左歸降糖清肝方對糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α 和DNMT3A 表達(dá)的影響

彭 泉，鐘雁城，楊霄旭，成細(xì)華*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 4102081；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，吉林 長春 130500

近年來2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes, T2DM）發(fā)病率呈遞增趨勢，2019 年全球有4.63 億糖尿病患者，中國達(dá)1.3 億人[1]。 有75%的T2DM 患者并發(fā)非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, NAFLD），其進(jìn)一步可向肝炎、肝纖維化及肝癌等肝病發(fā)展[1]。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 共激活因子（peroxisomeproliferative activated receptor-γ activation of auxiliary factor1Alpha, PGC-1α)信號通路失調(diào)是2 型糖尿病性脂肪肝發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制[2]，而PGC-1α 信號失常與其DNA 甲基化異常密切相關(guān)，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能恢復(fù)PGC-1α 信號[3]。 因此，抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase, DNMT）表達(dá)，能進(jìn)一步影響PGC-1α 及其信號通路，改善糖尿病性脂肪肝。

糖尿病性脂肪肝具有本虛（脾肝腎虧虛、氣陰兩虛）標(biāo)實（毒、瘀蘊(yùn)積）的病機(jī)特點，據(jù)滋陰益氣、清熱利濕、化痰消瘀組方的左歸降糖清肝方，能改善糖尿病性脂肪肝高糖脂及肝損傷[4-5]，然而其機(jī)制需深入研究。 本研究選用具有遺傳變異的轉(zhuǎn)基因2 型糖尿病MKR 鼠，加上高脂飼料喂養(yǎng)，模擬臨床人類糖尿病性脂肪肝發(fā)生，建立糖尿病性脂肪肝動物模型[6]，經(jīng)左歸降糖清肝方干預(yù)治療后，檢測肝臟PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A 表達(dá)，從分子水平探討該復(fù)方是否調(diào)節(jié)PGC-1α 及其信號通路相關(guān)基因表達(dá)，緩解糖尿病性脂肪肝發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 動物

24 只MKR 鼠（采用組織特異過度表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生），由美國國立衛(wèi)生研究院提供純合子MKR鼠[6]，經(jīng)自然交配后繁殖的后代用于實驗研究。小鼠在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物中心飼養(yǎng)。倫理審核編號：XMBH-202203030004。飼養(yǎng)籠具、墊料、飲水的制備與消毒均符合SPF 級實驗動物飼養(yǎng)要求。

1.2 藥物和試劑

左歸降糖清肝方由黃芪18 g、山藥12 g、熟地黃12 g、黃連6 g、丹參9 g、茵陳15 g、虎杖12 g、郁金9 g、陳皮9 g 組成，均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)杏林藥號。 制劑方法如下：加水先浸泡30 min，再按照W/V=1/8 量加水，將藥材及水加入煎藥機(jī)中煎煮至沸騰，15 min 后取濾液，兩次煎藥所得濾液混合，過濾濃縮至生藥2.4 g·mL-1，4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

甘油三酯（triglyceride, TG）、游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A110-1-1、A042-1-1）；動物組織總RNA提取試劑盒（批號：B511311-0025）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：B600020-0200）、Taq PCR 預(yù)混液（批號：B110006）、PCR 引物均購自生工物工程（上海）股份有限公司；多克隆一抗：β-肌動蛋白（β-actin）（京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-8770R）；PGC-1α、DNMT3A、超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-7535R，bs-23029R、PV-0023）。

1.3 主要儀器

怡成超越JPS 型血糖測試儀；日本日立7150 全自動生化分析儀；BeckmanAllerga 25R 高速冷凍離心機(jī)；德國艾本德公司Realplex2 型熒光定量PCR儀；日本尼康公司DS-U3 型成像系統(tǒng)。

