藥效與劑量呈正相關(guān)性。在抑制Wnt 信號通路激活方面，益腎通癃顆粒的藥效不及其阻斷劑ICG-001，中西藥聯(lián)用組的療效最佳。 結(jié)果說明，益腎通癃顆粒干預(yù)PCa 的作用很可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)的，但中醫(yī)藥的干預(yù)作用往往是一個多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多層次的過程，其藥效機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。