1.4 實驗分組

24 只MKR 鼠，8 周時根據(jù)性別、體質(zhì)量，隨機(jī)分為對照組、高脂模型組和左歸降糖清肝方（中藥方）組，每組8 只。 高脂模型組和中藥方組小鼠均以高脂飼料（高脂飼料為動物基礎(chǔ)飼料加15%豬油、1%膽固醇）喂養(yǎng)8 周，無小鼠死亡，形成糖尿病性脂肪肝；造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥11.1 mmol/L，小鼠肝細(xì)胞以彌漫性小泡性脂變?yōu)橹?，脂肪性變肝?xì)胞達(dá)到70%以上，符合T2DM 合并NAFLD 的病變特點[4]。對照組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。 試驗中無小鼠死亡。 高脂飼料喂養(yǎng)4 周后，中藥方組以左歸降糖清肝方生藥29.64 g·kg-1灌胃[4-5]（中藥藥物劑量依據(jù)臨床用藥劑量，按人與動物體表面積計算法換算），對照組和高脂模型組以等體積蒸餾水灌胃，0.5 mL/20 g，每天1次，連續(xù)給藥4 周。隔夜禁食不禁水12 h，小鼠稱重后，取小鼠肝臟，稱取肝臟濕重，計算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

1.5 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

取小鼠肝臟最大葉距邊緣5 mm 處肝組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片，HE 染色后光鏡觀察，拍照。

1.6 肝臟TG 和FFA 的測定

取新鮮肝臟組織，用9 g/L 的生理鹽水4 ℃制備10%的肝勻漿，3 000 r/min 離心15 min，取上清。 嚴(yán)格按照試劑盒要求測定TG 和FFA 含量；TG用單試劑GPO-PAP 法，酶標(biāo)儀檢測；FFA 用比色法檢測（FFA 與銅離子結(jié)合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比）。

1.7 qRT-PCR 檢測小鼠肝組織PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A 的mRNA 表達(dá)

取各組小鼠新鮮肝臟組織，用動物組織總RNA提取試劑盒抽提取總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度。取1 μg 總RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以O(shè)ligo(dT)為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 PCR 引物見表1。取cDNA，用Bio-Rad CFX Maestrol 1.0 Real-Time系統(tǒng)對目的基因進(jìn)行熒光定量檢測。 PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，30 s，1 個循環(huán)。 PCR 反應(yīng)95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，30 s；40 個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達(dá)量[7]。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物

1.8 Western blot 檢測PGC-1α 和DNMT3A 的蛋白表達(dá)

將肝組織中加入RIPA（細(xì)胞裂解液）和PMSF（蛋白酶抑制劑），冰上裂解細(xì)胞30 min 后，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，收集上清，BCA 法測定蛋白濃度。 用10%～12%SDS 聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，蛋白分離后在冷卻的含20%甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液中電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。 轉(zhuǎn)移后迅速置于TBS 液中，隨后在室溫下含5%脫脂奶粉的TBST 中封閉1 h，洗滌后用相應(yīng)的一抗按1∶1 000 的比例稀釋后4 ℃孵育過夜，脫色搖床洗膜3 次（15 min/次），用HRP耦聯(lián)的山羊抗鼠，兔IgG 室溫孵育2 h，洗滌后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）顯影，使用軟件分析條帶灰度值分析[7]。

1.9 免疫組織化學(xué)檢測PGC-1α 的蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。 不著色為陰性。PBS 取代一抗作陰性對照，已知陽性組織作陽性對照。 以細(xì)胞內(nèi)有明顯的棕黃色信號顆?；蛐盘柊邽殛栃訹6]。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“±s”表示，多組間比較服從正態(tài)分布，采用單因素方差分析，組間方差齊時采用LSD 檢驗，方差不齊，采用GamesHowell(A)檢驗；不服從正態(tài)分布資料，采用秩和檢驗。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝臟病理形態(tài)的影響

光鏡下可見，對照組MKR 鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞規(guī)則排列，肝細(xì)胞大小正常，胞核位于細(xì)胞中央；高脂模型組MKR 鼠肝細(xì)胞則以彌漫性小泡性脂變?yōu)橹?；中藥方組MKR 鼠肝組織脂肪性變程度明顯改善。 詳見圖1。

圖1 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）

2.2 左歸降糖清肝方對小鼠血糖及肝指數(shù)的影響

與對照組比較，高脂模型組血糖、體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 與高脂模型組比較，中藥方組小鼠除體質(zhì)量外，血糖、肝質(zhì)量和肝指數(shù)均有改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。詳見表2。

表2 左歸降糖清肝方對小鼠血糖及肝指數(shù)的影響（±s，n=8）

表2 左歸降糖清肝方對小鼠血糖及肝指數(shù)的影響（±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高脂模型組比較，△△P＜0.01。

組別對照組高脂模型組中藥方組血糖8.32±0.53 12.21±0.46**8.78±0.49△△體質(zhì)量/g 21.350±2.14 25.21±3.38**24.14±1.82肝質(zhì)量/g 1.098±0.104 2.231±0.143**1.564±0.073△△肝指數(shù)/（×10-2）5.143±0.034 8.849±0.101**6.488±0.058△△

2.3 左歸降糖清肝方對小鼠肝臟TG 和FAA 的影響

與對照組比較，高脂模型組和中藥方組肝臟TG和FAA 含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與高脂模型組比較，中藥方組TG 和FAA 含量均有下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 詳見表3。

表3 左歸降糖清肝方對小鼠肝臟TG 和FAA 含量的影響（±s，n=8，μmol/g）

表3 左歸降糖清肝方對小鼠肝臟TG 和FAA 含量的影響（±s，n=8，μmol/g）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與高脂模型組比較，△△P＜0.01。

組別對照組高脂模型組中藥方組TG 25.69±2.38 51.12±5.48**35.54±3.21△△FAA 31.64±2.41 96.46±7.87**56.89±5.21△△

2.4 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細(xì)胞PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A mRNA 表達(dá)的影響

與對照組比較，高脂模型組PGC-1α、NRF1 和TFAM mRNA 表達(dá)下調(diào)，而DNMT3A mRNA 表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 與高脂模型組比較，中藥方組能上調(diào)PGC-1α、NRF1 和TFAM mRNA表達(dá)，下調(diào)DNMT3A mRNA 表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 詳見表4。

表4 各組小鼠PGC-1α、NRF1、TFAM 和DNMT3A mRNA表達(dá)比較（±s，n=6）

表4 各組小鼠PGC-1α、NRF1、TFAM 和DNMT3A mRNA表達(dá)比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與高脂模型組比較，△△P＜0.01。

組別對照組高脂模型組中藥方組PGC-1α 0.812±0.042 0.498±0.032**0.687±0.041△△NRF1 1.232±0.093 0.627±0.053**0.844±0.035△△TFAM 0.985±0.084 0.513±0.034**0.796±0.053△△DNMT3A 0.385±0.023 0.744±0.045**0.582±0.028△△

2.5 Western blot 檢測左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細(xì)胞PGC-1α 和DNMT3A 蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，高脂模型組和中藥方組PGC-1α蛋白表達(dá)下調(diào)，而DNMT3A 蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與高脂模型組比較，中藥方組能上調(diào)高脂飲食MKR 鼠PGC-1α 蛋白表達(dá)，下調(diào)DNMT3A 表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。詳見圖2。

圖2 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細(xì)胞PGC-1α 和DNMT3A 蛋白表達(dá)的影響（n=3）

2.6 免疫組織化學(xué)檢測左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細(xì)胞PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)顯示，PGC-1α 蛋白分布在胞漿，染色后成棕褐色，在MKR 鼠肝細(xì)胞中PGC-1α 含量高，高脂飲食MKR 鼠肝細(xì)胞中明顯減少，左歸降糖清肝方能增加PGC-1α 蛋白表達(dá)。 詳見圖3。

圖3 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細(xì)胞PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)，×400）

3 討論

TM2D 中NAFLD 的發(fā)生率持續(xù)增加，正成為主要的健康負(fù)擔(dān)，但目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)的治療方案[8-9]。 中醫(yī)藥在防治糖尿病性脂肪肝中凸顯優(yōu)勢[4-5,10-11]。糖尿病性脂肪肝，據(jù)其臨床特點，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“消渴”“脅痛”“積聚”等范疇，其主要病因為飲食不節(jié)、起居無常、不知持滿、不時御神、情志失調(diào)、久病體虛。 據(jù)滋陰益氣、清熱利濕、化痰消瘀組方的左歸降糖清肝方，能減輕高脂飲食加劇的MKR 鼠的胰島抵抗，降低血糖、ALT、AST 和血脂水平[4-5,11]。

在骨骼肌、肝臟、褐色脂肪組織和心臟的脂質(zhì)代謝中，PGC-1α 促進(jìn)NRF1 表達(dá)，NRF1 隨后上調(diào)TFAM，進(jìn)而刺激線粒體DNA(mtDNA)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，促進(jìn)線粒體生物合成，從而調(diào)控氧化磷酸化相關(guān)酶的表達(dá)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[12-13]。 此外PGC-1α 具有直接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)錄因子[如過氧化物酶體增殖劑激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c, SREBP-1c）等的效應(yīng)，促進(jìn)了線粒體脂肪酸β 氧化，抑制脂肪酸合成，參與脂質(zhì)代謝[14-15]。 肝臟、骨骼肌等器官PGC-1α 表達(dá)異常，線粒體功能紊亂和脂肪酸β 氧化不完全是2 型糖尿病性脂肪肝發(fā)生的主要機(jī)制[3]。 本實驗中，高脂飲食MKR 鼠肝臟PGC-1α、NRF1 和TFAM的mRNA 表達(dá)顯著下降（P<0.01），PGC-1α蛋白表達(dá)也顯著下降（P<0.01），與本研究團(tuán)隊前期研究高脂飲食MKR 鼠PGC-1α 調(diào)控的SREBP-1c 表達(dá)水平顯著增加的結(jié)果是一致的[16]，表明高脂飲食MKR 鼠肝臟中PGC-1α 下調(diào)，出現(xiàn)線粒體功能低下，脂肪酸β-氧化下降，脂肪酸合成增加，脂質(zhì)在肝臟內(nèi)不斷積累成脂肪肝；左歸降糖清肝方能上調(diào)糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α 表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)PGC-1α 信號通路，降低肝臟脂質(zhì)堆積。

DNA 甲基化與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[3,17-18]，缺乏膽堿和葉酸飲食的A/J 和WSB/EiJ小鼠，肝臟DNMT1 和DNMT3A 上調(diào)，高甲基化改變與肝脂質(zhì)堆積及損傷顯著相關(guān)[19]；在神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FAs 誘導(dǎo)了PGC-1α 啟動子高甲基化，導(dǎo)致PGC-1α 表達(dá)減少[20]。 本實驗中，高脂飲食MKR 鼠肝臟DNMT3A 表達(dá)顯著增加，與PGC-1α 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究團(tuán)隊推測，可能PGC-1α 存在DNA 甲基化異常，抑制了PGC-1α 表達(dá)。左歸降糖清肝方干預(yù)治療后，高脂飲食MKR 鼠肝臟DNMT3A mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低，PGC-1α 則顯著上升，說明該復(fù)方可能通過下調(diào)DNMT3A 表達(dá)，減少PGC-1α 甲基化，促進(jìn)PGC-1α 表達(dá)，減少肝臟脂質(zhì)堆積。

本實驗結(jié)果初步證明，左歸降糖清肝方可調(diào)節(jié)PGC-1α 及其信號通路基因表達(dá)來減緩脂肪肝的發(fā)生，從分子水平證實了該復(fù)方能緩解糖尿病性脂肪肝的發(fā)展，對肝臟具有保護(hù)作用。 同時發(fā)現(xiàn)，該復(fù)方可以抑制高脂飲食MKR 鼠肝臟DNMT3A 基因表達(dá)，推測該復(fù)方通過下調(diào)DNMT3A 表達(dá)，減少PGC-1α DNA 甲基化，從而促進(jìn)PGC-1α 表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)，減少肝臟脂質(zhì)堆積。本研究團(tuán)隊后期將進(jìn)一步通過體外實驗，設(shè)計甲基化酶激活劑組和抑制劑組等，檢測PGC-1α 啟動子甲基化水平及PGC-1α 下游通路，深入研究左歸降糖清肝方基于DNA 甲基化修飾調(diào)控PGC-1α 通路防治糖尿病性脂肪肝的作用機(jī)制。